Combined bisulfite restriction analysis
कम्बाइंड बिसल्फाइट रिस्ट्रिक्शन एनालिसिस (या कोबरा) एक आणविक जीवविज्ञान तकनीक है जो जीनोमिक डीएनए के एक छोटे से नमूने में डीएनए अनुक्रम पर एक विशिष्ट जीनोमिक लोकस पर डीएनए मिथाइलेशन स्तरों के संवेदनशील परिमाणीकरण की अनुमति देती है। तकनीक बाइसल्फाइट अनुक्रमण की एक भिन्नता है, और प्रतिबंध पाचन के साथ बाइसल्फाइट रूपांतरण आधारित पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया को जोड़ती है। मूल रूप से सूक्ष्म विच्छेदित पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों से सूक्ष्म मात्रा में जीनोमिक डीएनए को विश्वसनीय रूप से संभालने के लिए विकसित की गई, इस तकनीक का तब से कैंसर अनुसंधान और एपिजेनेटिक्स अध्ययनों में व्यापक उपयोग देखा गया है। प्रक्रिया बिसल्फाइट उपचार रुचि के जीनोमिक डी. एन. ए. का उपचार सोडियम बिसल्फाइट के साथ किया जाता है, जो मिथाइलेशन-निर्भर अनुक्रम अंतर पेश करता है। सोडियम बाइसल्फाइट उपचार के दौरान, अनमिथाइलेटेड साइटोसिन अवशेष यूरेसिल में परिवर्तित हो जाते हैं, जबकि मिथाइलेटेड साइटोसिन अवशेष अप्रभावित होते हैं। पी. सी. आर. प्रवर्धन बिसल्फाइट उपचारित डी. एन. ए. को फिर पी. सी. आर. प्रवर्धित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मूल रूप से मिथाइलेटेड स्थितियों में साइटोसिन अवशेष और मूल रूप से अनमिथाइलेटेड स्थितियों में थाइमिन अवशेष (जिन्हें यूरेसिल में परिवर्तित किया गया था) होते हैं। इस चरण के दौरान उपयोग किए जाने वाले प्राइमर में सी. पी. जी. स्थल (साइटोसिन मिथाइलेशन का सामान्य लक्ष्य) नहीं होते हैं, इसलिए प्रवर्धन प्रक्रिया मिथाइलेशन स्थिति के आधार पर टेम्पलेटों के बीच भेदभाव नहीं करती है। अगले चरण में पूर्ण पाचन सुनिश्चित करने के लिए पी. सी. आर. उत्पादों को शुद्ध किया जाता है। प्रतिबंध पाचन उपरोक्त चरणों से मिथाइलेशन पर निर्भर प्रतिधारण या सी. पी. जी. युक्त प्रतिबंध एंजाइम साइटों का नुकसान होता है, जैसे कि टी. ए. क्यू. आई. (टी. सी. जी. ए.) और बी. एस. टी. यू. आई. (सी. जी. सी. जी.) के लिए, यह इस बात पर निर्भर करता है कि साइटोसिन अवशेष मूल रूप से मिथाइलेटेड था या नहीं। उपरोक्त चरण में मिथाइलेशन-स्वतंत्र प्रवर्धन के कारण, परिणामी पी. सी. आर. उत्पाद उन टुकड़ों की मिश्रित आबादी होंगे जिन्होंने सी. पी. जी. युक्त प्रतिबंध एंजाइम साइटों को खो दिया है या बनाए रखा है, जिनके संबंधित प्रतिशत सीधे नमूना डी. एन. ए. में डी. एन. ए. मिथाइलेशन के मूल स्तर से सहसंबद्ध होंगे। पी. सी. आर. उत्पादों को फिर एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ इलाज किया जाता है (जैसे। बी. एस. टी. यू. आई.), जो केवल उन स्थलों को अलग करेगा जो मूल रूप से मिथाइलेटेड (सी. जी. सी. जी.) थे, जबकि उन स्थलों को छोड़ देगा जो मूल रूप से अनमिथाइलेटेड (टी. जी. टी. जी.) थे। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी सी. पी. जी. स्थलों को मूल रूप से मिथाइलेटेड होने के कारण बनाए रखा जाता है, और अपूर्ण बाइसल्फाइट रूपांतरण के अवशेष नहीं, एच. एस. पी. 92. आई. जैसे एंजाइमों के साथ एक नियंत्रण पाचन किया जाता है, जो अनुक्रम सी. ए. टी. जी. को पहचानता है, जिनमें से कोई भी बाइसल्फाइट रूपांतरण के बाद शेष नहीं रहना चाहिए (गैर-सी. पी. जी. मिथाइलेशन के दुर्लभ अपवाद के साथ) और इस प्रकार कोई दरार नहीं होनी चाहिए यदि बाइसल्फाइट रूपांतरण पूरा हो गया था। परिमाणीकरण पचने वाले टुकड़ों को फिर पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जाता है, जिसमें एक बड़े अपचित टुकड़े के अनुरूप बैंड की अपेक्षित उपस्थिति होती है, और पचने वाले टुकड़ों के अनुरूप कई छोटे बैंड होते हैं। इन बैंडों में डी. एन. ए. की मात्रात्मक मात्रा को फॉस्फोइमेजर जैसे उपकरण से निर्धारित किया जा सकता है, जिसके बाद मूल नमूने के मिथाइलेशन प्रतिशत की गणना इस प्रकार की जा सकती हैः उपयोग और अनुप्रयोग सी. ओ. बी. आर. ए. का उपयोग कई शोध-आधारित अनुप्रयोगों में बड़े पैमाने पर किया गया है जैसे कि कैंसर अध्ययनों में जीन प्रवर्तकों पर डी. एन. ए. मिथाइलेशन परिवर्तनों की जांच, मुद्रित जीन पर परिवर्तित मिथाइलेशन पैटर्न का पता लगाना और स्तनधारियों में विकास के दौरान जीनोम में मिथाइलेशन पैटर्न की विशेषता। चिकित्सा में, कोबरा का उपयोग मानव रोग का निदान करने में मदद करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया गया है जिसमें असामान्य डीएनए मिथाइलेशन शामिल है। शोधकर्ताओं ने आनुवंशिक छाप विकार रसेल-सिल्वर सिंड्रोम के निदान में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी को विकृत करने के संयोजन के साथ कोबरा का उपयोग किया, जहां 50 प्रतिशत रोगियों में विकार के लिए मुद्रित जीन एच19 का हाइपोमेथाइलेशन जिम्मेदार है। ताकतें सरल, तेज और सस्तीः कोबरा में, डी. एन. ए. मिथाइलेशन स्तरों को बिना श्रमसाध्य उप-क्लोनिंग और अनुक्रमण की आवश्यकता के आसानी से और जल्दी मापा जाता है, जैसा कि बाइसल्फाइट अनुक्रमण के साथ होता है। परख सीधा है और मानक सस्ते आणविक जीवविज्ञान अभिकर्मकों के साथ किया जा सकता है। उच्च अनुकूलताः पी. सी. आर. और शुद्धिकरण चरणों के कारण, विधि न केवल बहुत कम मात्रा में जीनोमिक डी. एन. ए. के साथ काम करती है, बल्कि उन नमूनों के साथ भी काम करती है जिनका पैराफिन के साथ इलाज किया गया है, जो दोनों अन्य डी. एन. ए. मिथाइलेशन परिमाणीकरण प्रोटोकॉल जैसे कि दक्षिणी ब्लॉटिंग और मिथाइलेशन-संवेदनशील प्रतिबंध एंजाइम पाचन के बाद पी. सी. आर. में समस्याएं हो सकती हैं। मात्रात्मकः यह मिथाइलेशन-विशिष्ट पी. सी. आर. के विपरीत है, जो गुणात्मक है। सी. ओ. बी. आर. ए. के साथ, डी. एन. ए. मिथाइलेशन स्तरों को सीधे दिए गए स्थान पर निर्धारित किया जा सकता है, जिससे प्रति परख अधिक जानकारी मिलती है। उच्च-प्रवाहित नमूना प्रसंस्करण के लिए मापनीयताः कोबरा के साथ, रुचि के कई क्षेत्रों को समान प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचाये गए अलग-अलग नमूनों में समानांतर रूप से संसाधित किया जा सकता है। यह बाइसल्फाइट अनुक्रमण विश्लेषण के विपरीत है, जहां प्रत्येक क्षेत्र की प्रति स्थान कई क्लोनों को अनुक्रमित करके सख्ती से जांच करने की आवश्यकता होती है, जिसमें अधिक समय लगता है। प्रति परख कई प्रश्न मिथाइलेशन की स्थिति से एक ही पाचन परख में कई सी. पी. जी. युक्त प्रतिबंध स्थलों पर पूछताछ की जा सकती है। कमजोरियाँ परख रुचि के क्षेत्र में मौजूदा प्रतिबंध स्थलों का उपयोग करने तक सीमित है, और किसी विशिष्ट प्रतिबंध स्थल के संदर्भ में नहीं होने वाले मिथाइलेशन का परीक्षण नहीं किया जाएगा। पी. सी. आर. के बाद प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा अपूर्ण पाचन विश्लेषण को भ्रमित कर सकता हैः अपूर्ण पाचन डी. एन. ए. मिथाइलेशन की कमी का सुझाव देगा (यदि एच. पी. ए. आई. आई. जैसे मिथाइलेशन-संवेदनशील एंजाइम के साथ कटौती की जाती है)। यह भी ज्ञात है कि बी. एस. टी. यू. आई. अपरिवर्तित स्थलों पर कटौती कर सकता है, जिससे मिथाइलेशन स्तरों का अधिक आकलन होता है और इसलिए अक्सर एच. पी. ए. आई. आई. के उपयोग की आवश्यकता होती है। जटिल नमूनों में, कोशिका-प्रकार की विषमता विश्लेषण को भ्रमित कर सकती है क्योंकि डीएनए को अनुक्रमित नहीं किया जा रहा है, नमूने में विभिन्न कोशिकाओं के अनुक्रमों में विषमता (यानी। एक ट्यूमर के भीतर विभिन्न कोशिका आबादी) जिन्होंने पूछताछ किए गए क्षेत्र में उत्परिवर्तन प्राप्त किया है, जैसे कि सी. जी. डिन्यूक्लियोटाइड को सी. ए. या सी. टी. में बदलना, जिसके परिणामस्वरूप पाचन की कमी के कारण एक स्पष्ट रूप से मिथाइलेटेड क्षेत्र को जन्म देने वाले प्रतिबंध स्थल का नुकसान होगा। यह दिए गए नमूने में डी. एन. ए. मिथाइलेशन स्तरों की मात्रा को तिरछा कर देगा। विकल्प सामान्य तौर पर, कोबरा को अक्सर अन्य डी. एन. ए. मिथाइलेशन विश्लेषणों के साथ जोड़ा जाता है और अक्सर रुचि के स्थान की प्रारंभिक जांच में उपयोग किया जाता है। यदि कोबरा परिवर्तित मिथाइलेशन पैटर्न का सुझाव देता है, तो अधिक कठोर, श्रम-गहन तकनीकों को लागू किया जा सकता है, जैसे कि बाइसल्फाइट अनुक्रमण या एम. ई. डी. आई. पी। डी. एन. ए. मिथाइलेशन का पता लगाने के लिए पैकबायो अनुक्रमण का भी उपयोग किया जा सकता है। संदर्भ आणविक जीवविज्ञान तकनीकें