Transmission electron microscopy DNA sequencing
संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डीएनए अनुक्रमण एक एकल-अणु अनुक्रमण तकनीक है जो संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी तकनीकों का उपयोग करती है। इस विधि की कल्पना और विकास 1960 और 70 के दशक में किया गया था, लेकिन जब नमूने को नुकसान की सीमा की पहचान की गई तो इसने समर्थन खो दिया। डी. एन. ए. को एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी के तहत स्पष्ट रूप से देखने के लिए, इसे भारी परमाणुओं के साथ लेबल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, विशेष इमेजिंग तकनीक और विचलन सुधार प्रकाशिकी लेबल किए गए डीएनए अणु की छवि बनाने के लिए आवश्यक संकल्प प्राप्त करने के लिए फायदेमंद हैं। सिद्धांत रूप में, संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डीएनए अनुक्रमण अत्यधिक लंबी पढ़ने की लंबाई प्रदान कर सकता है, लेकिन इलेक्ट्रॉन बीम क्षति का मुद्दा अभी भी बना रह सकता है और तकनीक को अभी तक व्यावसायिक रूप से विकसित नहीं किया गया है। जेम्स वॉटसन और फ्रांसिस क्रिक द्वारा डी. एन. ए. की संरचना का अनुमान लगाने के कुछ ही वर्षों बाद, और फ्रेडरिक सेंगर द्वारा तेजी से डी. एन. ए. अनुक्रमण के लिए पहली विधि प्रकाशित करने से लगभग दो दशक पहले, एक अमेरिकी भौतिक विज्ञानी, रिचर्ड फेनमैन ने इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की कल्पना एक ऐसे उपकरण के रूप में की थी जो एक दिन जीवविज्ञानी को "डी. एन. ए. श्रृंखला में आधारों के क्रम को देखने" की अनुमति देगा। फेनमैन का मानना था कि यदि इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी को पर्याप्त शक्तिशाली बनाया जा सकता है, तो डीएनए सहित किसी भी और सभी रासायनिक यौगिकों की परमाणु संरचना की कल्पना करना संभव हो जाएगा। 1970 में, अल्बर्ट क्रेव ने एक स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी में उच्च-कोण कुंडलाकार डार्क-फील्ड इमेजिंग (एच. ए. ए. डी. एफ.) इमेजिंग तकनीक विकसित की। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, उन्होंने पतली अनाकार कार्बन फिल्मों पर अलग-अलग भारी परमाणुओं की कल्पना की। 2010 में क्रिवनेक और उनके सहयोगियों ने एच. ए. ए. डी. एफ. विधि में कई तकनीकी सुधारों की सूचना दी, जिसमें विचलन सुधार इलेक्ट्रॉन प्रकाशिकी और कम त्वरण वोल्टेज का संयोजन शामिल है। बाद वाला जैविक वस्तुओं की इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह बीम द्वारा नुकसान को कम करने और प्रकाश परमाणुओं के लिए इमेज कंट्रास्ट को बढ़ाने की अनुमति देता है। नतीजतन, बोरान नाइट्राइड मोनोलेयर में एकल परमाणु प्रतिस्थापन की छवि बनाई जा सकती है। रासायनिक और फ्लोरोसेंट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की एक भीड़ के आविष्कार के बावजूद, इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी को अभी भी एकल-अणु डीएनए अनुक्रमण करने के साधन के रूप में खोजा जा रहा है। उदाहरण के लिए, 2012 में हार्वर्ड विश्वविद्यालय, न्यू हैम्पशायर विश्वविद्यालय और जेडएस जेनेटिक्स के वैज्ञानिकों के बीच एक सहयोग ने तकनीक का उपयोग करके डीएनए के लंबे अनुक्रमों को पढ़ने की क्षमता का प्रदर्शन किया, हालांकि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डीएनए अनुक्रमण तकनीक अभी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है। सिद्धांत इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी में 100 पी. एम. तक का संकल्प प्राप्त करने की क्षमता होती है, जिससे सूक्ष्म जैव अणु और संरचना जैसे वायरस, राइबोसोम, प्रोटीन, लिपिड, छोटे अणु और यहां तक कि एकल परमाणु भी देखे जा सकते हैं। हालांकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ देखे जाने पर डी. एन. ए. दिखाई देता है, लेकिन प्राप्त छवि का रिज़ॉल्यूशन व्यक्तिगत आधारों के अनुक्रम, यानी डी. एन. ए. अनुक्रमण को समझने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त नहीं है। हालांकि, भारी परमाणुओं या धातुओं के साथ डी. एन. ए. आधारों के विभेदक लेबलिंग पर, अलग-अलग आधारों के बीच कल्पना और अंतर दोनों करना संभव है। इसलिए, विभेदक भारी परमाणु डीएनए लेबलिंग के संयोजन में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीधे डीएनए की छवि बनाने के लिए किया जा सकता है ताकि इसके अनुक्रम को निर्धारित किया जा सके। कार्यप्रवाह चरण 1-डी. एन. ए. विकृतीकरण एक मानक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पी. सी. आर.) के रूप में, दूसरे स्ट्रैंड को लेबल किए गए न्यूक्लियोटाइड्स के साथ संश्लेषित करने से पहले अनुक्रमित किए जाने वाले दोहरे फंसे हुए डी. एन. ए. अणुओं को विकृतीकृत किया जाना चाहिए। चरण 2-भारी परमाणु लेबलिंग जैविक अणुओं (सी, एच, एन, ओ, पी, एस) को बनाने वाले तत्व बहुत हल्के (कम परमाणु संख्या, जेड) होते हैं जिन्हें संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी द्वारा अलग-अलग परमाणुओं के रूप में स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, डी. एन. ए. आधारों को भारी परमाणुओं (उच्च जेड) के साथ लेबल किया जा सकता है। प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड को एक विशिष्ट भारी लेबल के साथ चिह्नित किया जाता है, ताकि उन्हें संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ में अलग किया जा सके। जेडएस जेनेटिक्स तीन भारी लेबलों का उपयोग करने का प्रस्ताव करता हैः ब्रोमिन (जेड = 35), आयोडीन (जेड = 53), और ट्राइक्लोरोमीथेन (कुल जेड = 63)। ये माइक्रोग्राफ पर अंतर काले और हल्के धब्बों के रूप में दिखाई देंगे, और चौथा डी. एन. ए. आधार बिना लेबल के रहेगा। हेलसिओन मॉलिक्यूलर, टोस्टे समूह के सहयोग से, प्रस्ताव देता है कि प्यूरिन और पाइरिमिडीन क्षारों को क्रमशः प्लैटिनम डायमाइन या ऑस्मियम टेट्राऑक्साइड बाइपाइरिडिन के साथ कार्यात्मक बनाया जा सकता है। भारी धातु परमाणु जैसे ऑस्मियम (जेड = 76), इरिडियम (जेड = 77), सोना (जेड = 79), या यूरेनियम (जेड = 92) तब अलग-अलग आधारों को लेबल करने के लिए इन कार्यात्मक समूहों के साथ धातु-धातु बंधन बना सकते हैं। चरण 3-सब्सट्रेट पर डी. एन. ए. संरेखण डी. एन. ए. अणुओं को एक पतले, ठोस सब्सट्रेट पर फैलाया जाना चाहिए ताकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ पर लेबल किए गए आधारों का क्रम स्पष्ट रूप से दिखाई दे। आणविक संयोजन एक ऐसी तकनीक है जो डी. एन. ए. अणुओं का विस्तार करने के लिए एक घटते वायु-जल इंटरफेस के बल का उपयोग करती है, जिससे वे सूखने के बाद एक सिलेन परत से अपरिवर्तनीय रूप से बंधे रहते हैं। यह एक ऐसा साधन है जिसके द्वारा ठोस सब्सट्रेट पर डी. एन. ए. का संरेखण प्राप्त किया जा सकता है। चरण 4-टी. ई. एम. इमेजिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टी. ई. एम.) एक बहुत ही पतले नमूने के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों की किरण को पारित करके उच्च आवर्धन, उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन करता है। जबकि परमाणु संकल्प को पारंपरिक टी. ई. एम. के साथ प्रदर्शित किया गया है, स्थानिक संकल्प में और सुधार के लिए सूक्ष्मदर्शी लेंसों के गोलाकार और रंगीन विचलन को सही करने की आवश्यकता होती है। यह केवल स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी में संभव हुआ है जहां छवि को एक बारीक केंद्रित इलेक्ट्रॉन बीम के साथ वस्तु को स्कैन करके प्राप्त किया जाता है, एक तरह से कैथोड किरण नली के समान। हालांकि, संकल्प में प्राप्त सुधार बहुत अधिक किरण की तीव्रता, सहवर्ती नमूना क्षति और संबंधित इमेजिंग कलाकृतियों द्वारा अध्ययन की गई वस्तु के विकिरण के साथ आता है। विभिन्न इमेजिंग तकनीकों को इस बात पर निर्भर करते हुए लागू किया जाता है कि नमूने में भारी या हल्के परमाणु होते हैंः कुंडलाकार डार्क-फील्ड इमेजिंग इलेक्ट्रॉनों के प्रकीर्णन को मापती है क्योंकि वे संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी नमूने में परमाणुओं के नाभिक को विक्षेपित करते हैं। यह भारी परमाणुओं वाले नमूनों के लिए सबसे उपयुक्त है, क्योंकि वे इलेक्ट्रॉनों के अधिक प्रकीर्णन का कारण बनते हैं। तकनीक का उपयोग बोरॉन, नाइट्रोजन और कार्बन के रूप में प्रकाश के रूप में परमाणुओं की छवि बनाने के लिए किया गया है; हालाँकि, ऐसे प्रकाश परमाणुओं के लिए संकेत बहुत कमजोर है। यदि संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डी. एन. ए. अनुक्रमण के लिए कुंडलाकार डार्क-फील्ड सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया जाता है, तो निश्चित रूप से डी. एन. ए. आधारों को भारी परमाणुओं से चिह्नित करना आवश्यक होगा ताकि एक मजबूत संकेत का पता लगाया जा सके। कुंडलाकार उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग नमूने के माध्यम से सीधे संचारित इलेक्ट्रॉनों का पता लगाती है, और परमाणु नाभिक के साथ उनकी बातचीत से उत्पन्न तरंग हस्तक्षेप को मापती है। यह तकनीक कुंडलाकार डार्क-फील्ड इमेजिंग विधियों की तुलना में अधिक संवेदनशीलता वाले प्रकाश परमाणुओं का पता लगा सकती है। वास्तव में, क्रिस्टलीय ठोस पदार्थों में ऑक्सीजन, नाइट्रोजन, लिथियम और हाइड्रोजन को कुंडलाकार उज्ज्वल-क्षेत्र इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके चित्रित किया गया है। इस प्रकार, डी. एन. ए. श्रृंखला में परमाणुओं की प्रत्यक्ष छवियों को प्राप्त करना सैद्धांतिक रूप से संभव है; हालाँकि, डी. एन. ए. की संरचना क्रिस्टलीय ठोस पदार्थों की तुलना में बहुत कम ज्यामितीय है, इसलिए पूर्व लेबलिंग के बिना प्रत्यक्ष इमेजिंग प्राप्त नहीं की जा सकती है। चरण 5-डेटा विश्लेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ पर काले और चमकीले धब्बे, भिन्न रूप से लेबल किए गए डीएनए आधारों के अनुरूप, कंप्यूटर सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किए जाते हैं। अनुप्रयोग संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डी. एन. ए. अनुक्रमण अभी तक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं है, लेकिन इस तकनीक द्वारा एक दिन प्रदान की जाने वाली लंबी पढ़ने की लंबाई इसे विभिन्न संदर्भों में उपयोगी बनाएगी। डी नोवो जीनोम असेंबली जब एक जीनोम का अनुक्रमण किया जाता है, तो इसे ऐसे टुकड़ों में विभाजित किया जाना चाहिए जो एक ही रीड में अनुक्रमित होने के लिए पर्याप्त छोटे हों। इन रीड्स को फिर रीड्स के बीच ओवरलैप होने वाले क्षेत्रों को संरेखित करके एक जिगसॉ पहेली की तरह वापस रखा जाना चाहिए; इस प्रक्रिया को डी नोवो जीनोम असेंबली कहा जाता है। एक अनुक्रमण मंच द्वारा प्रदान की जाने वाली पढ़ने की लंबाई जितनी लंबी होगी, ओवरलैपिंग क्षेत्र उतने ही लंबे होंगे और जीनोम को इकट्ठा करना उतना ही आसान होगा। कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण से, माइक्रोफ्लुइडिक सेंगर अनुक्रमण अभी भी जीनोम को अनुक्रमित करने और इकट्ठा करने का सबसे प्रभावी तरीका है जिसके लिए कोई संदर्भ जीनोम अनुक्रम मौजूद नहीं है। अपेक्षाकृत लंबी पढ़ने की लंबाई व्यक्तिगत अनुक्रमण पढ़ने के बीच पर्याप्त ओवरलैप प्रदान करती है, जो असेंबली में अधिक सांख्यिकीय विश्वास की अनुमति देती है। इसके अलावा, लंबे सेंगर रीड दोहराव वाले डीएनए अनुक्रम के अधिकांश क्षेत्रों को फैलाने में सक्षम होते हैं जो अन्यथा गलत संरेखण पैदा करके अनुक्रम असेंबली को भ्रमित करते हैं। हालांकि, सेंगर अनुक्रमण द्वारा डी नोवो जीनोम असेंबली बेहद महंगी और समय लेने वाली है। दूसरी पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियां, हालांकि कम महंगी हैं, आम तौर पर कम पढ़ने की लंबाई के कारण डी नोवो जीनोम असेंबली के लिए अनुपयुक्त हैं। सामान्य तौर पर, तीसरी पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों, जिसमें संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डीएनए अनुक्रमण शामिल है, का उद्देश्य कम अनुक्रमण लागत बनाए रखते हुए पढ़ने की लंबाई में सुधार करना है। इस प्रकार, जैसे-जैसे तीसरी पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में सुधार होगा, तेज और सस्ती डी नोवो जीनोम असेंबली एक वास्तविकता बन जाएगी। पूर्ण हैप्लोटाइप एक हैप्लोटाइप जुड़े हुए एलील की एक श्रृंखला है जो एक एकल गुणसूत्र पर एक साथ विरासत में मिलती है। डी. एन. ए. अनुक्रमण का उपयोग सभी एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (एस. एन. पी.) के जीनोटाइप के लिए किया जा सकता है जो एक हैप्लोटाइप का गठन करते हैं। हालांकि, छोटे डीएनए अनुक्रमण को अक्सर चरणबद्ध नहीं किया जा सकता है; यानी, विषमयुग्म रूपों को आत्मविश्वास से सही हैप्लोटाइप को निर्दिष्ट नहीं किया जा सकता है। वास्तव में, लघु पठित डी. एन. ए. अनुक्रमण डेटा के साथ हैप्लोटाइपिंग के लिए एस. एन. पी. की सटीक पहचान करने के लिए बहुत उच्च कवरेज (प्रत्येक डी. एन. ए. आधार के औसत> 50x कवरेज) के साथ-साथ माता-पिता से अतिरिक्त अनुक्रम डेटा की आवश्यकता होती है ताकि हैप्लोटाइप का अनुमान लगाने के लिए मेंडेलियन संचरण का उपयोग किया जा सके। संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डीएनए अनुक्रमण सहित लंबी रीड्स उत्पन्न करने वाली अनुक्रमण प्रौद्योगिकियां, एक ही रीड्स में पूरे हैप्लोब्लॉक को पकड़ सकती हैं। अर्थात्, हैप्लोटाइप को कई रीड्स के बीच विभाजित नहीं किया जाता है, और आनुवंशिक रूप से जुड़े एलील अनुक्रमण डेटा में एक साथ रहते हैं। इसलिए, लॉन्ग रीड्स हैप्लोटाइपिंग को आसान और अधिक सटीक बनाते हैं, जो जनसंख्या आनुवंशिकी के क्षेत्र के लिए फायदेमंद है। प्रतिलिपि संख्या प्रकार जीन आम तौर पर द्विगुणित मानव जीनोम में दो प्रतियों में मौजूद होते हैं; इस मानक प्रतिलिपि संख्या से विचलित होने वाले जीन को प्रतिलिपि संख्या प्रकार (सी. एन. वी.) के रूप में संदर्भित किया जाता है। प्रतिलिपि संख्या भिन्नता सौम्य हो सकती है (ये आमतौर पर सामान्य रूप होते हैं, जिन्हें प्रतिलिपि संख्या बहुरूपता कहा जाता है) या रोगजनक। सी. एन. वी. का पता फ्लोरोसेंस इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (एफ. आई. एस. एच.) या कम्पेरेटिव जीनोमिक हाइब्रिडाइजेशन (सी. जी. एच.) द्वारा लगाया जाता है। उन विशिष्ट विराम बिंदुओं का पता लगाने के लिए जिन पर एक विलोपन होता है, या एक दोहराव या प्रवर्धन घटना द्वारा शुरू किए गए जीनोमिक घावों का पता लगाने के लिए, सी. जी. एच. को एक टाइलिंग सरणी (सरणी सी. जी. एच.) का उपयोग करके किया जा सकता है, या भिन्न क्षेत्र को अनुक्रमित किया जा सकता है। लंबे अनुक्रम पढ़ने विशेष रूप से दोहराव या प्रवर्धन के विश्लेषण के लिए उपयोगी हैं, क्योंकि प्रवर्धित खंडों के अभिविन्यास का विश्लेषण करना संभव है यदि उन्हें एकल अनुक्रम पढ़ने में पकड़ा जाता है। कैंसर जीनोमिक्स, या ऑन्कोजेनोमिक्स, एक उभरता हुआ क्षेत्र है जिसमें उच्च-प्रवाह, दूसरी पीढ़ी की डी. एन. ए. अनुक्रमण तकनीक को पूरे कैंसर जीनोम को अनुक्रमित करने के लिए लागू किया जा रहा है। इस लघु पठित अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करने में लघु पठित डेटा का उपयोग करके डी नोवो जीनोम असेंबली से जुड़ी सभी समस्याएं शामिल हैं। इसके अलावा, कैंसर जीनोम अक्सर अनयूप्लोइड होते हैं। ये विचलन, जो अनिवार्य रूप से बड़े पैमाने पर प्रतिलिपि संख्या प्रकार हैं, प्रतिलिपि संख्या का अनुमान लगाने के लिए पढ़ने की आवृत्ति का उपयोग करके दूसरी पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। हालाँकि, लंबे रीड्स, कैंसर जीनोम में मौजूद प्रतिलिपि संख्या, प्रवर्धित क्षेत्रों के अभिविन्यास और एसएनपी की अधिक सटीक तस्वीर प्रदान करेंगे। माइक्रोबायोम अनुक्रमण माइक्रोबायोम एक सूक्ष्म पर्यावरण और उनके संबंधित जीनोम में मौजूद रोगाणुओं के कुल संग्रह को संदर्भित करता है। उदाहरण के लिए, अनुमानित 100 खरब सूक्ष्मजीव कोशिकाएँ किसी भी समय मानव शरीर में उपनिवेश करती हैं। मानव माइक्रोबायोम विशेष रुचि रखता है, क्योंकि ये कॉमेन्सल बैक्टीरिया मानव स्वास्थ्य और प्रतिरक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैं। पृथ्वी के अधिकांश जीवाणु जीनोम को अभी तक अनुक्रमित नहीं किया गया है; एक माइक्रोबायोम अनुक्रमण परियोजना शुरू करने के लिए व्यापक डी नोवो जीनोम असेंबली की आवश्यकता होगी, एक ऐसी संभावना जो लघु पठित डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के साथ चुनौतीपूर्ण है। लंबे रीड्स से नए माइक्रोबियल जीनोम की असेंबली में बहुत सुविधा होगी। अन्य दूसरी और तीसरी पीढ़ी की डी. एन. ए. अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की तुलना में, संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डी. एन. ए. अनुक्रमण में कई संभावित प्रमुख शक्तियां और कमजोरियां हैं, जो अंततः भविष्य की डी. एन. ए. अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के रूप में इसकी उपयोगिता और प्रमुखता को निर्धारित करेंगी। शक्ति लंबे समय तक पढ़ने की लंबाईः जेडएस जेनेटिक्स ने प्रति दिन 1.7 अरब आधार जोड़े की दर के साथ संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डीएनए अनुक्रमण की संभावित पढ़ने की लंबाई 10,000 से 20,000 आधार जोड़े होने का अनुमान लगाया है। इस तरह की लंबी पढ़ने की लंबाई अन्य अनुप्रयोगों के बीच आसान डी नोवो जीनोम असेंबली और हैप्लोटाइप का सीधा पता लगाने की अनुमति देगी। कम लागतः दूसरी पीढ़ी के अधिक महंगे डीएनए अनुक्रमण विकल्पों की तुलना में संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डीएनए अनुक्रमण की लागत प्रति मानव जीनोम केवल 5,000-10,000 अमेरिकी डॉलर होने का अनुमान है। कोई विक्षेपण नहीं-संश्लेषण के दौरान समकालिकता में कमी के कारण डी. एन. ए. तारों का विक्षेपण दूसरी पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की एक प्रमुख समस्या है। संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डी. एन. ए. अनुक्रमण और कई अन्य तीसरी पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के लिए, रीड्स का समकालिककरण अनावश्यक है क्योंकि एक समय में केवल एक अणु पढ़ा जा रहा है। छोटा टर्नअराउंड समयः डी. एन. ए. के देशी टुकड़ों को पढ़ने की क्षमता जटिल टेम्पलेट की तैयारी को पूरे जीनोम अनुक्रमण के सामान्य कार्यप्रवाह में एक अनावश्यक कदम बनाती है। नतीजतन, कम टर्नअराउंड समय संभव है। कमजोरियाँ उच्च पूंजीगत लागतः संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डी. एन. ए. अनुक्रमण के लिए आवश्यक पर्याप्त संकल्प के साथ एक संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी की लागत लगभग यू. एस. $1,000,000 है, इसलिए इस विधि द्वारा डी. एन. ए. अनुक्रमण को आगे बढ़ाने के लिए पर्याप्त निवेश की आवश्यकता है। तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्णः चयनात्मक भारी परमाणु लेबलिंग और लेबल किए गए डीएनए को एक सब्सट्रेट से जोड़ना और सीधा करना एक गंभीर तकनीकी चुनौती है। इसके अलावा, डी. एन. ए. नमूना इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी के उच्च निर्वात के लिए स्थिर होना चाहिए और उच्च-ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों के एक केंद्रित किरण द्वारा विकिरण होना चाहिए। संभावित पी. सी. आर. पूर्वाग्रह और कलाकृतियाँः हालाँकि पी. सी. आर. का उपयोग केवल संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी डी. एन. ए. अनुक्रमण में डी. एन. ए. स्ट्रैंड को भारी परमाणुओं या धातुओं के साथ लेबल करने के साधन के रूप में किया जा रहा है, एकल प्रवर्धन के दौरान टेम्पलेट प्रतिनिधित्व या त्रुटियों में पूर्वाग्रह पेश करने की संभावना हो सकती है। अन्य अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों से तुलना कई गैर-सेंगर दूसरी और तीसरी पीढ़ी की डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों को वर्तमान में थ्रूपुट बढ़ाने और लागत को कम करने के सामान्य उद्देश्य के साथ विकसित किया गया है या किया जा रहा है ताकि व्यक्तिगत आनुवंशिक चिकित्सा को पूरी तरह से महसूस किया जा सके। एक्स प्राइज फाउंडेशन (सांता मोनिका, सीए, यूएसए) द्वारा समर्थित जीनोमिक्स के लिए यूएस $10 मिलियन आर्कन एक्स पुरस्कार और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच-एनएचजीआरआई) के राष्ट्रीय मानव जीनोम अनुसंधान संस्थान द्वारा समर्थित यूएस $70 मिलियन अनुदान पुरस्कार दोनों ही नई डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकास में अनुसंधान गतिविधि के तेजी से विस्फोट को बढ़ावा दे रहे हैं। चूंकि विभिन्न दृष्टिकोण, तकनीक और रणनीतियाँ प्रत्येक डीएनए अनुक्रमण तकनीक को परिभाषित करती हैं, इसलिए प्रत्येक की अपनी ताकत और कमजोरियाँ होती हैं। विभिन्न दूसरी और तीसरी पीढ़ी की डी. एन. ए. अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के बीच महत्वपूर्ण मापदंडों की तुलना तालिका 1 में प्रस्तुत की गई है। संदर्भ डी. एन. ए. अनुक्रमण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी प्रयोगशाला तकनीक सूक्ष्म जीव विज्ञान तकनीक आणविक जीव विज्ञान तकनीक वैज्ञानिक तकनीक