Massive parallel sequencing
बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण या बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण बड़े पैमाने पर समानांतर प्रसंस्करण की अवधारणा का उपयोग करके डी. एन. ए. अनुक्रमण के लिए कई उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोणों में से कोई भी है; इसे अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (एन. जी. एस.) या दूसरी पीढ़ी की अनुक्रमण भी कहा जाता है। इनमें से कुछ तकनीकें 1993 और 1998 के बीच उभरीं और 2005 से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। ये प्रौद्योगिकियां प्रति उपकरण रन 1 मिलियन से 43 बिलियन लघु पाठ (प्रत्येक 50 से 400 आधार) के अनुक्रमण के लिए लघु और समानांतर प्लेटफार्मों का उपयोग करती हैं। कई एन. जी. एस. प्लेटफॉर्म इंजीनियरिंग विन्यास और अनुक्रमण रसायन विज्ञान में भिन्न होते हैं। वे एक प्रवाह कोशिका में स्थानिक रूप से अलग, क्लोनली प्रवर्धित डीएनए टेम्पलेट या एकल डीएनए अणुओं के माध्यम से बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण के तकनीकी प्रतिमान को साझा करते हैं। यह डिज़ाइन सेंगर अनुक्रमण से बहुत अलग है-जिसे केशिका अनुक्रमण या पहली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में भी जाना जाता है-जो व्यक्तिगत अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं में उत्पादित श्रृंखला-समाप्ति उत्पादों के इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण पर आधारित है। यह पद्धति अनुक्रमण को बड़े पैमाने पर पूरा करने की अनुमति देती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एन. जी. एस. प्लेटफार्मों के साथ एन. जी. एस. प्लेटफॉर्म डी. एन. ए. अनुक्रमण आमतौर पर निम्नलिखित चरणों के साथ किया जाता है। सबसे पहले, डी. एन. ए. अनुक्रमण पुस्तकालय पी. सी. आर. इन विट्रो द्वारा क्लोनल प्रवर्धन द्वारा उत्पन्न होते हैं। दूसरा, डी. एन. ए. को संश्लेषण द्वारा अनुक्रमित किया जाता है, जैसे कि डी. एन. ए. अनुक्रम श्रृंखला-समाप्ति रसायन विज्ञान के बजाय पूरक स्ट्रैंड में न्यूक्लियोटाइड्स के जोड़ से निर्धारित किया जाता है। तीसरा, स्थानिक रूप से अलग किए गए, प्रवर्धित डीएनए टेम्पलेटों को एक भौतिक पृथक्करण चरण की आवश्यकता के बिना बड़े पैमाने पर समानांतर तरीके से एक साथ अनुक्रमित किया जाता है। अधिकांश एन. जी. एस. प्लेटफार्मों में इन चरणों का पालन किया जाता है, लेकिन प्रत्येक एक अलग रणनीति का उपयोग करता है। अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं का एन. जी. एस. समानांतरकरण एक एकल उपकरण में पढ़ने वाले न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के गीगाबेसों के लिए सैकड़ों मेगाबेसों को उत्पन्न करता है। इसने उपलब्ध अनुक्रम डेटा में भारी वृद्धि को सक्षम किया है और जैव चिकित्सा विज्ञानों में जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण को मौलिक रूप से बदल दिया है। नई उभरती हुई एन. जी. एस. प्रौद्योगिकियों और उपकरणों ने अनुक्रमण की लागत में 1000 डॉलर प्रति जीनोम अनुक्रमण के निशान के करीब महत्वपूर्ण कमी में योगदान दिया है। 2014 तक, बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण मंच व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और उनकी विशेषताओं को तालिका में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। जैसे-जैसे एन. जी. एस. प्रौद्योगिकियों की गति तेजी से बढ़ रही है, तकनीकी विनिर्देश और मूल्य निर्धारण में उतार-चढ़ाव आ रहा है। एकल-अंत अनुक्रमण के लिए प्रति रन रन समय और गीगाबेज़ (जी. बी.) आउटपुट नोट किए जाते हैं। युग्मित-अंत अनुक्रमण करते समय रन समय और आउटपुट लगभग दोगुना हो जाता है। ‡ रोश 454 और हेलिकोस बायोसाइंसेज प्लेटफार्मों के लिए औसत पढ़ने की लंबाई। एन. जी. एस. के लिए टेम्पलेट तैयार करने की विधियाँ एन. जी. एस. प्रतिक्रियाओं के लिए टेम्पलेट तैयार करने में दो विधियों का उपयोग किया जाता हैः एकल डी. एन. ए. अणुओं से उत्पन्न प्रवर्धित टेम्पलेट, और एकल डी. एन. ए. अणु टेम्पलेट। इमेजिंग सिस्टम के लिए जो एकल प्रतिदीप्ति घटनाओं का पता नहीं लगा सकते हैं, डीएनए टेम्प्लेट के प्रवर्धन की आवश्यकता होती है। तीन सबसे आम प्रवर्धन विधियाँ इमल्शन पी. सी. आर. (ई. एम. पी. सी. आर.), रोलिंग सर्कल और सॉलिड-फेज एम्पलीफिकेशन हैं। टेम्पलेटों का अंतिम वितरण स्थानिक रूप से यादृच्छिक या ग्रिड पर हो सकता है। इमल्शन पी. सी. आर. विधियों में, एक डी. एन. ए. पुस्तकालय पहले जीनोमिक डी. एन. ए. के यादृच्छिक विखंडन के माध्यम से उत्पन्न किया जाता है। एकल-फंसे डीएनए टुकड़े (टेम्पलेट) एडेप्टर या लिंकर के साथ मोतियों की सतह से जुड़े होते हैं, और एक मनका डीएनए लाइब्रेरी से एकल डीएनए टुकड़े से जुड़ा होता है। मोतियों की सतह में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच होती है जिसमें अनुक्रम होते हैं जो डी. एन. ए. के टुकड़ों को बांधने वाले सहायकों के पूरक होते हैं। इसके बाद मोतियों को जल-तेल पायस की बूंदों में विभाजित किया जाता है। जलीय जल-तेल पायस में, एक मोती को पकड़ने वाली प्रत्येक बूंद एक पी. सी. आर. सूक्ष्म रिएक्टर है जो एकल डी. एन. ए. टेम्पलेट की प्रवर्धित प्रतियों का उत्पादन करता है। ग्रिडेड रोलिंग सर्कल नैनोबॉल विलयन में रोलिंग सर्कल एम्पलीफिकेशन द्वारा एकल डी. एन. ए. अणुओं की आबादी के प्रवर्धन के बाद स्थिर होने के लिए डी. एन. ए. से छोटे आकार के धब्बों के ग्रिड पर कब्जा किया जाता है। डी. एन. ए. कॉलोनी जनरेशन (ब्रिज एम्पलीफिकेशन) फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर एक फ्लो सेल में स्लाइड के उच्च घनत्व पर सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। समर्थन पर टेम्पलेट के लिए प्राइमर का अनुपात प्रवर्धित समूहों के सतह घनत्व को परिभाषित करता है। प्रवाह कोशिका पोलीमरेज़-आधारित विस्तार के लिए अभिकर्मकों के संपर्क में आती है, और प्राइमिंग सतह पर एक पूरक ऑलिगो के लिए एक लिगेटेड टुकड़े "पुलों" के मुक्त/दूरस्थ छोर के रूप में होती है। बार-बार विकृतीकरण और विस्तार के परिणामस्वरूप प्रवाह कोशिका सतह पर लाखों अलग-अलग स्थानों पर डी. एन. ए. के टुकड़ों का स्थानीय प्रवर्धन होता है। ठोस-चरण प्रवर्धन 100-200 मिलियन स्थानिक रूप से अलग किए गए टेम्पलेट समूहों का उत्पादन करता है, जो मुक्त छोर प्रदान करता है जिसके लिए एक सार्वभौमिक अनुक्रमण प्राइमर को अनुक्रमण प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए संकरित किया जाता है। इस तकनीक को 1997 में ग्लैक्सो-वेलकम के जिनेवा बायोमेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट (जीबीआरआई) से पास्कल मेयर, एरिक कावाशिमा और लॉरेंट फरीनेली द्वारा पेटेंट के लिए दायर किया गया था और 1998 में पहली बार सार्वजनिक रूप से प्रस्तुत किया गया था। 1994 में क्रिस एडम्स और स्टीव क्रोन ने एक समान, लेकिन गैर-क्लोनल, सतह प्रवर्धन विधि पर एक पेटेंट दायर किया, जिसे 1997 में चर्च और मित्रा द्वारा क्लोनल प्रवर्धन के लिए अनुकूलित "ब्रिज प्रवर्धन" नाम दिया गया। एकल-अणु टेम्पलेट प्रोटोकॉल जिन्हें डी. एन. ए. प्रवर्धन की आवश्यकता होती है, अक्सर लागू करने के लिए बोझिल होते हैं और अनुक्रमण त्रुटियों को पेश कर सकते हैं। एकल-अणु टेम्पलेटों की तैयारी अधिक सीधी है और इसके लिए पी. सी. आर. की आवश्यकता नहीं होती है, जो प्रवर्धित टेम्पलेटों में त्रुटियों को पेश कर सकता है। ए. टी.-समृद्ध और जी. सी.-समृद्ध लक्ष्य अनुक्रम अक्सर प्रवर्धन पूर्वाग्रह दिखाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप जीनोम संरेखण और संयोजनों में उनका कम प्रतिनिधित्व होता है। एकल अणु टेम्पलेट आमतौर पर कम से कम तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों में से एक का उपयोग करके ठोस आधार पर स्थिर होते हैं। पहले दृष्टिकोण में, स्थानिक रूप से वितरित व्यक्तिगत प्राइमर अणु ठोस आधार से सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। टेम्पलेट, जिसे यादृच्छिक रूप से प्रारंभिक सामग्री को छोटे आकारों में विभाजित करके तैयार किया जाता है (उदाहरण के लिए, ~ 200-250 bp) और टुकड़े के सिरों में सामान्य एडेप्टर जोड़कर, फिर स्थिर प्राइमर में संकरित किया जाता है। दूसरे दृष्टिकोण में, स्थानिक रूप से वितरित एकल-अणु टेम्पलेट स्थिर प्राइमर से एकल-फंसे, एकल-अणु टेम्पलेटों को प्राइमिंग और विस्तारित करके ठोस समर्थन से सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। इसके बाद एक सामान्य प्राइमर को टेम्पलेट में संकरित किया जाता है। किसी भी दृष्टिकोण में, डी. एन. ए. पोलीमरेज़ एन. जी. एस. प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए स्थिर प्राथमिक टेम्पलेट विन्यास से जुड़ सकता है। उपरोक्त दोनों तरीकों का उपयोग हेलिकोस बायोसाइंसेज द्वारा किया जाता है। एक तीसरे दृष्टिकोण में, स्थानिक रूप से वितरित एकल पॉलीमरेज़ अणु ठोस आधार से जुड़े होते हैं, जिससे एक प्राथमिक टेम्पलेट अणु बंधा होता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग प्रशांत जैव विज्ञान द्वारा किया जाता है। इस तकनीक के साथ बड़े डी. एन. ए. अणुओं (दसियों हज़ार आधार जोड़े तक) का उपयोग किया जा सकता है और, पहले दो दृष्टिकोणों के विपरीत, तीसरे दृष्टिकोण का उपयोग वास्तविक समय विधियों के साथ किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप संभावित रूप से लंबे समय तक पढ़ा जा सकता है। अनुक्रमण दृष्टिकोण संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण संश्लेषण (एस. बी. एस.) द्वारा अनुक्रमिक अनुक्रमण का उद्देश्य डी. एन. ए. पॉलीमरेज़ द्वारा न्यूक्लियोटाइड के समावेश का पता लगाकर डी. एन. ए. नमूने के अनुक्रमण का निर्धारण करना है। एक इंजीनियर पोलीमरेज़ का उपयोग डीएनए के एकल स्ट्रैंड की एक प्रति को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है और प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के समावेश की निगरानी की जाती है। संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण के सिद्धांत को पहली बार 1993 में वर्णित किया गया था और कुछ वर्षों के बाद सुधार प्रकाशित किए गए थे। एस. बी. एस. के सभी अवतारों के लिए प्रमुख भाग अत्यधिक समान हैं और इसमें शामिल हैं (1) बाद के संकेत को बढ़ाने के लिए डी. एन. ए. का प्रवर्धन और डी. एन. ए. को एक ठोस आधार से अनुक्रमित करने के लिए संलग्न करना, (2) ठोस आधार पर एकल फंसे हुए डी. एन. ए. की पीढ़ी, (3) एक इंजीनियर पॉलीमरेज़ का उपयोग करके न्यूक्लियोटाइड्स का समावेश और (4) न्यूक्लियोटाइड के समावेश का पता लगाना। फिर 3-4 चरणों को दोहराया जाता है और अनुक्रम को चरण 4 में प्राप्त संकेतों से इकट्ठा किया जाता है। अनुक्रमण-द्वारा-संश्लेषण के इस सिद्धांत का उपयोग लगभग सभी बड़े समानांतर अनुक्रमण उपकरणों के लिए किया गया है, जिसमें 454, पैकबायो, आयनटोरेंट, इल्यूमिना और एमजीआई शामिल हैं। पायरोसीक्वेंसिंग के सिद्धांत को पहली बार 1993 में एक इंजीनियर डीएनए पोलीमरेज़ के साथ एक ठोस समर्थन को जोड़कर वर्णित किया गया था जिसमें 3 'से 5' एक्सोन्यूक्लीज़ गतिविधि (प्रूफ-रीडिंग) की कमी थी और फायरफ्लाई ल्यूसिफ़ेरेज़ का उपयोग करके लुमिनेसेंस रियल-टाइम डिटेक्शन किया गया था। संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण की सभी प्रमुख अवधारणाओं को पेश किया गया, जिसमें (1) बाद के संकेत को बढ़ाने के लिए डी. एन. ए. का प्रवर्धन और एक ठोस समर्थन के लिए अनुक्रमित (टेम्पलेट) किए जाने वाले डी. एन. ए. को संलग्न करना, (2) ठोस समर्थन पर एकल फंसे हुए डी. एन. ए. की पीढ़ी (3) एक इंजीनियर पॉलीमरेज़ का उपयोग करके न्यूक्लियोटाइड्स का समावेश और (4) वास्तविक समय में प्रकाश का पता लगाकर शामिल न्यूक्लियोटाइड का पता लगाना शामिल है। एक अनुवर्ती लेख में, अवधारणा को आगे विकसित किया गया था और 1998 में, एक लेख प्रकाशित किया गया था जिसमें लेखकों ने दिखाया था कि गैर-निगमित न्यूक्लियोटाइड्स को चौथे एंजाइम (एपिरेस) के साथ हटाया जा सकता है, जिससे संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण बिना आवश्यकता के किया जा सकता है। प्रतिवर्ती टर्मिनेटर रसायन विज्ञान द्वारा अनुक्रमण यह दृष्टिकोण एक चक्रीय विधि में प्रतिवर्ती टर्मिनेटर-बाउंड डी. एन. टी. पी. का उपयोग करता है जिसमें न्यूक्लियोटाइड निगमन, प्रतिदीप्ति इमेजिंग और दरार शामिल हैं। एक फ्लोरोसेंटली-लेबल टर्मिनेटर को चित्रित किया जाता है क्योंकि प्रत्येक डी. एन. टी. पी. को जोड़ा जाता है और फिर अगले आधार को शामिल करने की अनुमति देने के लिए विभाजित किया जाता है। ये न्यूक्लियोटाइड्स रासायनिक रूप से इस तरह से अवरुद्ध होते हैं कि प्रत्येक संयोजन एक अनूठी घटना है। एक इमेजिंग चरण प्रत्येक आधार निगमन चरण का अनुसरण करता है, फिर अवरुद्ध समूह को रासायनिक रूप से हटा दिया जाता है ताकि डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा अगले निगमन के लिए प्रत्येक स्ट्रैंड को तैयार किया जा सके। चरणों की यह श्रृंखला एक विशिष्ट संख्या में चक्रों के लिए जारी रहती है, जैसा कि उपयोगकर्ता-परिभाषित उपकरण सेटिंग्स द्वारा निर्धारित किया जाता है। 3 'अवरोधक समूहों को मूल रूप से या तो एंजाइमेटिक या रासायनिक उलट के रूप में माना गया था रासायनिक विधि सोलेक्सा और इल्यूमिना मशीनों का आधार रही है। प्रतिवर्ती टर्मिनेटर रसायन विज्ञान द्वारा अनुक्रमण एक चार-रंग चक्र हो सकता है जैसे कि इल्यूमिना/सोलेक्सा द्वारा उपयोग किया जाता है, या एक-रंग चक्र जैसे कि हेलिकोस बायोसाइंसेज द्वारा उपयोग किया जाता है। हेलिकोस बायोसाइंसेज ने "वर्चुअल टर्मिनेटर" का उपयोग किया, जो एक दूसरे न्यूक्लियोसाइड एनालॉग के साथ अनब्लॉक किए गए टर्मिनेटर हैं जो एक अवरोधक के रूप में कार्य करते हैं। इन टर्मिनेटरों में समूहों को समाप्त करने या रोकने के लिए उचित संशोधन होते हैं ताकि एकल आधार जोड़ के बाद डी. एन. ए. संश्लेषण समाप्त हो जाए। इस दृष्टिकोण में, अनुक्रम विस्तार प्रतिक्रिया पोलीमरेज़ द्वारा नहीं बल्कि डी. एन. ए. लाइगेज़ और या तो एक-आधार-एन्कोडेड जांच या दो-आधार-एन्कोडेड जांच द्वारा की जाती है। अपने सबसे सरल रूप में, एक प्रतिदीप्ति लेबल वाली जांच प्राथमिक टेम्पलेट से सटे अपने पूरक अनुक्रम में संकरित हो जाती है। फिर डी. एन. ए. लाइगेज को प्राइमर में डाई-लेबल वाली जांच में शामिल करने के लिए जोड़ा जाता है। गैर-लीगेटेड जांच को धोया जाता है, उसके बाद लीगेटेड जांच की पहचान निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग की जाती है। फ्लोरोसेंट डाई को हटाने के लिए क्लीवेबल प्रोब का उपयोग करके और बाद के बंधन चक्रों (जंजीर बंधन) के लिए 5′-PO4 समूह को पुनर्जीवित करके या टेम्पलेट (बिना जंजीर वाले बंधन) के लिए एक नए प्राइमर को हटाकर और संकरण करके चक्र को दोहराया जा सकता है। फॉस्फोलिंक्ड फ्लोरोसेंट न्यूक्लियोटाइड्स या रियल-टाइम सीक्वेंसिंग पैसिफिक बायोसाइंसेज वर्तमान में इस विधि का नेतृत्व कर रहा है। वास्तविक समय अनुक्रमण की विधि में डीएनए संश्लेषण के दौरान डाई-लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड्स के निरंतर समावेश की इमेजिंग शामिल हैः एकल डीएनए पॉलीमरेज़ अणु व्यक्तिगत शून्य-मोड वेवगाइड डिटेक्टर (जेडएमडब्ल्यू डिटेक्टर) की निचली सतह से जुड़े होते हैं जो अनुक्रम जानकारी प्राप्त कर सकते हैं जबकि फॉस्फोलिंक्ड न्यूक्लियोटाइड्स को बढ़ते प्राइमर स्ट्रैंड में शामिल किया जा रहा है। पैसिफिक बायोसाइंसेज एक अद्वितीय डी. एन. ए. पोलीमरेज़ का उपयोग करता है जो फॉस्फोलिंक्ड न्यूक्लियोटाइड्स को बेहतर ढंग से शामिल करता है और बंद गोलाकार टेम्पलेटों के अनुक्रम को सक्षम बनाता है। जबकि एकल-पढ़ने की सटीकता 87 प्रतिशत है, बहु-किलोबेस पढ़ने की लंबाई के साथ सर्वसम्मति की सटीकता 99.999% पर प्रदर्शित की गई है। 2015 में, पैसिफिक बायोसाइंसेज ने सीक्वल सिस्टम नामक एक नया अनुक्रमण उपकरण जारी किया, जो क्षमता को लगभग 6.5-fold बढ़ाता है। नैदानिक मेटाजेनॉमिक अनुक्रमण प्रथम पीढ़ी अनुक्रमण तीसरी पीढ़ी अनुक्रमण आर. एन. ए. वेग संदर्भ डी. एन. ए. अनुक्रमण विधियाँ भी देखें।