Nuclear magnetic resonance spectroscopy of nucleic acids
न्यूक्लिक एसिड एन. एम. आर. डीएनए या आर. एन. ए. जैसे न्यूक्लिक एसिड अणुओं की संरचना और गतिशीलता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग है। यह 100 न्यूक्लियोटाइड्स तक के अणुओं के लिए उपयोगी है, और 2003 तक, सभी ज्ञात आर. एन. ए. संरचनाओं में से लगभग आधे का निर्धारण एन. एम. आर. स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा किया गया था। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की तुलना में एन. एम. आर. के फायदे हैं, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन न्यूक्लिक एसिड संरचना निर्धारण के लिए दूसरी विधि है, जिसमें अणुओं को क्रिस्टल जाली के बजाय उनके प्राकृतिक समाधान अवस्था में देखा जा रहा है जो अणु के संरचनात्मक गुणों को प्रभावित कर सकता है। एन. एम. आर. के साथ गतिशीलता की जांच करना भी संभव है। यह क्रिस्टलोग्राफी की तुलना में थोड़ी कम सटीक और विस्तृत संरचनाओं की कीमत पर आता है। न्यूक्लिक एसिड एन. एम. आर. प्रोटीन एन. एम. आर. के समान तकनीकों का उपयोग करता है, लेकिन इसमें कई अंतर हैं। न्यूक्लिक एसिड में हाइड्रोजन परमाणुओं का एक छोटा प्रतिशत होता है, जो आमतौर पर एन. एम. आर. में देखे जाने वाले परमाणु होते हैं, और क्योंकि न्यूक्लिक एसिड डबल हेलिक्स कठोर और मोटे तौर पर रैखिक होते हैं, वे "लंबी दूरी" के सहसंबंध देने के लिए खुद पर वापस नहीं झुकते हैं। न्यूक्लिक एसिड में भी प्रोटीन की तुलना में एक छोटी सीमा पर प्रतिध्वनि वितरित होती है, जिससे स्पेक्ट्रा में संभावित रूप से अधिक भीड़ होती है और इसकी व्याख्या करना मुश्किल हो जाता है। प्रायोगिक विधियाँ द्वि-आयामी एन. एम. आर विधियाँ लगभग हमेशा न्यूक्लिक एसिड के साथ उपयोग की जाती हैं। इनमें बॉन्ड न्यूक्लियर कपलिंग्स का पता लगाने के लिए कोरिलेशन स्पेक्ट्रोस्कोपी (सी. ओ. एस. वाई.) और टोटल कोहेरेन्स ट्रांसफर स्पेक्ट्रोस्कोपी (टी. ओ. सी. एस. वाई.) और अंतरिक्ष में एक दूसरे के करीब होने वाले नाभिकों के बीच कपलिंग्स का पता लगाने के लिए न्यूक्लियर ओवरहॉजर इफेक्ट स्पेक्ट्रोस्कोपी (एन. ओ. ई. एस. वाई.) शामिल हैं। आमतौर पर न्यूक्लिक एसिड के साथ किए जाने वाले एन. एम. आर. के प्रकार 1एच. एन. एम. आर., 13सी. एन. एम. आर., 15एन. एन. एम. आर. और 31पी. एन. एम. आर. हैं। 19एफ एन. एम. आर. तब भी उपयोगी है जब 2 '-फ्लोरो-2'-डीऑक्सीएडेनोसिन जैसे गैर-प्राकृतिक न्यूक्लियोटाइड्स को न्यूक्लिक एसिड स्ट्रैंड में शामिल किया जाता है, क्योंकि प्राकृतिक न्यूक्लिक एसिड में कोई फ्लोरिन परमाणु नहीं होते हैं। 1एच और 31पी में लगभग 100% प्राकृतिक प्रचुरता है, जबकि 13सी और 15एन में कम प्राकृतिक प्रचुरता है। इन बाद के दो नाभिकों के लिए, अणुओं के भीतर वांछित परमाणुओं को समस्थानिक रूप से समृद्ध करने की क्षमता है, या तो समान रूप से या एक स्थान-विशिष्ट तरीके से। समस्थानिकीय रूप से समृद्ध वातावरण में उगाए गए बैक्टीरिया से प्राप्त डी. एन. टी. पी. या एन. टी. पी. का उपयोग करके पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया करके, 13सी और/या 15एन में समान रूप से समृद्ध न्यूक्लियोटाइड्स को जैव रासायनिक तरीकों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। स्थल-विशिष्ट समस्थानिक संवर्धन लेबल किए गए न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट मोनोमर और पूर्ण स्ट्रैंड के रासायनिक संश्लेषण के माध्यम से किया जाना चाहिए; हालाँकि इन्हें संश्लेषित करना मुश्किल और महंगा है। क्योंकि न्यूक्लिक एसिड में अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में प्रोटॉन होते हैं जो विलायक-विनिमेय होते हैं, न्यूक्लिक एसिड एन. एम. आर. आमतौर पर डी2ओ विलायक में नहीं किया जाता है जैसा कि अन्य प्रकार के एन. एम. आर. के साथ आम है। ऐसा इसलिए है क्योंकि विलायक में ड्यूटेरियम विनिमेय प्रोटॉनों को प्रतिस्थापित करेगा और उनके संकेत को बुझा देगा। एच2ओ का उपयोग एक विलायक के रूप में किया जाता है, और अन्य तरीकों का उपयोग मजबूत विलायक संकेत को समाप्त करने के लिए किया जाता है, जैसे कि सामान्य पल्स अनुक्रम ("प्रीसेचुरेशन") से पहले विलायक संकेत को संतृप्त करना, जो न्यूक्लिक एसिड प्रोटॉन के साथ संतृप्त विलायक प्रोटॉन के आदान-प्रदान को रोकने के लिए कम तापमान पर सबसे अच्छा काम करता है; या केवल रुचि की उत्तेजक अनुनाद ("चयनात्मक उत्तेजना"), जिसमें शिखर आयामों को विकृत करने का अतिरिक्त, संभावित रूप से अवांछित प्रभाव होता है। संरचना निर्धारण विनिमेय और गैर-विनिमेय प्रोटॉनों को आमतौर पर दो स्वतंत्र समूहों के रूप में उनके विशिष्ट शिखरों को सौंपा जाता है। विनिमेय प्रोटॉनों के लिए, जो अधिकांश भाग के लिए आधार युग्मन में शामिल प्रोटॉन हैं, एन. ओ. ई. एस. वाई. का उपयोग पड़ोसी आधारों के बीच थ्रू-स्पेस सहसंबंध खोजने के लिए किया जा सकता है, जिससे एक पूरे डुप्लेक्स अणु को अनुक्रमिक चलने के माध्यम से सौंपा जा सकता है। अपरिवर्तनीय प्रोटॉनों के लिए, जिनमें से कई न्यूक्लिक एसिड के शर्करा भाग पर होते हैं, COSY और TOCSY का उपयोग युग्मित नाभिक की प्रणालियों की पहचान करने के लिए किया जाता है, जबकि NOESY का उपयोग फिर से चीनी को आधार और प्रत्येक आधार को उसके पड़ोसी आधार से संबंधित करने के लिए किया जाता है। डुप्लेक्स डी. एन. ए. अपरिवर्तनीय प्रोटॉनों के लिए आधार पर एच6/एच8 प्रोटॉन पड़ोसी आधारों पर अपने समकक्षों और चीनी पर एच1 'प्रोटॉन से संबंधित होते हैं, जिससे क्रमिक चलने की अनुमति मिलती है। आर. एन. ए. के लिए, रासायनिक संरचना और हेलिक्स ज्यामिति में अंतर इस कार्य को तकनीकी रूप से अधिक कठिन बनाता है, लेकिन फिर भी संभव है। क्रमिक चलने की पद्धति गैर-दोहरी पेचदार नाभिकीय अम्ल संरचनाओं के लिए संभव नहीं है, न ही जेड-डीएनए रूप के लिए, जिससे अनुनाद का कार्य अधिक कठिन हो जाता है। स्पेक्ट्रम से लिए गए मापदंडों, मुख्य रूप से नोइसी क्रॉस-चोटियों और युग्मन स्थिरांक, का उपयोग स्थानीय संरचनात्मक विशेषताओं जैसे ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड कोण, डायहेड्रल कोण (कारप्लस समीकरण का उपयोग करके), और शुगर पकर अनुरूपण को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इमिनो प्रोटॉन अनुनाद की उपस्थिति या अनुपस्थिति, या हाइड्रोजन बंधन के पार 15N परमाणुओं के बीच युग्मन, बेसपेयरिंग की उपस्थिति या अनुपस्थिति को इंगित करता है। बड़े पैमाने की संरचना के लिए, इन स्थानीय मापदंडों को अन्य संरचनात्मक मान्यताओं या मॉडलों के साथ पूरक किया जाना चाहिए, क्योंकि दोहरे हेलिक्स को पार करने के साथ त्रुटियां जुड़ जाती हैं, और प्रोटीन के विपरीत, दोहरे हेलिक्स में एक कॉम्पैक्ट इंटीरियर नहीं होता है और यह खुद पर वापस नहीं मुड़ता है। हालांकि, लंबी दूरी की अभिविन्यास जानकारी एक माध्यम में अवशिष्ट द्विध्रुवीय युग्मन प्रयोगों के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है जो न्यूक्लिक एसिड अणुओं पर एक कमजोर संरेखण लगाता है। हाल ही में, न्यूक्लिक एसिड की संरचना निर्धारण के लिए ठोस-अवस्था एन. एम. आर. पद्धति शुरू की गई है। प्रोटोकॉल में दो दृष्टिकोण शामिल हैंः आर. एन. ए. का न्यूक्लियोटाइड-प्रकार चयनात्मक लेबलिंग और हेटेरोन्यूक्लियर सहसंबंध प्रयोगों का उपयोग। एन. एम. आर. गैर-मानक ज्यामिति जैसे कि मुड़े हुए हेलिक्स, गैर-वॉटसन-क्रिक बेसपेयरिंग और समाक्षीय स्टैकिंग की जांच के लिए भी उपयोगी है। यह प्राकृतिक आर. एन. ए. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की संरचना की जांच करने में विशेष रूप से उपयोगी रहा है, जो स्टेम-लूप और स्यूडोकनॉट्स जैसे जटिल संरचनाओं को अपनाते हैं। आर. एन. ए. और धातु आयनों के बीच अंतःक्रियाओं की जांच कई तरीकों से की जा सकती है, जिसमें आयन बंधन पर रासायनिक परिवर्तनों का अवलोकन, पैरामैग्नेटिक आयन प्रजातियों के लिए रेखा के विस्तार का अवलोकन और धातु आयनों की ऑर्गेनोमेटेलिक नकल के लिए अंतर-आणविक एन. ओ. ई. संपर्कों का अवलोकन शामिल है। एन. एम. आर. प्रोटीन या दवाओं जैसे अन्य अणुओं के साथ न्यूक्लिक एसिड अणुओं के बंधन की जांच करने के लिए भी उपयोगी है। यह रासायनिक-स्थानांतरण मानचित्रण द्वारा किया जा सकता है, जो यह देख रहा है कि दूसरे अणु के बंधन पर कौन से अनुनाद स्थानांतरित होते हैं, या पार-संतृप्ति प्रयोगों द्वारा जहां बाध्यकारी अणुओं में से एक चुनिंदा रूप से संतृप्त होता है और, यदि बंधा होता है, तो संतृप्ति परिसर में दूसरे अणु में स्थानांतरित हो जाती है। डुप्लेक्स-सिंगल स्ट्रैंड इक्विलिब्रिया और डुप्लेक्स के लिए अन्य अणुओं की बंधन दर जैसे गतिशील गुणों को स्पिन-जाली विश्राम समय T1 पर इसके प्रभाव से भी निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन ये विधियां 104-108 s−1 की मध्यवर्ती दरों के प्रति असंवेदनशील हैं, जिनकी ठोस-अवस्था एन. एम. आर. जैसी अन्य विधियों के साथ जांच की जानी चाहिए। एन. एम. आर. का उपयोग करके एक न्यूक्लिक एसिड डबल हेलिक्स जैसे झुकने और मुड़ने के यांत्रिक गुणों की गतिशीलता का भी अध्ययन किया जा सकता है। स्पंदित क्षेत्र प्रवणता एन. एम. आर. प्रयोगों का उपयोग प्रसार स्थिरांक को मापने के लिए किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड एन. एम. आर. अध्ययन 1971 की शुरुआत में किए गए थे, और आधार युग्मन अंतःक्रियाओं की जांच करने के लिए निम्न-क्षेत्र इमिनो प्रोटॉन अनुनाद का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया गया था। इन प्रारंभिक अध्ययनों ने टी. आर. एन. ए. पर ध्यान केंद्रित किया क्योंकि ये न्यूक्लिक एसिड उस समय पर्याप्त कम आणविक भार के साथ उपलब्ध एकमात्र नमूने थे जो एन. एम. आर. वर्णक्रमीय रेखा-चौड़ाई व्यावहारिक थे। अध्ययन ने निम्न-क्षेत्र प्रोटॉनों पर ध्यान केंद्रित किया क्योंकि वे एकमात्र प्रोटॉन थे जिन्हें उस समय उपलब्ध सर्वोत्तम स्पेक्ट्रोमीटरों का उपयोग करके जलीय घोल में विश्वसनीय रूप से देखा जा सकता था। यह जल्दी से महसूस किया गया कि निम्न-क्षेत्र इमिनो प्रोटॉनों का स्पेक्ट्रा समाधान में टी. आर. एन. ए. की तृतीयक संरचना के लिए सुराग प्रदान कर रहा था। डबल-हेलिकल डीएनए का पहला एन. एम. आर. स्पेक्ट्रम 1977 में एक सिंथेटिक, 30-बेस-पेयर डबल हेलिक्स का उपयोग करके प्रकाशित किया गया था। देशी डी. एन. ए. में गंभीर रेखा-विस्तार को दूर करने के लिए, डबल-हेलिकल डी. एन. ए. की दृढ़ता की लंबाई के बारे में जानने के लिए सरासर-विकृत प्राकृतिक डी. एन. ए. तैयार किया गया और अध्ययन किया गया। उसी समय, न्यूक्लियोसोम कोर कणों का अध्ययन किया गया ताकि डबल हेलिक्स के लचीलेपन की और जानकारी प्राप्त की जा सके। पहला एन. एम. आर. स्पेक्ट्रा एक समान कम आणविक भार देशी-अनुक्रम डी. एन. ए. के लिए रिपोर्ट किया गया था, जो प्रतिबंध एंजाइमों के साथ बनाया गया था, 1981 में रिपोर्ट किया गया था। यह कार्य उच्च क्षेत्र में प्राप्त न्यूक्लिक एसिड एन. एम. आर. स्पेक्ट्रा की पहली रिपोर्ट भी थी। दो आयामी एन. एम. आर. अध्ययन 1982 में रिपोर्ट किए जाने लगे और फिर, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण और अधिक परिष्कृत उपकरण के आगमन के साथ, 1983 में शुरू होने वाले कई विस्तृत संरचनात्मक अध्ययनों की सूचना दी गई। संदर्भ परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी न्यूक्लिक एसिड जैवभौतिकी