Intracellular delivery
अंतःकोशिकीय वितरण जीवित कोशिकाओं में बाहरी सामग्री को पेश करने की प्रक्रिया है। कोशिकाओं में वितरित की जाने वाली सामग्रियों में न्यूक्लिक एसिड (डी. एन. ए. और आर. एन. ए.), प्रोटीन, पेप्टाइड्स, अभेद्य छोटे अणु, सिंथेटिक नैनोमटेरियल्स, ऑर्गेनेल और माइक्रोन-स्केल ट्रेसर, उपकरण और वस्तुएं शामिल हैं। इस तरह के अणुओं और सामग्रियों का उपयोग कोशिकीय व्यवहार की जांच करने, कोशिका संचालन को इंजीनियर करने या रोग संबंधी कार्य को सही करने के लिए किया जा सकता है। इंट्रासेल्युलर डिलीवरी के चिकित्सा अनुप्रयोगों में इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आईवीएफ) और एमआरएनए टीकों से लेकर जीन थेरेपी और सीएआर-टी कोशिकाओं की तैयारी तक शामिल हैं। औद्योगिक अनुप्रयोगों में प्रोटीन उत्पादन, जैव निर्माण और पौधों और जानवरों की आनुवंशिक इंजीनियरिंग शामिल हैं। अंतःकोशिकीय प्रसव जीव विज्ञान और आनुवंशिकी के अध्ययन में एक मौलिक तकनीक है, जैसे कि जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन कार्य की जांच करने के लिए डी. एन. ए. प्लास्मिड संक्रमण का उपयोग। जैविक, रासायनिक और भौतिक तकनीकों सहित अंतःकोशिकीय वितरण करने के लिए दृष्टिकोण की एक विस्तृत श्रृंखला मौजूद है जो या तो झिल्ली व्यवधान या वाहक में वितरण सामग्री की पैकेजिंग के माध्यम से काम करती है। अंतःकोशिकीय वितरण कोशिका जीव विज्ञान और प्रौद्योगिकी के प्रतिच्छेदन पर है, और आनुवंशिकी, जैव प्रौद्योगिकी, जैव इंजीनियरिंग और दवा वितरण सहित विज्ञान और चिकित्सा के कई क्षेत्रों से संबंधित है। अनुप्रयोग इलेक्ट्रॉनिक संकेतों के माध्यम से कंप्यूटर के संचालन के तरीके के अनुरूप, कोशिकाएं अणुओं के माध्यम से जानकारी को संसाधित और संचारित करती हैं। कोशिकाओं में भरे गए अणुओं और सामग्रियों के आधार पर, विभिन्न परिणाम या अनुप्रयोग प्राप्त किए जा सकते हैं (उदाहरण के लिए चित्र "अंतःकोशिकीय वितरण के अनुप्रयोग" देखें)। नीचे अंतःकोशिकीय वितरण के माध्यम से कोशिकाओं की जांच और इंजीनियर करने के लिए उपयोग की जाने वाली माल सामग्री के कुछ मुख्य वर्गीकरण दिए गए हैं। कार्गो प्रकार नाभिकीय अम्ल संक्रमण नाभिकीय अम्लः डी. एन. ए., आर. एन. ए. और उनके अनुरूपों के अंतःकोशिकीय वितरण को संदर्भित करता है। न्यूक्लिक एसिड पदार्थ जो आमतौर पर कोशिकाओं में स्थानांतरित होते हैं, वे हैं प्लास्मिड डी. एन. ए., एम. आर. एन. ए., एस. आई. आर. एन. ए. और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड। आधान अनुप्रयोग 3 मुख्य क्षेत्रों में फैले हुए हैंः बुनियादी जैविक अनुसंधान, जैव निर्माण और जीन और कोशिका-आधारित उपचार। बुनियादी शोध में, संक्रमण कोशिका जीव विज्ञान और आनुवंशिकी से लेकर प्रतिरक्षा विज्ञान और दवा की खोज तक के क्षेत्रों में एक आधारशिला तकनीक है। जैव-निर्माण में, संक्रमण का उपयोग टीकों के लिए प्रोटीन, एंटीबॉडी, वायरल वैक्टर और वायरस जैसे कणों के उत्पादन के लिए किया जाता है। कोशिका-आधारित उपचारों में आधान का उपयोग एक्स-विवो जीन थेरेपी, हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल इंजीनियरिंग, प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के उत्पादन और इम्यूनोथेरेपी के लिए कोशिकाओं की एक्स-विवो तैयारी जैसे अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है। पिछले 50 वर्षों में न्यूक्लिक एसिड आधान इंट्रासेल्युलर डिलीवरी की सबसे आम उपश्रेणी रही है। प्लास्मिड डी. एन. ए. को 1970 के दशक के अंत में सूक्ष्म इंजेक्शन और कैल्शियम फॉस्फेट विधियों के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति के उद्देश्य से पशु कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाना शुरू हुआ। तब से, इसका उपयोग कई अध्ययनों में जीन और प्रोटीन कार्य की जांच करने के लिए किया जाता रहा है। डी. एन. ए. प्लास्मिड भौतिक रूप से बड़े और बोझिल अणु होते हैं जिनमें एक 5-10 किलो-आधार प्लास्मिड होता है जो मुक्त और बिना संघनित होने पर विलयन में> 100 एन. एम. व्यास का होता है। फिर भी, उन्हें संपादित करने और तैयार करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित और अपेक्षाकृत कम लागत वाली तकनीकों के कारण, उनका उपयोग आमतौर पर जैविक अनुसंधान में किया जाता है। 1970 के दशक में यह दिखाया गया था कि एम. आर. एन. ए. के सूक्ष्म इंजेक्शन के परिणामस्वरूप प्रोटीन अभिव्यक्ति हुई। कुछ स्थितियों में, एम. आर. एन. ए. संक्रमण को डी. एन. ए. प्लास्मिड की तुलना में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए फायदेमंद माना जाता है क्योंकि निम्नलिखित कारणों से जीनोमिक एकीकरण का खतरा कम हो जाता है, साइटोसोलिक वितरण पर्याप्त होने के साथ परमाणु वितरण की आवश्यकता नहीं होती है, प्रोटीन अभिव्यक्ति खुराक-निर्भर और तेज, कम विषाक्त और प्रतिरक्षात्मक होती है जब उचित रूप से रासायनिक रूप से संशोधित किया जाता है। इस प्रकार, अधिकांश चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए एम. आर. एन. ए. को डी. एन. ए. की तुलना में एक बेहतर विकल्प माना जाता है, हालांकि यह अधिक महंगा और आंतरिक रूप से अस्थिर है। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डी. एन. ए. या आर. एन. ए. के एकल या दोहरे फंसे अनुक्रम होते हैं जिनकी लंबाई 30 से कम न्यूक्लियोटाइड होती है। छोटे हस्तक्षेप करने वाले आर. एन. ए. (एस. आई. आर. एन. ए.) आर. एन. ए. के छोटे 21-22 आधार जोड़ी डुप्लेक्स होते हैं जिन्हें जीन अभिव्यक्ति को शांत करने के लिए कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जा सकता है। 1998 में उनकी नोबेल पुरस्कार विजेता खोज के बाद से, एस. आई. आर. एन. ए. को जीन कार्य को बाधित करने के लिए हजारों जैविक अध्ययनों में कोशिकाओं में परिवर्तित किया गया है। अंतःकोशिकीय वितरण के लिए रुचि के अन्य ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स में एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (ए. एस. ओ.), माइक्रो आर. एन. ए. (एम. आई. आर. एन. ए.) और एप्टामर्स शामिल हैं। इस तरह के ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग कई अलग-अलग तंत्रों के माध्यम से कोशिका व्यवहार को बदलने के लिए किया जा सकता है। लिपिड नैनोपार्टिकल्स और इलेक्ट्रोपोरेशन वर्तमान में न्यूक्लिक एसिड संक्रमण के लिए व्यापक रणनीतियाँ हैं। हालांकि, कई प्राथमिक कोशिकाओं, स्टेम कोशिकाओं, रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में प्रभावी संक्रमण एक बाधा बनी हुई है। ऐसी कोशिकाओं में जैविक अनुसंधान करने और संभावित चिकित्सा अनुप्रयोगों को करने की क्षमता अक्सर संक्रमण दक्षता और उपचार के प्रति सहिष्णुता से सीमित होती है। इसके अलावा, वर्तमान में मानव शरीर के भीतर कोशिकाओं पर संक्रमण करने के दीर्घकालिक प्रभावों की खराब समझ है। प्रोटीन और पेप्टाइड्स जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन का वितरण, जैसे कि जीनोम-संपादन नाभिक, सक्रिय अवरोधक एंटीबॉडी, या उत्तेजक प्रतिलेखन कारक, कोशिका कार्य में हेरफेर और विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, प्रभावी अंतःकोशिकीय वितरण उपयोग करने योग्य प्रोटीन दवाओं के भंडार का विस्तार कर सकता है क्योंकि अधिकांश वर्तमान प्रोटीन-आधारित चिकित्सीय बाह्यकोशिकीय लक्ष्यों को प्राप्त करते हैं और यह वर्तमान अनुसंधान प्रयासों की एक सीमा है। कोशिकाओं में शुद्ध प्रोटीन का वितरण 1960 के दशक की शुरुआत में शुरू हुआ था। उदाहरणों में फेरिटिन के साथ माइक्रोइंजेक्ट किए गए अमीबा और बोवाइन एल्बुमिन के साथ माइक्रोइंजेक्ट किए गए चूहे के अंडे शामिल हैं। चूंकि प्रोटीन में विविध आकार, आकार और आवेश होता है, इसलिए उन्हें आसानी से एक आकार-फिट-सभी समाधानों के साथ कोशिकाओं में वितरित नहीं किया जा सकता है जो कैटेनिक लिपिड न्यूक्लिक एसिड संक्रमण के लिए उपयोग करते हैं। इसके विपरीत, कोशिकाओं में प्रोटीन वितरित करने के लिए विभिन्न विधियों का उपयोग किया गया है जिनमें शामिल हैंः माइक्रोइंजेक्शन, पिनोसोम का परासरण लिसिस, हाइपोटोनिक शॉक, स्क्रैप लोडिंग, बीड लोडिंग, सिरिंज लोडिंग, डिटर्जेंट एक्सपोजर, इलेक्ट्रोपोरेशन, छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थ, कोशिका भेदक पेप्टाइड्स, नैनोकैरियर्स, कोशिका निचोड़ना, नैनोनीडल्स, ध्वनिक गड़बड़ी और वाष्प नैनोबबल। जीनोम संपादन के उद्देश्यों के लिए, एस. जी. आर. एन. ए. के साथ संयुक्त कैस9 प्रोटीन को इलेक्ट्रोपोरेशन, माइक्रोइंजेक्शन, लिपिड नैनोपार्टिकल फॉर्मूलेशन, ऑस्मोटिक रूप से प्रेरित एंडोसाइटोसिस के बाद एंडोसोम व्यवधान, माइक्रोफ्लुइडिक विरूपण और सेल पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स से लेकर अन्य विधियों द्वारा वितरित किया गया है। छोटे अणु अंतःकोशिकीय वितरण की आवश्यकता वाले छोटे अणुओं में शामिल हैंः अभेद्य छोटे अणु दवाएं, छोटे अणु जांच और क्रायोप्रोटेक्टेंट। पूर्व का एक उदाहरण ब्लियोमाइसिन है, जो अपने सकारात्मक आवेश और हाइड्रोफोबिसिटी के कारण खराब पारगम्यता वाली एक कैंसररोधी दवा है। इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ इंट्रासेल्युलर डिलीवरी करके, ब्लियोमाइसिन की शक्ति को सौ गुना से अधिक बढ़ाया जा सकता है। छोटे अणु जांच के लिए, जब कोशिका के आंतरिक भाग में वितरित किया जाता है, तो ये अणु झिल्ली क्षमता, पीएच और आयनों की सांद्रता जैसे सेलुलर गुणों को रिपोर्ट करने में सक्षम होते हैं। एक उदाहरण पी. एफ. बी. आई. है, एक फ्लोरोसेंट डाई जिसे इंट्रासेल्युलर पोटेशियम सांद्रता को मापने के लिए नियोजित किया जा सकता है। अंत में, कुछ उम्मीदवार क्रायोप्रोटेक्टेंट अणु जैसे अभेद्य शर्करा अत्यधिक हाइड्रोफिलिक होते हैं और कोशिका झिल्ली में फैलने के लिए तैयार नहीं होते हैं। उदाहरण के लिए, ट्रेहैलोज (एम. डब्ल्यू. = 342 डी. ए.) एक प्राकृतिक डिसैकराइड है जिसे कई जीवों द्वारा संश्लेषित किया जाता है ताकि उन्हें सूखापन या जमने का सामना करने में मदद मिल सके। 200 एम. एम. तक की सांद्रता पर पशु कोशिकाओं में लोड किए गए ट्रेहैलोज को जमने और पिघलने के दौरान उत्कृष्ट क्रायोप्रोटेक्शन प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। माइक्रोस्केल में माइक्रोस्केल कार्गो सामग्री को विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं में सफलतापूर्वक वितरित किया गया है। एक सदी से कोशिकाओं में माइक्रोस्केल कार्गो को पेश करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन प्रमुख विधि रही है। एक उत्कृष्ट उदाहरण मेंढक के अंडे में एक शारीरिक कोशिका नाभिक का प्रत्यारोपण था ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि अंडे में डालने पर पूरी तरह से अलग शारीरिक कोशिकाओं से नाभिक एक नए जानवर में विकसित हो सकते हैं। माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग पहली बार जानवरों में आईवीएफ की अवधारणा के प्रमाण के रूप में अंडों में शुक्राणु डालने के लिए किया गया था। प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट जीन थेरेपी के लिए सूक्ष्म इंजेक्शन द्वारा कृत्रिम गुणसूत्रों को इंजीनियर किया गया है और कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया है। माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से कई प्रकार की कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया के प्रत्यारोपण का भी प्रदर्शन किया गया है। हाल ही में लेजर-ट्रिगर कैविटेशन बुलबुले का उपयोग बैक्टीरिया और माइटोकॉन्ड्रिया देने के उद्देश्य से कोशिका झिल्ली में क्षणिक छेद खोलने के लिए किया गया है। माइक्रोइंजेक्शन या बैलिस्टिक प्रणोदन का उपयोग करते हुए, माइक्रोन-स्केल कणों, गोले और मोतियों को सेलुलर माइक्रोरिओलॉजी अध्ययन के लिए कोशिकाओं में लोड किया गया है जो कोशिकाओं के आंतरिक यांत्रिक व्यवहार का आकलन करते हैं। उदाहरण के लिए, 5.6 माइक्रोन तक के माइक्रोइंजेक्टेड पी. ई. गाइलेटेड ट्रेसर मोतियों का उपयोग करते हुए, यह दिखाया गया कि मोटर-संचालित साइटोप्लाज्मिक मिश्रण ने छोटे और बड़े दोनों सेलुलर घटकों के इंट्रासेल्युलर आंदोलन को काफी बढ़ाया। अन्य अंतःकोशिकीय वितरण के लिए रुचि की अन्य सामग्रियों में कार्बन नैनोट्यूब, क्वांटम डॉट्स, चुंबकीय नैनोपार्टिकल्स और नैनोडिविस शामिल हैं जो संवेदक या जांच चिकित्सा अनुप्रयोगों के रूप में काम करते हैं निम्नलिखित चिकित्सा उपचार के उदाहरण हैं जो कम से कम एक चरण में अंतःकोशिकीय वितरण पर भरोसा करते हैं। हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल-आधारित जीन थेरेपीः एडेनोसिन डीअमिनेज़ गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी (ए. डी. ए.-एस. सी. आई. डी.) के उपचार के लिए स्ट्रिमवेलिस, जो एक कार्यात्मक एडेनोसिन डीअमिनेज़ (ए. डी. ए.) जीन के एक्स विवो गामा रेट्रोवायरल वेक्टर जीन वितरण के माध्यम से उत्पादित होता है (यूरोपीय अनुमोदन 2017)। स्ट्रिमवेलिस यूरोपीय मेडिसिन एजेंसी से अनुमोदन प्राप्त करने वाली पहली एक्स विवो ऑटोलॉगस जीन थेरेपी थी। मेटाक्रोमैटिक ल्यूकोडिस्ट्रोफी (एमएलडी) के उपचार के लिए एटिडार्सजीन ऑटोटेम्सल (लिबमेल्डी के रूप में ब्रांडेड), जो एक कार्यात्मक मानव एरिलसल्फेटेज ए (एआरएसए) जीन के एक्स विवो लेंटिवायरल जीन वितरण के माध्यम से उत्पादित होता है (यूरोपीय अनुमोदन 2020 में दिया गया)। आधान-निर्भर बीटा थैलेसीमिया (टी. डी. टी.) के उपचार के लिए बेटिबेलोजेन ऑटोटेम्सल (ज़िंटेग्लो के रूप में ब्रांडेड), जो एक कार्यात्मक मानव एच. बी. बी. जीन (यूरोपीय और अमेरिकी अनुमोदन 2022) के एक्स विवो लेंटिवायरल जीन वितरण के माध्यम से उत्पादित होता है। सीएआर-टी सेल इम्यूनोथेरेपीः बी-सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (बी-सेल एएलएल) के उपचार के लिए टिसाजेनलेक्ल्यूसेल (कैमरियाह के रूप में ब्रांडेड), जो सीडी-19 को लक्षित करने वाले सीएआर जीन के एक्स विवो लेंटिवायरल जीन वितरण के माध्यम से उत्पादित होता है (यूएस मंजूरी 2017 दी गई)। सीडी-19 को लक्षित करने वाले सीएआर जीन के एक्स विवो गामा रेट्रोवायरल जीन वितरण के माध्यम से उत्पादित बड़े बी-सेल लिम्फोमा के उपचार के लिए एक्सिकाबैटेजीन सिलोल्यूसेल (यसकार्टा के रूप में ब्रांडेड) (2017 में अमेरिकी मंजूरी दी गई)। रिलैप्स्ड/रिफ्रैक्टरी मेंटल सेल लिम्फोमा (आर/आर एमसीएल) वाले वयस्क रोगियों के उपचार के लिए ब्रेक्सुकाब्टेजीन ऑटोल्यूसेल (टेकार्टस के रूप में ब्रांडेड), जो सीडी-19 को लक्षित करने वाले सीएआर जीन के एक्स विवो गामा रेट्रोवायरल जीन वितरण के माध्यम से उत्पादित होता है (यूएस मंजूरी 2021 दी गई)। इन विवो वायरल वेक्टर-मेडिएटेड जीन थेरेपीः स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी के इलाज के लिए ओनासेम्नोजेन एबेपारवोवेक (ज़ोल्गेस्मा के रूप में ब्रांडेड), एक एएवी9 वायरल वेक्टर के अंतःशिरा जलसेक द्वारा प्रशासित किया जाता है जो प्रभावित मोटर न्यूरॉन्स को एक कार्यात्मक एसएमएन1 ट्रांसजीन प्रदान करता है (यूएस मंजूरी 2019 दी गई)। लेबर जन्मजात एमोरोसिस (एक वंशानुगत दृष्टिपटल विकार जो प्रगतिशील अंधापन का कारण बनता है) के उपचार के लिए वोरेटिजीन नेपारवोवेक (लुक्सटर्ना के रूप में ब्रांडेड), एक ए. ए. वी. 2 वायरल वेक्टर के सबरेटिना इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया जाता है जो आर. पी. ई. 65 उत्परिवर्तन की भरपाई के लिए नेत्र कोशिकाओं को आर. पी. ई. 65 जीन की एक कार्यात्मक प्रति प्रदान करता है। एस. आई. आर. एन. ए. दवाएंः वंशानुगत ट्रांसथायरेटिन-मध्यस्थता वाले एमाइलॉइडोसिस वाले लोगों में पॉलीन्यूरोपैथी के उपचार के लिए पैटिसिरन (ऑनपेट्रो), लिपिड नैनोपार्टिकल्स में तैयार किए गए एस. आई. आर. एन. ए. के अंतःशिरा जलसेक द्वारा प्रशासित किया जाता है जो रोगजनक ट्रांसथायरेटिन एम. आर. एन. ए. की अभिव्यक्ति को शांत करने के लिए यकृत कोशिकाओं में प्रवेश प्राप्त करता है (यू. एस. और यूरोपीय अनुमोदन 2018)। तीव्र यकृत पोर्फिरिया वाले वयस्कों के उपचार के लिए गिवोसिरन (गिवलारी), जिसे एस. आई. आर. एन. ए.-गैल. एन. ए. सी. संयुग्मों के अंतःशिरा जलसेक द्वारा प्रशासित किया जाता है, जो रोगजनक एमिनोलेवुलिनेट सिंथेस 1 (ए. एल. ए. एस. 1) एम. आर. एन. ए. (यू. एस. अनुमोदन 2019) की अभिव्यक्ति को शांत करने के लिए यकृत हेपेटोसाइट्स में प्रवेश प्राप्त करते हैं। एम. आर. एन. ए. टीकेः मॉडर्ना कोविड-19 टीका (स्पाइकवैक्स के रूप में ब्रांडेड) सार्स-कोव-2 वायरस (यू. एस. आपातकालीन उपयोग प्राधिकरण 2020) के संक्रमण के कारण होने वाले कोविड-19 से सुरक्षा प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह खारा में एम. आर. एन. ए.-एल. एन. पी. परिसरों की 0.5 एमएल खुराक के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया जाता है। स्थानीय इंजेक्शन निवासी/घुसपैठ करने वाले एपीसी, संबंधित प्रतिरक्षा कोशिकाओं और मांसपेशियों की कोशिकाओं को एमआरएनए-एलएनपी परिसरों को वितरित करने के लिए सूचित किया गया है, जो सार्स-कोव-2 के भविष्य के संपर्क के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रमुख करने के लिए कोविड स्पाइक प्रोटीन की स्थानीय अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है। फाइजर-बायोएनटेक कोविड-19 वैक्सीन (कॉमिरनाटी के रूप में ब्रांडेड) को सार्स-कोव-2 वायरस (यूएस आपातकालीन उपयोग प्राधिकरण 2020) के संक्रमण के कारण होने वाले कोविड-19 से सुरक्षा प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। तंत्र मॉडर्ना (ऊपर) के समान है, सिवाय इसके कि लिपिड नैनोपार्टिकल्स की संरचना अलग है, फाइजर एएलसी-0315 के रूप में जाने जाने वाले आयनीकरण लिपिड का उपयोग करता है जबकि मॉडर्ना एसएम-102 नामक आयनीकरण लिपिड का उपयोग करता है। एंटीसेन्स ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (ए. एस. ओ.): समरूपी पारिवारिक हाइपरकोलेस्टेरोलेमिया के उपचार के लिए मिपोमरसें (कैनाम्रो के रूप में ब्रांडेड), रासायनिक रूप से संशोधित ए. एस. ओ. के त्वचीय इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया जाता है जो ~ 30 दिनों के आधे जीवन के साथ यकृत में जमा हो जाते हैं। ए. एस. ओ. रोगजनक ए. पी. ओ. बी. एम. आर. एन. ए. की अभिव्यक्ति को रोकने के लिए यकृत कोशिकाओं में प्रवेश प्राप्त करते हैं (2013 में यू. एस. की मंजूरी दी गई)। स्पाइनल मस्कुलर एट्रोफी (एस. एम. ए.) के उपचार के लिए स्पिन्राजा (नूसिनर्सन के रूप में ब्रांडेड), रासायनिक रूप से संशोधित ए. एस. ओ. के इंट्राथेकल इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया जाता है जो मोटर न्यूरॉन कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं, एस. एम. एन. 2 एम. आर. एन. ए. को बांधते हैं, और प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बहाल करने के लिए एस. एम. एन. 2 जीन के वैकल्पिक विभाजन को बदलते हैं। मानव गर्भधारण के लिए इन विट्रो फर्टिलाइजेशन (आई. वी. एफ.): कम शुक्राणु गिनती या गतिशीलता जैसे मामलों में, या जहां अंडों को आसानी से शुक्राणु द्वारा प्रवेश नहीं किया जा सकता है, एकल शुक्राणु को इंट्रासाइटोप्लाज्मिक शुक्राणु इंजेक्शन (आई. सी. एस. आई.) नामक प्रक्रिया का उपयोग करके सीधे अंडे में सूक्ष्म इंजेक्शन दिया जा सकता है। इंजेक्शन के बाद निषेचित अंडे को एक विशेष विकास माध्यम में लगभग 48 घंटे तक इंक्यूबेट किया जाता है जब तक कि अंडे में छह से आठ कोशिकाएं न हों। इसके बाद इसे एक पतले, प्लास्टिक कैथेटर के माध्यम से रोगी के गर्भाशय में स्थानांतरित किया जाता है, जो योनि और गर्भाशय ग्रीवा से होकर गुजरता है। आई. सी. एस. आई. द्वारा उत्पन्न पहली मानव गर्भावस्था 1991 में जियानपेरो पालेर्मो और उनकी टीम द्वारा की गई थी। आई. सी. एस. आई. के माध्यम से आई. वी. एफ. ने 1990 के दशक से दुनिया भर में लाखों गर्भधारण की सुविधा प्रदान की है। सुरक्षा। मानव कोशिकाओं में सामग्री के अंतःकोशिकीय वितरण के तत्काल और दीर्घकालिक चिकित्सा प्रभावों को समझने के लिए अनुसंधान अभी भी प्रारंभिक चरण में है। उदाहरण के लिए, जांच से पता चला है कि आई. सी. एस. आई. के माध्यम से पैदा होने वाले बच्चे प्राकृतिक रूप से गर्भ धारण करने वालों की तुलना में अधिक स्वास्थ्य समस्याओं का सामना करते हैं। हालाँकि, यह ज्ञात नहीं है कि क्या यह माता-पिता की प्रजनन प्रणाली के खराब स्वास्थ्य या आईवीएफ और आईसीएसआई प्रक्रिया के पहलुओं के कारण है। गामा रेट्रोवायरल और लेंटिवायरल वैक्टर के साथ तैयार किए गए एच. एस. सी.-आधारित जीन थेरेपी में कुछ मामलों में जीनोटोक्सिसिटी के कारण ल्यूकेमिया का खतरा बढ़ गया है, जैसा कि स्ट्रिमवेलिस के साथ हुआ है। इसके अलावा, चिकित्सीय एस. आई. आर. एन. ए. और एम. आर. एन. ए. के अंतःकोशिकीय वितरण के लिए उपयोग किए जाने वाले लिपिड सूजन प्रतिक्रियाओं का कारण बन सकते हैं। पेटिसिरन के मामले में, नैनोपार्टिकल पर प्रतिक्रियाओं को कम करने के लिए कई एंटी-इंफ्लेमेटरी दवाओं के साथ पूर्व उपचार का उपयोग किया जाता है। वर्तमान में प्राप्तकर्ता आबादी के अल्पकालिक और दीर्घकालिक स्वास्थ्य दोनों पर एस. एम.-102 और ए. एल. सी.-0315 जैसे एम. आर. एन. ए. टीकों के नए रासायनिक घटकों के अंतःकोशिकीय वितरण के चिकित्सा प्रभाव पर बहुत कम डेटा उपलब्ध है। इस प्रकार, अंतःकोशिकीय प्रसव का उपयोग करने वाले चिकित्सा उपचारों के लिए सुरक्षा और अनपेक्षित दुष्प्रभाव महत्वपूर्ण विषय बने रहेंगे। विधियों की श्रेणियां अंतःकोशिकीय वितरण की वर्तमान विधियों को दो व्यापक श्रेणियों में रखा जा सकता हैः झिल्ली व्यवधान-मध्यस्थ वाहक-मध्यस्थ झिल्ली व्यवधान झिल्ली व्यवधान-मध्यस्थ तकनीकों में कोशिका झिल्ली में अस्थायी छेद बनाना और माल अणुओं को दोनों में से किसी एक के माध्यम से वितरित करना शामिल है ए) बाह्य कोशिकीय समाधान से सामग्री का पारगम्यता और प्रसार प्रवाह बी) एक वाहन या वाहक के साथ सीधा प्रवेश जो दोनों प्लाज्मा झिल्ली को पंचर करता है और रुचि के माल का परिचय देता है। कोशिका की प्लाज्मा झिल्ली को यांत्रिक, विद्युत, रासायनिक, ऑप्टिकल या थर्मल साधनों के माध्यम से बाधित किया जा सकता है। अंतःकोशिकीय वितरण विधियाँ जो पारगम्यता को नियोजित करती हैं उनमें शामिल हैंः विद्युत संयोजन तापीय उपचार ऑप्टोपरेशन (आमतौर पर एक लेजर के साथ) कैविटेशन प्रभाव (आमतौर पर अल्ट्रासाउंड या लेजर/कण इंटरैक्शन से) द्रव कतरनी (आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक्स या कैविटेशन के माध्यम से) डिटर्जेंट/सर्फैक्टेंट छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थ ऑस्मोटिक/हाइड्रोस्टैटिक बल प्रत्यक्ष यांत्रिक विधियाँ जैसे माइक्रोफ्लुइडिक सेल निचोड़ना, स्क्रैप लोडिंग, बीड लोडिंग। इंट्रासेल्युलर डिलीवरी विधियाँ जो सीधे प्रवेश का उपयोग करती हैं उनमें शामिल हैंः क्लासिक माइक्रोइंजेक्शन माइक्रोइंजेक्शन के नए रूप (जैसे। नैनोपीपेट, स्वचालन आदि) बैलिस्टिक कण/जीन गन नैनोनीडल्स और उनकी विविधताएँ जैसे नैनोस्ट्रॉ, नैनोस्पियर्स और नैनोवायर। झिल्ली व्यवधान-मध्यस्थ वितरण विधियाँ लगभग किसी भी सामग्री को वितरित कर सकती हैं जिसे घोल में फैलाया जा सकता है, जिससे वे वाहक-मध्यस्थ विधियों की तुलना में अधिक सार्वभौमिक बन जाते हैं। झिल्ली व्यवधान-मध्यस्थता विधियों के लिए प्रमुख चुनौती आवश्यक वितरण अनुप्रयोग के लिए इष्टतम आकार, आकार, स्थान और अवधि के छेद बनाना है। अत्यधिक झिल्ली क्षति से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह कोशिकाओं को मार सकता है या उनके कार्य को खराब कर सकता है। वाहक-मध्यस्थ वितरण तकनीक कार्गो को एक नैनोस्केल वाहक में या उस पर पैक करती है, जो तब कार्गो को वितरित करने के लिए सेल में प्रवेश करती है। वाहक आम तौर पर या तो एंडोसाइटोसिस (अधिकांश वाहक) या कोशिका की प्लाज्मा झिल्ली के साथ संलयन के माध्यम से कोशिका के आंतरिक भाग में प्रवेश प्राप्त करते हैं, हालांकि, कुछ वाहकों के अब तक अज्ञात तंत्रों के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली को पार करने या अस्थायी रूप से बाधित करने की दुर्लभ रिपोर्टें हैं। वाहक-आधारित दृष्टिकोणों में विभिन्न जैव रासायनिक संयोजन होते हैं, जो ज्यादातर आणविक से नैनोस्केल आयामों के होते हैं। वाहक का उद्देश्य तीन गुना है, कार्गो को पैकेज करना और इसे क्षरण से बचाना, इच्छित अंतःकोशिकीय डिब्बे तक पहुंच प्राप्त करना, और उचित समय और स्थान पर पेलोड को छोड़ना। वाहक जैव-प्रेरित हो सकते हैं, जैसे कि पुनर्गठित वायरस, वायरस जैसे कण, पुटिका, कोशिका भूत, और कार्यात्मक लिगेंड और पेप्टाइड। वे रसायन विज्ञान, सामग्री विज्ञान और नैनो प्रौद्योगिकी से संश्लेषण तकनीकों पर आधारित हो सकते हैं, जिसमें कार्बनिक और अकार्बनिक मूल से मैक्रोमोलेक्युलर परिसरों का संयोजन शामिल है। अंतःकोशिकीय वितरण के लिए जिन वाहकों का उपयोग किया गया है उनमें शामिल हैंः पॉलिमर असेंबली लिपिड असेंबली लाइपोसोम (जलीय आंतरिक के साथ खोखला, लिपिड असेंबली के विपरीत) नमक परिसर (जैसे। सी. ए. पी. ओ. 4-न्यूक्लिक एसिड कंडेन्सेट्स) एक्सोसोम और अन्य जैव-प्रेरित पुटिका कोशिका-भेदक पेप्टाइड्स (सी. पी. पी.), जिन्हें प्रोटीन ट्रांसडक्शन डोमेन (पी. टी. डी.) के रूप में भी जाना जाता है, लिगैंड संयुग्म प्रोटीन या चीनी आधारित नैनोएसेम्बली (जैसे. चिटोसन) अकार्बनिक नैनोकैरियर्स (जैसे। मेसोपोरस सिलिका, धातु नैनोपार्टिकल्स, चुंबकीय नैनोपार्टिकल्स) नैनोटेक्नोलॉजी-आधारित वाहक (जैसे। क्वांटम डॉट्स, कार्बन नैनोट्यूब) वायरल वैक्टर (लेंटिवायरस, रेट्रोवायरस, एडेनोवायरस, एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी), और अन्य वायरस पर आधारित) पुनः-उद्देश्यित जीवाणु विषाक्त पदार्थ और वायरल घटक इस बात पर शोध कि वाहक कोशिकाओं में कैसे प्रवेश करते हैं, इंगित करता है कि अधिकांश वाहक एंडोसोमल डिब्बों से कोशिका द्रव्य में भागने से पहले एंडोसाइटोसिस के माध्यम से प्रवेश करते हैं। नैनोकैरियर्स के लिए उपलब्ध एंडोसाइटोसिस के तंत्र में क्लैथ्रिन-निर्भर और क्लैथ्रिन-स्वतंत्र मार्गों के माध्यम से फागोसाइटोसिस और पिनोसाइटोसिस शामिल हैं। लक्ष्य कोशिकाओं द्वारा नियोजित आंतरिककरण मार्ग आकार, आकार, सामग्री संरचना, सतह रसायन विज्ञान और/या वाहक के आवेश पर निर्भर करते हैं। एंडोसोम से बचने में सक्षम कार्गो को क्षरण के लिए लाइसोसोम में तस्करी की जाती है या कोशिका की सतह पर वापस पुनर्नवीनीकरण किया जाता है। लिपिड नैनोपार्टिकल्स और सेल-पेनेट्रेटिंग पेप्टाइड्स सहित अधिकांश गैर-वायरल वाहक रणनीतियों के लिए लगभग 1 प्रतिशत एंडोसोमल एस्केप की दक्षताओं की सूचना दी गई है। इसके अलावा, एंडोसोम से बचने के सटीक तंत्र स्पष्ट नहीं हैं और यह चल रहे शोध का विषय है। एंडोसाइटोसिस के अलावा, कुछ वाहक संलयन के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के साथ सीधे विलय करने में सक्षम होते हैं। जीव विज्ञान में संलयन घटनाओं में पुटिका संलयन, कोशिका-कोशिका संलयन और कोशिका-वायरस संलयन शामिल हैं। इन मामलों में, जक्सटापोज्ड झिल्ली को विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन अंतःक्रियाओं द्वारा निकट संपर्क में खींचा जाता है और लिपिड मिश्रण और बाद के संलयन को बढ़ावा देने के लिए इंटरफैशियल पानी को बाहर रखा जाता है। आच्छादित वायरस लक्षित कोशिका झिल्ली के साथ संलयन में मध्यस्थता करने के लिए ट्रांसमेम्ब्रेन वायरल प्रोटीन का उपयोग कर सकते हैं और इस तंत्र का उपयोग इंजीनियर इंट्रासेल्युलर डिलीवरी के लिए किया गया है। एक प्रारंभिक उदाहरण लक्ष्य कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली के साथ पूर्व-लोडेड लाल रक्त कोशिका भूतों को फ्यूज करने के लिए सेंडाई वायरस का उपयोग था। इस तकनीक पर एक भिन्नता ने लक्षित कोशिका झिल्ली पर इन्फ्लूएंजा हेमाग्लुटिनिन (एच. ए.) की अभिव्यक्ति का उपयोग किया, जो फिर संलयन को प्रेरित करने के लिए लाल रक्त कोशिका की सतह पर सियालिक एसिड अवशेषों को बांधता है। वाइरोसोम, जिसमें लाइपोसोम या पुटिकाओं में पुनर्गठित वायरल झिल्ली घटक होते हैं, अंतःकोशिकीय वितरण के उद्देश्यों के लिए संलयन क्षमताओं को भी प्रदर्शित करते हैं। सेंडाई, इन्फ्लूएंजा, वेसिकुलर स्टेमाइटिस और अन्य वायरसों के संलयन घटकों के साथ कार्यात्मक वाइरोसोम का निर्माण किया गया है। कुछ एक्सोसोम और बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को लक्षित कोशिकाओं के साथ संलयन के लिए सूचित किया गया है और इसके अलावा मांग पर संलयन के लिए इंजीनियरिंग हो सकती है। दिलचस्प बात यह है कि प्रोटीन वितरण के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्यूजोजेनिक लाइपोसोम को फ्यूजोजेनिक प्रोटीन या पेप्टाइड्स की उपस्थिति की आवश्यकता के बिना केवल लिपिड संरचना को संशोधित करके संलयन में सक्षम बताया गया है। इंट्रासेल्युलर डिलीवरी के लिए जिन फ्यूजोजेनिक वाहकों का उपयोग किया गया है, उनमें (1) कोशिका भूत, मृत कोशिकाएं जिनके साइटोप्लाज्म को कार्गो से बदल दिया गया है, (2) वाइरोसोम, कार्यात्मक वायरल प्रोटीन को प्रदर्शित करने के लिए कार्गो-लोडेड वेसिकल्स का पुनर्गठन, और (3) फ्यूजोजेनिक लाइपोसोम शामिल हैं। वायरल वैक्टर। वायरल वैक्टर कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए वायरल संक्रमण मार्ग का उपयोग करते हैं लेकिन वायरल जीन की बाद की अभिव्यक्ति से बचते हैं जो प्रतिकृति और रोगजनकता की ओर ले जाती है। यह वायरल जीनोम के कोडिंग क्षेत्रों को हटाकर और उन्हें वितरित किए जाने वाले डीएनए के साथ प्रतिस्थापित करके किया जाता है, जो या तो मेजबान गुणसूत्र डीएनए में एकीकृत होता है या एक एपिसोड वेक्टर के रूप में मौजूद होता है। वायरल वैक्टर को पहली बार 1970 के दशक से जीन वितरण के लिए नियोजित किया गया था, जिसे एसवी40 या रेट्रोवायरस से बनाया गया था। वायरल वेक्टर प्लेटफार्मों की नई पीढ़ियों का उत्पादन लेंटिवायरस, रेट्रोवायरस, एडेनोवायरस या एडेनो से जुड़े वायरस और अन्य वायरस के घटकों के आधार पर किया गया है। डी. एन. ए. वितरण के लिए अत्यधिक कुशल होने के बावजूद, वायरल वैक्टरों की उल्लेखनीय कमजोरियां हैं (1) श्रम-गहन और महंगे प्रोटोकॉल, (2) सुरक्षा मुद्दे, (3) प्रतिरक्षा/सूजन प्रतिक्रिया पैदा करने का जोखिम, (4) पुनर्संयोजक वैक्टरों के साथ जीनोम में एकीकरण, (5) सम्मिलन जीनोटोक्सिसिटी का जोखिम, और (6) सीमित पैकेजिंग क्षमता (एडेनो और ए. ए. वी. आमतौर पर 5-7.5 के. बी. ले जाने के लिए प्रतिबंधित)। आधानक लेल नैनोपार्टिकल्स। न्यूक्लिक एसिड के इंट्रासेल्युलर वितरण के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले नैनोपार्टिकल्स कैशनिक लिपिड और पॉलिमर के संयोजन पर आधारित होते हैं। ये कैशनिक अणु डीएनए प्लास्मिड (~ 50-200 nm), mRNA (10-100 nm) और अन्य न्यूक्लिक एसिड ("इंट्रासेल्युलर डिलीवरी के लिए रुचि के सामान्य अणुओं के गुण" देखें) को दसियों नैनोमीटर तक के आयाम वाले कॉम्पैक्ट नैनोपार्टिकल्स में संघनित करते हैं। अधिकांश पशु कोशिकाओं (-35 से-80 एम. वी. झिल्ली क्षमता) के प्राकृतिक नकारात्मक आवेश के कारण इन कणों का सकारात्मक आवेश कोशिका की सतह पर उनके आकर्षण को सुविधाजनक बनाता है। बांधने पर, एंडोसाइटोसिस को 100 एनएम से कम आकार के कणों के लिए सबसे कुशल माना जाता है। नैनोपार्टिकल्स में जटिलता भी न्यूक्लीक एसिड के लिए क्षरण के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करती है जब तक कि उन्हें उपयुक्त इंट्रासेल्युलर डिब्बे में नहीं छोड़ा जाता है। 1960 के दशक से यह देखा गया कि न्यूक्लीक एसिड को कैशनिक अणुओं के साथ मिलाने से मैक्रोमोलेक्युलर कॉम्प्लेक्स बनते हैं जो कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं। दो प्रारंभिक उदाहरण बहुलक डायथाइलामिनोइथाइल-डेक्स्ट्रान (डी. ई. ए. ई.-डेक्स्ट्रान)/न्यूक्लिक एसिड संयोजन (1968) और अघुलनशील आयनिक नमक कैल्शियम फॉस्फेट/न्यूक्लिक एसिड अवक्षेपक (1973) थे। आधान के लिए कैशनिक लिपिड का उपयोग 1980 के दशक में शुरू हुआ, जिसे "लिपोफ़ेक्शन" कहा गया, और 1993 में शुरू किए गए लोकप्रिय उत्पाद लिपोफ़ेक्टामाइन का आधार बन गया। 1990 के दशक में डेंड्रिमर जैसे 1993 में पी. ए. एम. ए. एम. (1990 के दशक के अंत में शुरू किया गया "सुपरफ़ेक्ट" अभिकर्मक) और 1995 में पी. ई. आई. जैसे कैटेनिक पॉलिमर (इसके तुरंत बाद "पॉलीजेट" के रूप में विपणन) के आधार पर अन्य कैटेनिक संक्रमण अभिकर्मकों का विकास किया गया था। वर्तमान में अनुसंधान में, अधिकांश न्यूक्लिक एसिड आधान लिपिड अभिकर्मकों के साथ किया जाता है, जिसमें बहुलक अभिकर्मक और इलेक्ट्रोपोरेशन अन्य प्रमुख विकल्पों के रूप में होते हैं। कुछ पुनरावर्ती कोशिकाएँ या इन विवो अनुप्रयोग वायरल वैक्टर के लिए बेहतर अनुकूल हो सकते हैं। तकनीकी प्रगति झिल्ली व्यवधान की सटीकता में सुधार सूक्ष्म निर्माण, नैनो प्रौद्योगिकी, रसायन विज्ञान और अन्य शोध क्षेत्रों में प्रगति ने अंतःकोशिकीय वितरण विधियों की सटीकता और प्रदर्शन में सुधार में योगदान दिया है। इलेक्ट्रोपोरेशन। इलेक्ट्रोपोरेशन के प्रारंभिक संस्करणों में एक क्यूवेट में घोल में कोशिकाओं पर परिभाषित वोल्टेज की विद्युत स्पंदों को लागू करने के लिए थोक इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता था। इलेक्ट्रोपोरेशन को तब 90 के दशक के अंत में माइक्रोफ्लुइडिक्स के उपयोग के माध्यम से सूक्ष्म पैमाने पर लाया गया था। इसके बाद नैनो-इलेक्ट्रोपोरेशन नैनो अपर्चर और नैनोस्ट्रॉ के उपयोग के माध्यम से हासिल किया गया था। इलेक्ट्रोपोरेशन के नैनो और सूक्ष्म संस्करणों में लक्ष्य कोशिकाओं पर लगाए गए झिल्ली व्यवधानों के आकार और स्थान पर बहुत अधिक सटीकता और नियंत्रण होता है। मैक्ससाइट नामक एक कंपनी ने फ्लो इलेक्ट्रोपोरेशन का एक उच्च-थ्रूपुट संस्करण विकसित किया है जो दसियों मिनटों में सैकड़ों लाखों कोशिकाओं को संसाधित कर सकता है। इसके अलावा, अन्य शोध समूहों ने उच्च प्रवाह क्षमता बहु-कुएँ प्रणालियों में विद्युत संयोजन मानकों में सुधार के लिए गहन शिक्षा को नियोजित किया है। यांत्रिक संपर्क। कोशिका झिल्ली पर प्रहार करने वाली वस्तुओं के यांत्रिक बल का दोहन करने वाले अंतःकोशिकीय वितरण प्रोटोकॉल के पहले संस्करण सरल और कच्चे तरीके थे जैसे कि स्क्रैप लोडिंग और ग्लास बीड लोडिंग। उदाहरण के लिए, स्क्रैप लोडिंग में, एक स्पैटुला को एडेरेंट कोशिकाओं में खींचा जाता है जिन्हें एक सपाट सब्सट्रेट पर संवर्धित किया गया है। जैसे ही कोशिकाएं सब्सट्रेट को छीलती हैं, वे परिवर्तनशील मात्रा में झिल्ली क्षति से गुजरती हैं और घोल में अणुओं को लेने में सक्षम होती हैं। कोशिकाओं में प्रोटीन और छोटे अणुओं को पेश करने के लिए कई जैविक अध्ययनों में स्क्रैप और बीड लोडिंग का उपयोग किया गया है। 1990 के दशक के अंत से शोधकर्ताओं ने नैनोनीडल्स और सूक्ष्मनिर्मित उपकरणों के उपयोग के माध्यम से ठोस अनुबंध-आधारित झिल्ली व्यवधान की सटीकता में सुधार करने के लिए काम किया है। नैनोनीडल्स का उपयोग पहली बार 2003 में न्यूक्लिक एसिड आधान के लिए किया गया था और फिर 2010 में विविध कार्गो के वितरण का प्रदर्शन किया गया था। अधिक कार्यक्षमता जोड़ने के लिए उन्हें इलेक्ट्रोपोरेशन, प्रवाह जलाशयों और डिटर्जेंट के साथ जोड़ा गया है। इसके अलावा, नैनोस्ट्रॉ का उपयोग समय-निर्धारित तरीके से कोशिकाओं में अणुओं को डालने और निकालने दोनों के लिए किया गया है। 1999 में यह पाया गया कि पॉली कार्बोनेट फिल्टर में छेद के माध्यम से गुजरने वाली कोशिकाओं ने डी. एन. ए. संक्रमण प्राप्त करने के लिए कोशिका झिल्ली में अस्थायी व्यवधान पैदा किए। इस विधि को "निस्पंदन" कहा जाता था और उस समय इस पर ज्यादा ध्यान नहीं दिया गया था। 2012 में एम. आई. टी. के शोधकर्ताओं ने पाया कि सिलिकॉन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में संकुचन के माध्यम से कोशिकाओं को पारित करना विभिन्न सामग्रियों के अंतःकोशिकीय वितरण को प्राप्त करने के लिए कोशिका झिल्ली को बाधित करने में सक्षम था। विधि, जिसे कोशिका निचोड़ना कहा जाता है, को एसक्यूजेड बायोटेक नामक एक कंपनी में विभाजित किया गया था जो कोशिका-आधारित उपचारों को विकसित करने के लिए इंट्रासेल्युलर डिलीवरी तकनीक का लाभ उठाने पर केंद्रित है। कोशिकाओं की प्रवाह गति और माइक्रोफ्लुइडिक संकुचन के आकार और आकार को समायोजित करके, कोशिका निचोड़ को विभिन्न कोशिका प्रकारों और वितरण अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अन्य शोध समूहों ने माइक्रोसीव और पी. डी. एम. एस. आधारित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में कोशिका निचोड़ने की अवधारणा का प्रदर्शन किया है। नाभिक में डी. एन. ए. और अन्य सामग्रियों के तेजी से वितरण को प्राप्त करने के लिए कोशिका निचोड़ को इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ जोड़ा गया है। यह पहले प्लाज्मा झिल्ली में छेद करके काम करता है, फिर एक विद्युत स्पंद होने से 1) परमाणु झिल्ली को बाधित करता है, और 2) नकारात्मक रूप से आवेशित न्यूक्लिक एसिड को कोशिका में ले जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक कोशिका निचोड़ने के बाद डाउनस्ट्रीम इलेक्ट्रोपोरेशन को परमाणु झिल्ली में अस्थायी व्यवधान पैदा करने के लिए दिखाया गया है जिसे 15 मिनट के भीतर ठीक कर दिया गया था। द्रव कतरनी। कोशिका झिल्ली को नियंत्रित रूप से बाधित करने के लिए द्रव कतरनी बलों का उपयोग करने के प्रारंभिक उदाहरणों में पारंपरिक अल्ट्रासाउंड, निलंबन में कोशिकाओं के लिए सिरिंज लोडिंग और अनुवर्ती कोशिकाओं पर शंकु-प्लेट विस्कोमीटर का उपयोग शामिल है। सिरिंज लोडिंग में, कोशिकाओं के निलंबन को चूसा जाता है और सुई की महीन नोक के माध्यम से सिरिंज से बाहर निकाला जाता है। सुई की नोक पर द्रव कतरनी बल प्रवाह वेग पर निर्भर करता है और कोशिका झिल्ली को बाधित करने के लिए तैयार किया जा सकता है। 1990 के दशक से, कोशिकाओं को पारगम्य बनाने के लिए द्रव कतरनी बलों को नियोजित करने के लिए अधिक सटीक रणनीतियों में माइक्रोफ्लुइडिक्स, अल्ट्रासाउंड, शॉक वेव्स और लेजर-आधारित तरीके शामिल हैं। एक जलीय वातावरण में एक अवशोषक वस्तु का लेजर विकिरण कैविटेशन, प्लाज्मा उत्पादन, रासायनिक प्रतिक्रियाओं और गर्मी सहित विभिन्न प्रकार के प्रभाव पैदा कर सकता है। लेजर-कण और लेजर-सतह दोनों की अंतःक्रियाओं का उपयोग कैविटेशन घटनाओं को बनाने के लिए किया गया है जो कोशिकाओं को स्थानीय रूप से केंद्रित द्रव कतरनी बलों के लिए उजागर करते हैं। उदाहरण के लिए, एक धातु नैनोस्ट्रक्चर का उपयोग बीज संरचना के रूप में लघु लेजर पल्स ऊर्जा प्राप्त करने और इसे अत्यधिक स्थानीय विस्फोटक वाष्प बुलबुले में बदलने के लिए किया जा सकता है। इस अवधारणा के एक उच्च थ्रूपुट संस्करण का अनावरण 2015 में किया गया था, जिसमें धातु अवशोषकों द्वारा पंक्तिबद्ध छिद्रों के साथ संरेखित उपस्तरों को अनुवर्ती कोशिकाओं के बेसल पक्ष के नीचे विस्फोटक गुहा बुलबुले उत्पन्न करने के लिए विकिरणित किया गया था। झिल्ली पारगम्यता को कई प्रकार की कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में जीवित बैक्टीरिया (> 1 माइक्रोन) को सफलतापूर्वक पेश करने के लिए छिद्रों के माध्यम से कार्गो के सक्रिय पंपिंग के साथ समक्रमित किया गया था। तापीय प्रभाव। कोशिकाओं में अणुओं को पहुँचाने का एक सरल तरीका प्लाज्मा झिल्ली को तब तक गर्म करना है जब तक कि छेद नहीं बन जाते। पर्याप्त रूप से उच्च तापमान पर, घटक अणुओं की गतिज ऊर्जा झिल्ली के गठन को बनाए रखने वाले बलों की तुलना में अधिक होने के कारण लिपिड द्वि-परतें अलग हो जाएंगी, अर्थात् हाइड्रोफोबिक बल जो लिपिड पूंछ से पानी को पीछे हटाते हैं। इस विधि का नकारात्मक पक्ष यह है कि यह अविश्वसनीय रूप से गैर-विशिष्ट है और कोशिकाओं को अत्यधिक नुकसान पहुंचा सकती है। तापीय माध्यमों से कोशिकाओं को पारगम्य बनाने की रणनीतियों में शामिल हैं (1) शीतलन-ताप चक्र के माध्यम से साइकिल चलाने वाली कोशिकाएं, जिनमें हिमांक शामिल हो सकता है या नहीं, (2) ताप कोशिकाओं से सुपरफिजियोलॉजिकल तापमान तक, और (3) कोशिका के एक छोटे से हिस्से का क्षणिक तीव्र ताप। बाद के मामले में, थर्मल इंकजेट प्रिंटर का उपयोग पशु कोशिकाओं में अंतःकोशिकीय वितरण और संक्रमण के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। लेजर-कण अंतःक्रिया को कोशिका झिल्ली को सटीक रूप से ऊष्मीय रूप से बाधित करने के लिए बताया गया है। सोने के नैनोकणों को एक घनी सतह परत में पैक किया गया था जहां 10 से अधिक अवरक्त लेजर विकिरण कोशिकाओं के निचले हिस्से को गर्म करता है ताकि पारगम्यता और रंगों, डेक्सट्रांस और प्लाजमिड के वितरण को ट्रिगर किया जा सके। 2021 में इस अवधारणा को और विकसित किया गया जब शोधकर्ताओं ने दिखाया कि जैव-संगत इलेक्ट्रोस्पन नैनोफाइबर में एम्बेडेड प्रकाश-संवेदनशील आयरन ऑक्साइड नैनोपार्टिकल्स कोशिकाओं और नैनोपार्टिकल्स के बीच सीधे संपर्क के बिना फोटोथर्मल प्रभावों द्वारा झिल्ली पारगम्यता को ट्रिगर कर सकते हैं। यह विधि भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और कठिन-से-संक्रमित टी कोशिकाओं सहित अनुवर्ती और निलंबन कोशिकाओं को सी. आर. आई. एस. पी. आर.-सी. ए. एस. 9 मशीनरी और एस. आई. आर. एन. ए. देने में सक्षम थी। कार्गो और वाहक एम. आर. एन. ए. दवाओं का जैव रासायनिक संवर्धन। लिपिड नैनोपार्टिकल फार्मूलेशन और न्यूक्लिक एसिड रसायन विज्ञान में प्रगति न्यूक्लिक एसिड चिकित्सीय के विकास में महत्वपूर्ण रही है, जैसे कि एम. आर. एन. ए. टीके। उदाहरण के लिए, प्रारंभिक एंडोसोमल पी. एच. के करीब एक एसिड पृथक्करण स्थिरांक (पी. के. ए.) के साथ कैशनिक आयनीकरण लिपिड, जो लिपिड नैनोपार्टिकल फॉर्मूलेशन का एक प्रमुख घटक है, का डिजाइन एंडोसाइटोसिस के बाद साइटोप्लाज्म में एंडोसोमल रिलीज को सक्षम करता है। मॉडर्ना कोविड वैक्सीन में लिपिड नैनोपार्टिकल्स आयनीकरण लिपिड एस. एम.-102, कोलेस्ट्रॉल, 1,2-डिस्टियरॉयल-एंग्लिसरो-3 फॉस्फोकोलाइन (डी. एस. पी. सी.) और पी. ई. जी. 2000-डी. एम. जी. से बने होते हैं जो एम. आर. एन. ए. को समाहित करते हैं। फाइजर/बायोएनटेक कोविड टीके एक्यूटस थेरेप्यूटिक्स से एएलसी-0315 लिपिड का उपयोग करते हैं और इसे एमआरएनए के साथ कोलेस्ट्रॉल, डीएसपीसी और एक पीईजी-लिपिड (एएलसी-0159) के साथ तैयार करते हैं। इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के बाद, नैनोकण कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं, एमआरएनए को कोशिका द्रव्य में छोड़ दिया जाता है, और सार्स-कोव2 स्पाइक प्रोटीन की अभिव्यक्ति रोगी कोशिकाओं में होती है। एस. आई. आर. एन. ए. दवाएँ। पेटिसिरन, 2018 में एफ. डी. ए. से नियामक अनुमोदन प्राप्त करने वाली पहली एस. आई. आर. एन. ए. आधारित दवा, लिपिड नैनोपार्टिकल फॉर्मूलेशन पर आधारित है जो ट्रांसथायरेटिन जीन के असामान्य रोगजनक रूप को शांत करने के लिए यकृत में एस. आई. आर. एन. ए. को पैक और वितरित करती है। चिकित्सीय एस. आई. आर. एन. ए. को 2 लिपिड उत्प्रेरक, डी. एल. आई. एन.-एम. सी. 3-डी. एम. ए. और पी. ई. जी. 2000-सी.-डी. एम. जी. के साथ एक लिपिड नैनोपार्टिकल में तैयार किया जाता है जो रोगी में अंतःशिरा रूप से डाला जाता है और यकृत में हेपेटोसाइट्स को लक्षित करता है। इसके अलावा, एस. आई. आर. एन. ए. चिकित्सीय में रासायनिक रूप से संशोधित न्यूक्लियोटाइड्स रासायनिक स्थिरता और प्रभावकारिता में सुधार करते हैं, कुछ प्रकार की कोशिकाओं को लक्षित करने में सहायता करते हैं, और प्रतिकूल प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रियाओं को कम करने का काम करते हैं। कोशिकीय ग्रहण में सुधार और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए छोटे अणुओं, कार्बोहाइड्रेट, एप्टेमर, पेप्टाइड्स और एंटीबॉडी सहित विभिन्न लिगेंडों को सहसंयोजक रूप से एस. आई. आर. एन. ए. से जोड़ा गया है। उदाहरण के लिए, गैलनैक-एस. आई. आर. एन. ए. संयुग्म न केवल कैशनिक सामग्री की आवश्यकता के बिना लिगैंड आधारित कोशिका आंतरिककरण के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं, बल्कि विशेष रूप से हेपेटोसाइट्स को भी लक्षित करते हैं। गैलएनएसी-एसआईआरएनए संयुग्मों को दूसरी एफडीए-अनुमोदित एसआईआरएनए दवा, गिवोसिरन में नियोजित किया गया था, जिसे यकृत में एएलएएस1 अभिव्यक्ति को कम करके तीव्र यकृत पोर्फिरिया के इलाज के लिए प्रशासित किया जाता है। एएसओ दवाएँ। पहली स्वीकृत एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (ए. एस. ओ.) दवा का अनावरण 1998 में फोमिविरसेन के साथ किया गया था, जो एक 21-मेर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड है जो साइटोमेगालोवायरस एम. आर. एन. ए. के अनुवाद को अवरुद्ध करता है। पूर्व-एम. आर. एन. ए. या एम. आर. एन. ए. को बांधकर, ए. एस. ओ. पूर्व-एम. आर. एन. ए. प्रसंस्करण और स्प्लिसिंग, प्रतिस्पर्धी अवरोध, ट्रांसलेशनल मशीनरी की स्टेरिक नाकाबंदी, और बाध्य लक्ष्य आर. एन. ए. के क्षरण सहित तंत्र के माध्यम से प्रोटीन संश्लेषण को प्रतिलेखन के बाद विनियमित कर सकते हैं। एएसओ न्यूक्लियोसाइड्स, न्यूक्लियोबेस और इंटरन्यूक्लियोसाइड बैकबोन के रासायनिक संशोधन लक्ष्य आत्मीयता और प्रभावकारिता बनाए रखते हुए फार्माकोकाइनेटिक्स और फार्माकोडायनामिक्स में सुधार के लिए महत्वपूर्ण हैं। चिकित्सीय रूप से प्रभावी एएसओ को भारी रूप से संशोधित किया जाता है, इसलिए उन्हें अंतःकोशिकीय वितरण के लिए वाहक की आवश्यकता नहीं होती है। अधिकांश चिकित्सकीय रूप से लागू एएसओ नग्न अणु होते हैं जो एंडोसाइटोसिस के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम होते हैं और अपने अंतःकोशिकीय लक्ष्य को बांधकर अपने चिकित्सीय प्रभाव डालते हैं। बेहतर वायरल वेक्टर। लगभग 70 प्रतिशत जीन चिकित्सा नैदानिक परीक्षणों ने जीन वितरण चरण के लिए वायरल वैक्टर का उपयोग किया है। एडेनोवायरस, एडेनो-संबद्ध वायरस (ए. ए. वी.) और लेंटिवायरल वैक्टर वर्तमान में जैव प्रौद्योगिकी और नैदानिक अनुप्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले मुख्य वायरल वैक्टर हैं। ए. ए. वी. वायरल वैक्टर में किए गए सुधारों का एक प्रमुख उदाहरण है। वेक्टर इंजीनियरिंग एएवी ट्रांसडक्शन दक्षता (ट्रांसजीन कैसेट को अनुकूलित करके), वेक्टर ट्रॉपिज्म (कैप्सिड इंजीनियरिंग का उपयोग करके) और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने के लिए कैप्सिड और ट्रांसजीन की क्षमता (इन घटकों को आनुवंशिक रूप से संशोधित करके) को बढ़ा सकती है, साथ ही एएवी के बड़े पैमाने पर उत्पादन को अनुकूलित कर सकती है। ए. ए. वी. इंजीनियरिंग के एक अन्य उदाहरण में, मशीन लर्निंग को ए. ए. वी. प्रकारों को उत्पन्न करने के लिए लागू किया गया है जो पिछले संपर्क से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दरकिनार कर सकते हैं। वायरस जैसे कण। वायरस जैसे कण (वी. एल. पी.) वायरल प्रोटीन की असेंबली हैं जो वायरल आनुवंशिक सामग्री के अलावा या उसके बजाय एम. आर. एन. ए., प्रोटीन या आर. एन. पी. जैसी कार्गो सामग्री को पैक करते हैं। चूँकि वी. एल. पी. मौजूदा वायरल स्कैफोल्ड से प्राप्त होते हैं, वे वायरस के प्राकृतिक गुणों का दोहन करते हैं जो कुशल इंट्रासेल्युलर वितरण को सक्षम करते हैं, जिसमें कार्गो को घेरने, एंडोसोम से बचने और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पुनः क्रमादेशित करने की उनकी क्षमता शामिल है। हालांकि, वायरस के विपरीत, वीएलपी अपने माल को डीएनए के बजाय एमआरएनए या प्रोटीन के रूप में वितरित कर सकते हैं, जो वायरल जीनोम एकीकरण के जोखिम को काफी कम कर देता है। वी. एल. पी. इस प्रकार जीन संपादन एजेंटों जैसे आणविक कार्गो वितरित करने के लिए रुचि रखते हैं क्योंकि वे वायरल और गैर-वायरल वितरण दोनों के लाभ प्रदान कर सकते हैं। इंजीनियर डीएनए-मुक्त वीएलपी को हाल ही में जीन संपादन के उद्देश्य से स्तनधारी कोशिकाओं को बेस एडिटर या कैस 9 रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन को कुशलता से पैकेज और वितरित करने के लिए दिखाया गया है। संदर्भ जीन वितरण जैव प्रौद्योगिकी