ELISA
एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (ELISA) (,) एक सामान्य रूप से उपयोग किया जाने वाला विश्लेषणात्मक जैव रसायन परख है, जिसे पहली बार 1971 में ईवा एंगवाल और पीटर पर्लमैन द्वारा वर्णित किया गया था। परख एक ठोस-चरण प्रकार के एंजाइम इम्यूनोएसे (ई. आई. ए.) का उपयोग करता है ताकि तरल नमूने में एक लिगैंड (आमतौर पर एक प्रोटीन) की उपस्थिति का पता लगाया जा सके और प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सके। एलिसा का उपयोग चिकित्सा, पादप विकृति विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में एक नैदानिक उपकरण के रूप में किया गया है, साथ ही विभिन्न उद्योगों में गुणवत्ता नियंत्रण जांच के रूप में भी किया गया है। एलिसा के सबसे सरल रूप में, परीक्षण किए जाने वाले नमूने से एंटीजन एक सतह से जुड़े होते हैं। फिर, सतह पर एक मेल खाने वाली एंटीबॉडी लगाई जाती है ताकि यह एंटीजन को बांध सके। इस एंटीबॉडी को एक एंजाइम से जोड़ा जाता है और फिर किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी को हटा दिया जाता है। अंतिम चरण में, एंजाइम के सब्सट्रेट वाले पदार्थ को जोड़ा जाता है। यदि बंधन था, तो बाद की प्रतिक्रिया एक पता लगाने योग्य संकेत उत्पन्न करती है, जो आमतौर पर एक रंग परिवर्तन होता है। एलिसा करने में एक विशेष प्रतिजन के लिए विशिष्टता के साथ कम से कम एक एंटीबॉडी शामिल होती है। एंटीजन की एक अज्ञात मात्रा के साथ नमूने को एक ठोस आधार (आमतौर पर एक पॉलीस्टीरिन माइक्रोटाइटर प्लेट) पर या तो गैर-विशेष रूप से (सतह पर अवशोषण के माध्यम से) या विशेष रूप से (उसी एंटीजन के लिए विशिष्ट किसी अन्य एंटीबॉडी द्वारा "सैंडविच" एलिसा में कैप्चर करने के माध्यम से) स्थिर किया जाता है। एंटीजन के स्थिर होने के बाद, डिटेक्शन एंटीबॉडी को जोड़ा जाता है, जिससे एंटीजन के साथ एक कॉम्प्लेक्स बनता है। डिटेक्शन एंटीबॉडी को सहसंयोजक रूप से एक एंजाइम से जोड़ा जा सकता है या स्वयं एक माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जा सकता है जो जैव संयोजन के माध्यम से एक एंजाइम से जुड़ा होता है। प्रत्येक चरण के बीच, प्लेट को आम तौर पर किसी भी प्रोटीन या एंटीबॉडी को हटाने के लिए एक हल्के डिटर्जेंट समाधान से धोया जाता है जो गैर-विशेष रूप से बंधे होते हैं। अंतिम धोने के चरण के बाद, प्लेट को एक दृश्यमान संकेत उत्पन्न करने के लिए एक एंजाइमेटिक सब्सट्रेट जोड़कर विकसित किया जाता है, जो नमूने में एंटीजन की मात्रा को इंगित करता है। ध्यान देने योग्य बात यह है कि एलिसा सख्ती से "इम्यूनो" परख के बजाय लिगैंड बाइंडिंग परख के अन्य रूपों का प्रदर्शन कर सकता है, हालांकि इस विधि के सामान्य उपयोग और विकास के इतिहास के कारण नाम में मूल "इम्यूनो" था। तकनीक के लिए अनिवार्य रूप से किसी भी लिगेटिंग अभिकर्मक की आवश्यकता होती है जिसे ठोस चरण पर एक डिटेक्शन अभिकर्मक के साथ स्थिर किया जा सकता है जो विशेष रूप से बांध देगा और एक संकेत उत्पन्न करने के लिए एक एंजाइम का उपयोग करेगा जिसे ठीक से परिमाणित किया जा सकता है। धोने के बीच में, केवल लिगैंड और इसके विशिष्ट बाध्यकारी समकक्ष ठोस चरण में एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन द्वारा विशेष रूप से बंधे या "इम्यूनोसोर्ब्ड" रहते हैं, जबकि गैर-विशिष्ट या अनबाउंड घटक धोए जाते हैं। अन्य स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक वेट लैब परख प्रारूपों के विपरीत जहां एक ही प्रतिक्रिया अच्छी तरह से (जैसे, एक क्यूवेट) धोने के बाद पुनः उपयोग किया जा सकता है, एलिसा प्लेटों में प्रतिक्रिया उत्पाद ठोस चरण पर प्रतिरक्षित होते हैं, जो प्लेट का हिस्सा होता है, और इसलिए आसानी से पुनः प्रयोज्य नहीं होते हैं। सिद्धांत एक विश्लेषणात्मक जैव रसायन परख और एक "वेट लैब" तकनीक के रूप में, एलिसा में एक तरल नमूने में एक विश्लेषक (यानी, विशिष्ट पदार्थ जिसकी उपस्थिति का मात्रात्मक या गुणात्मक रूप से विश्लेषण किया जा रहा है) का पता लगाना शामिल है जो विश्लेषण के दौरान तरल अभिकर्मकों का उपयोग करना जारी रखता है (यानी, जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का नियंत्रित अनुक्रम जो एक संकेत उत्पन्न करेगा जिसे आसानी से परिमाणित किया जा सकता है और नमूने में विश्लेषक की मात्रा के माप के रूप में व्याख्या की जा सकती है) जो तरल रहता है और प्रतिक्रिया कक्ष के अंदर रहता है या अभिकारकों को रखने के लिए अच्छी तरह से आवश्यक होता है। यह "ड्राई लैब" तकनीकों के विपरीत है जो ड्राई स्ट्रिप्स का उपयोग करती हैं। भले ही नमूना तरल हो (उदाहरण के लिए, एक मापी गई छोटी बूंद), "शुष्क" विश्लेषण में अंतिम पहचान चरण में रिफ्लेक्टोमेट्री जैसी विधियों द्वारा एक सूखी पट्टी को पढ़ना शामिल है और नमूनों के बीच स्पिलओवर या मिश्रण को रोकने के लिए प्रतिक्रिया नियंत्रण कक्ष की आवश्यकता नहीं होती है। एक विषम परीक्षण के रूप में, एलिसा कुछ घटकों को एक ठोस चरण पर अवशोषित करके विश्लेषणात्मक प्रतिक्रिया मिश्रण के कुछ घटक को अलग करता है जो भौतिक रूप से स्थिर होता है। एलिसा में, एक तरल नमूने को विशेष बंधन गुणों के साथ एक स्थिर ठोस चरण में जोड़ा जाता है और उसके बाद कई तरल अभिकर्मकों को जोड़ा जाता है जिन्हें क्रमिक रूप से जोड़ा जाता है, ऊष्मायन किया जाता है और धोया जाता है, इसके बाद कुएं में अंतिम तरल में कुछ ऑप्टिकल परिवर्तन (जैसे, एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के उत्पाद द्वारा रंग विकास) होता है जिससे विश्लेषक की मात्रा को मापा जाता है। मात्रात्मक "रीडिंग" आमतौर पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा संचारित प्रकाश की तीव्रता का पता लगाने पर आधारित होती है, जिसमें तरल के माध्यम से प्रकाश की कुछ विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के संचरण की मात्रा शामिल होती है (साथ ही साथ एकाधिक-कुएं प्लेट प्रारूप में कुएं के पारदर्शी तल)। पता लगाने की संवेदनशीलता विश्लेषणात्मक प्रतिक्रियाओं के दौरान संकेत के प्रवर्धन पर निर्भर करती है। चूंकि एंजाइम प्रतिक्रियाएं बहुत प्रसिद्ध प्रवर्धन प्रक्रियाएं हैं, इसलिए संकेत एंजाइमों द्वारा उत्पन्न होता है जो सटीक मात्रा की अनुमति देने के लिए निश्चित अनुपात में पता लगाने वाले अभिकर्मकों से जुड़े होते हैं, और इस प्रकार इसका नाम "एंजाइम-लिंक्ड" है। एनालाइट को लिगैंड भी कहा जाता है क्योंकि यह विशेष रूप से एक पहचान अभिकर्मक को बांधता है या लिगेट करता है, इस प्रकार एलिसा लिगैंड बाइंडिंग परख की बड़ी श्रेणी के अंतर्गत आता है। लिगैंड-विशिष्ट बंधन अभिकर्मक को "स्थिर" किया जाता है, अर्थात, आमतौर पर पारदर्शी तल पर लेपित और सुखाया जाता है और कभी-कभी एक कुएं की बगल की दीवार पर भी (ठोस सूक्ष्म कणों/मोतियों के विपरीत स्थिर "ठोस चरण"/"ठोस सब्सट्रेट" जिसे धोया जा सकता है), जिसे आमतौर पर "एलिसा प्लेट" के रूप में जानी जाने वाली कई कुएं वाली प्लेट के रूप में बनाया जाता है। पारंपरिक रूप से, इम्यूनोऐसे के अन्य रूपों की तरह, एंटीजन-एंटीबॉडी प्रकार की प्रतिक्रिया की विशिष्टता का उपयोग किया जाता है क्योंकि अभिकर्मक के रूप में एक एंटीजन के खिलाफ विशेष रूप से एंटीबॉडी को बढ़ाना आसान होता है। वैकल्पिक रूप से, यदि एनालाइट स्वयं एक एंटीबॉडी है, तो इसके लक्षित एंटीजन का उपयोग बाध्यकारी अभिकर्मक के रूप में किया जा सकता है। एलिसा के विकास से पहले, इम्यूनोऐसे करने का एकमात्र विकल्प रेडियोइम्युनोऐसे था, जो रेडियोधर्मी रूप से लेबल किए गए एंटीजन या एंटीबॉडी का उपयोग करने वाली एक तकनीक थी। रेडियोइम्युनोऐसे में, रेडियोधर्मिता संकेत प्रदान करती है, जो इंगित करती है कि नमूने में एक विशिष्ट प्रतिजन या एंटीबॉडी मौजूद है या नहीं। रेडियोइम्युनोएसे का वर्णन पहली बार 1960 में प्रकाशित रोज़लीन सुसमैन यालो और सोलोमन बर्सन द्वारा एक वैज्ञानिक पत्र में किया गया था। चूंकि रेडियोधर्मिता एक संभावित स्वास्थ्य खतरा है, इसलिए एक सुरक्षित विकल्प की तलाश की गई। रेडियोइम्युनोऐसे के लिए एक उपयुक्त विकल्प रेडियोधर्मी संकेत के स्थान पर एक गैर-रेडियोधर्मी संकेत को प्रतिस्थापित करेगा। जब एंजाइम (जैसे हॉर्सराडिश पेरोक्सीडेस) उपयुक्त सब्सट्रेट (जैसे एबीटीएस या टीएमबी) के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, तो रंग में परिवर्तन होता है, जिसका उपयोग संकेत के रूप में किया जाता है। हालांकि, संकेत एंटीबॉडी या एंटीजन की उपस्थिति से जुड़ा होना चाहिए, यही कारण है कि एंजाइम को एक उपयुक्त एंटीबॉडी से जोड़ा जाना चाहिए। इस जोड़ने की प्रक्रिया को स्वतंत्र रूप से स्ट्रैटिस अवरामेस और जी. बी. द्वारा विकसित किया गया था। पियर्स। चूँकि धो कर किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी या एंटीजन को निकालना आवश्यक है, इसलिए एंटीबॉडी या एंटीजन को कंटेनर की सतह पर लगाया जाना चाहिए; यानी, इम्यूनोसॉर्बेंट तैयार किया जाना चाहिए। इसे पूरा करने के लिए एक तकनीक 1966 में वाइड और जर्केर पोराथ द्वारा प्रकाशित की गई थी। 1971 में, स्वीडन में स्टॉकहोम विश्वविद्यालय में पीटर पर्लमैन और ईवा एंगवाल और नीदरलैंड में एंटोन शूर्स और बाउक वैन वीमेन ने स्वतंत्र रूप से ऐसे शोध पत्र प्रकाशित किए जिन्होंने इस ज्ञान को ई. आई. ए./ई. एल. आई. एस. ए. करने के तरीकों में संश्लेषित किया। पारंपरिक एलिसा में आम तौर पर क्रोमोजेनिक रिपोर्टर और सब्सट्रेट शामिल होते हैं जो एंटीजन या एनालाइट की उपस्थिति को इंगित करने के लिए किसी प्रकार के अवलोकन योग्य रंग परिवर्तन का उत्पादन करते हैं। नई एलिसा जैसी तकनीकें मात्रात्मक संकेत बनाने के लिए फ्लोरोजेनिक, इलेक्ट्रोकेमिल्युमिनेसेंट और मात्रात्मक पीसीआर रिपोर्टर का उपयोग करती हैं। इन नए संवाददाताओं के विभिन्न लाभ हो सकते हैं, जिनमें उच्च संवेदनशीलता और बहुगुणन शामिल हैं। तकनीकी शब्दों में, इस प्रकार के नए परख सख्ती से एलिसा नहीं हैं, क्योंकि वे "एंजाइम-लिंक्ड" नहीं हैं, बल्कि इसके बजाय कुछ गैर-एंजाइमेटिक रिपोर्टर से जुड़े हैं। हालाँकि, यह देखते हुए कि इन परीक्षणों में सामान्य सिद्धांत काफी हद तक समान हैं, उन्हें अक्सर ELISA के समान श्रेणी में वर्गीकृत किया जाता है। 2012 में, एक क्रोमोजेनिक रिपोर्टर के रूप में नैनोकणों का उपयोग करते हुए एक अतिसंवेदनशील, एंजाइम-आधारित एलिसा परीक्षण एनालाइट के मात्र एटोग्राम का पता लगाने से एक नग्न-आंख रंग संकेत देने में सक्षम था। सकारात्मक परिणाम के लिए नीला रंग और नकारात्मक के लिए लाल रंग दिखाई देता है। ध्यान दें कि यह पहचान केवल एनालाइट की उपस्थिति या अनुपस्थिति की पुष्टि कर सकती है, न कि वास्तविक सांद्रता की। प्रकार विशेष अणुओं के लिए कई एलिसा परीक्षण हैं जो मिलान करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं। ई. एल. आई. एस. ए. परीक्षणों को कई प्रकार के परीक्षणों में विभाजित किया जाता है जो इस बात पर आधारित होते हैं कि कैसे विश्लेषक और एंटीबॉडी को बांधा जाता है और उनका उपयोग किया जाता है। प्रमुख प्रकारों का वर्णन यहाँ किया गया है। प्रत्यक्ष एलिसा के चरण नीचे दिए गए तंत्र का पालन करते हैंः परीक्षण किए जाने वाले प्रतिजन का एक बफर घोल एक माइक्रोटाइटर प्लेट के प्रत्येक कुएं (आमतौर पर 96-कुएं वाली प्लेट) में जोड़ा जाता है, जहां इसे चार्ज इंटरैक्शन के माध्यम से प्लास्टिक का पालन करने का समय दिया जाता है। गैर-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन का एक घोल, जैसे बोवाइन सीरम एल्बुमिन या कैसिइन, प्रत्येक कुएं में डाला जाता है ताकि कुएं में किसी भी प्लास्टिक की सतह को ढका जा सके जो प्रतिजन द्वारा अप्रलेप रहता है। एक संलग्न (संयुग्मित) एंजाइम के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ा जाता है, जो विशेष रूप से परीक्षण एंटीजन कोटिंग कुएं से जुड़ता है। फिर इस एंजाइम के लिए एक सब्सट्रेट जोड़ा जाता है। अक्सर, यह सब्सट्रेट एंजाइम के साथ प्रतिक्रिया पर रंग बदलता है। सीरम में मौजूद प्राथमिक एंटीबॉडी की सांद्रता जितनी अधिक होगी, रंग उतना ही मजबूत होगा। अक्सर, एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग रंग शक्ति के लिए मात्रात्मक मूल्य देने के लिए किया जाता है। एन्जाइम एक प्रवर्धक के रूप में कार्य करता है; भले ही केवल कुछ एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी बंधे रहें, एंजाइम अणु कई संकेत अणुओं का उत्पादन करेंगे। सामान्य ज्ञान की सीमाओं के भीतर, एंजाइम अनिश्चित काल तक रंग का उत्पादन कर सकता है, लेकिन जितना अधिक एंटीबॉडी बंधा होगा, उतनी ही तेजी से रंग विकसित होगा। प्रत्यक्ष एलिसा का एक बड़ा नुकसान यह है कि प्रतिजन स्थिरीकरण की विधि विशिष्ट नहीं है; जब सीरम का उपयोग परीक्षण प्रतिजन के स्रोत के रूप में किया जाता है, तो नमूने में सभी प्रोटीन माइक्रोटाइटर प्लेट से अच्छी तरह से चिपक सकते हैं, इसलिए सीरम में एनालाइट की छोटी सांद्रता को कुएं की सतह से जुड़ते समय अन्य सीरम प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा करनी चाहिए। सैंडविच या अप्रत्यक्ष एलिसा इस समस्या का समाधान प्रदान करता है, इसे सीरम के आणविक मिश्रण से बाहर निकालने के लिए परीक्षण प्रतिजन के लिए विशिष्ट "कैप्चर" एंटीबॉडी का उपयोग करके। एलिसा को गुणात्मक या मात्रात्मक प्रारूप में चलाया जा सकता है। गुणात्मक परिणाम एक नमूने के लिए एक सरल सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम (हाँ या नहीं) प्रदान करते हैं। सकारात्मक और नकारात्मक के बीच की कटौती विश्लेषक द्वारा निर्धारित की जाती है और सांख्यिकीय हो सकती है। दो या तीन गुना मानक विचलन (एक परीक्षण में निहित त्रुटि) का उपयोग अक्सर सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों में अंतर करने के लिए किया जाता है। मात्रात्मक एलिसा में, नमूने के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) की तुलना एक मानक वक्र से की जाती है, जो आमतौर पर लक्ष्य अणु के ज्ञात-सांद्रता समाधान का एक क्रमिक मंदन होता है। उदाहरण के लिए, यदि एक परीक्षण नमूना 1 का OD देता है, तो मानक वक्र पर वह बिंदु जो OD = 1 देता है, नमूना के समान विश्लेषणात्मक सांद्रता का होना चाहिए। "अप्रत्यक्ष एलिसा" और "प्रत्यक्ष एलिसा" नामों का उपयोग और अर्थ प्रयोग के संदर्भ के आधार पर साहित्य और वेब साइटों पर भिन्न होता है। जब एक प्रतिजन की उपस्थिति का विश्लेषण किया जाता है, तो "प्रत्यक्ष एलिसा" नाम एक एलिसा को संदर्भित करता है जिसमें केवल एक लेबल वाले प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, और "अप्रत्यक्ष एलिसा" शब्द एक एलिसा को संदर्भित करता है जिसमें एंटीजन प्राथमिक एंटीबॉडी से बंधा होता है जिसे फिर एक लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है। बाद के मामले में एक सैंडविच एलिसा स्पष्ट रूप से एक अप्रत्यक्ष एलिसा से अलग है। जब "प्राथमिक" एंटीबॉडी दिलचस्प होती है, उदाहरण के लिए। टीकाकरण विश्लेषण के मामले में, इस एंटीबॉडी का सीधे माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है और "अप्रत्यक्ष एलिसा" शब्द दो एंटीबॉडी के साथ एक सेटिंग पर लागू होता है। सैंडविच एलिसा ए "सैंडविच" एलिसा का उपयोग नमूना प्रतिजन का पता लगाने के लिए किया जाता है। चरण हैंः एक सतह को ज्ञात मात्रा में कैप्चर एंटीबॉडी के साथ तैयार किया जाता है। सतह पर किसी भी गैर-विशिष्ट बंधन स्थल को अवरुद्ध कर दिया जाता है। एंटीजन युक्त नमूने को प्लेट पर लगाया जाता है, और एंटीबॉडी द्वारा पकड़ा जाता है। अनबाउंड एंटीजन को हटाने के लिए प्लेट को धोया जाता है। एक विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ा जाता है, और एंटीजन से जुड़ जाता है (इसलिए 'सैंडविच': एंटीजन दो एंटीबॉडी के बीच अटक जाता है)। यह प्राथमिक एंटीबॉडी एक दाता के सीरम में हो सकती है, जिसका एंटीजन के प्रति प्रतिक्रियाशीलता के लिए परीक्षण किया जा सकता है। एंजाइम-लिंक्ड सेकेंडरी एंटीबॉडीज को डिटेक्शन एंटीबॉडीज के रूप में लागू किया जाता है, जो विशेष रूप से एंटीबॉडी के एफ. सी. क्षेत्र (गैर-विशिष्ट) से जुड़ते हैं। प्लेट को अनबाउंड एंटीबॉडी-एंजाइम संयुग्मों को हटाने के लिए धोया जाता है। एन्जाइम द्वारा रंग, प्रतिदीप्ति या विद्युत रासायनिक संकेत में परिवर्तित करने के लिए एक रसायन जोड़ा जाता है। प्लेट के कुओं के अवशोषण, प्रतिदीप्ति, या विद्युत रासायनिक संकेत (जैसे, धारा) को प्रतिजन की उपस्थिति और मात्रा निर्धारित करने के लिए मापा जाता है। दाहिनी ओर की छवि में एक एंजाइम के साथ संयुग्मित एक द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग शामिल है, हालांकि, तकनीकी अर्थ में, यह आवश्यक नहीं है यदि प्राथमिक एंटीबॉडी को एक एंजाइम (जो प्रत्यक्ष एलिसा होगा) के साथ संयुग्मित किया जाता है। हालांकि, एक द्वितीयक-एंटीबॉडी संयुग्म का उपयोग प्रत्येक प्रतिजन के लिए एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी बनाने की महंगी प्रक्रिया से बचाता है जिसका कोई पता लगाना चाहता है। एक एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी का उपयोग करके जो अन्य एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र को बांधता है, इसी एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी का उपयोग विभिन्न स्थितियों में किया जा सकता है। "कैप्चर" एंटीबॉडी की पहली परत के बिना, नमूने में कोई भी प्रोटीन (सीरम प्रोटीन सहित) प्लेट की सतह पर प्रतिस्पर्धी रूप से अवशोषित हो सकता है, जिससे स्थिर एंटीजन की मात्रा कम हो जाती है। प्रतिजन को प्लास्टिक से जोड़ने के लिए शुद्ध विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग माप से पहले जटिल मिश्रणों से प्रतिजन को शुद्ध करने की आवश्यकता को समाप्त करता है, परख को सरल बनाता है, और परख की विशिष्टता और संवेदनशीलता को बढ़ाता है। इसलिए, अनुसंधान के लिए उपयोग किए जाने वाले सैंडविच एलिसा को अक्सर सत्यापन की आवश्यकता होती है, ताकि गलत सकारात्मक परिणामों के जोखिम को कम किया जा सके। प्रतिस्पर्धात्मक एलिसा एलिसा का तीसरा उपयोग प्रतिस्पर्धी बंधन के माध्यम से किया जाता है। इस एलिसा के लिए कदम पहले दो उदाहरणों से कुछ अलग हैंः अनलेबल्ड एंटीबॉडी को इसके एंटीजन (नमूना) की उपस्थिति में इनक्यूबेट किया जाता है। इन बद्ध एंटीबॉडी/एंटीजन परिसरों को फिर एक एंटीजन-लेपित कुएं में जोड़ा जाता है। प्लेट को धोया जाता है, इसलिए अनबाउंड एंटीबॉडी को हटा दिया जाता है। (नमूने में जितना अधिक प्रतिजन होता है, उतना ही अधिक एजी-एब परिसर बनते हैं और इसलिए कुएं में प्रतिजन से जुड़ने के लिए कम अनबाउंड एंटीबॉडी उपलब्ध होते हैं, इसलिए "प्रतिस्पर्धा" होती है।) प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट द्वितीयक एंटीबॉडी को जोड़ा जाता है। यह दूसरा एंटीबॉडी एंजाइम से जुड़ा होता है। एक सब्सट्रेट जोड़ा जाता है, और शेष एंजाइम एक क्रोमोजेनिक या फ्लोरोसेंट संकेत निकालते हैं। संकेत की अंतिम संतृप्ति को रोकने के लिए प्रतिक्रिया को रोक दिया जाता है। कुछ प्रतिस्पर्धी एलिसा किटों में एंजाइम-लिंक्ड एंटीबॉडी के बजाय एंजाइम-लिंक्ड एंटीजन शामिल हैं। लेबल वाला एंटीजन नमूना एंटीजन (बिना लेबल वाला) के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी बाइंडिंग साइटों के लिए प्रतिस्पर्धा करता है। नमूने में जितना कम प्रतिजन होता है, उतना ही अधिक लेबल वाला प्रतिजन कुएं में बना रहता है और संकेत उतना ही मजबूत होता है। आम तौर पर, प्रतिजन को पहले कुएं में नहीं रखा जाता है। एचआईवी एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए, माइक्रोटाइटर प्लेट के कुओं को एचआईवी एंटीजन के साथ लेपित किया जाता है। दो विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, एक एंजाइम के साथ संयुग्मित होता है और दूसरा सीरम में मौजूद होता है (यदि सीरम एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक है)। एक ही प्रतिजन के लिए दो एंटीबॉडी के बीच संचयी प्रतिस्पर्धा होती है, जिससे एक मजबूत संकेत देखा जाता है। परीक्षण किए जाने वाले सेरा को इन कुओं में मिलाया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है, और फिर धोया जाता है। यदि एंटीबॉडी मौजूद हैं, तो एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया होती है। एंजाइम-लेबल वाले विशिष्ट एच. आई. वी. एंटीबॉडी के लिए कोई प्रतिजन नहीं बचा है। ये एंटीबॉडी जोड़ने पर मुक्त रहते हैं और धोने के दौरान धोए जाते हैं। सब्सट्रेट जोड़ा जाता है, लेकिन इस पर कार्य करने के लिए कोई एंजाइम नहीं होता है, इसलिए एक सकारात्मक परिणाम कोई रंग परिवर्तन नहीं दिखाता है। रिवर्स एलिसा (अप्रत्यक्ष एलिसा) एक चौथा एलिसा परीक्षण पारंपरिक कुओं का उपयोग नहीं करता है। यह परीक्षण एंटीजन को परीक्षण द्रव में निलंबित कर देता है। बिना लेबल वाले एंटीबॉडी को इसके एंटीजन (नमूना) की उपस्थिति में ऊष्मायन किया जाता है, एंटीबॉडी को एंटीजन से बांधने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त ऊष्मायन अवधि प्रदान की जाती है। फिर नमूने को मैला ढोने वाले पात्र के माध्यम से पारित किया जाता है। यह एक परीक्षण नली या चैनल के माध्यम से विशेष रूप से डिज़ाइन किया गया प्रवाह हो सकता है। स्कैवेंजर कंटेनर या चैनल की सतह पर "स्कैवेंजर एंटीजेन्स" बंधे होते हैं। ये प्राथमिक एंटीजन के समान या पर्याप्त रूप से समान हो सकते हैं जिन्हें मुक्त एंटीबॉडी बांधेंगे। स्कैवेंजर कंटेनर में पर्याप्त सतह क्षेत्र और पर्याप्त समय होना चाहिए ताकि स्कैवेंजर एंटीजन को नमूने में पेश किए गए सभी अतिरिक्त एंटीबॉडी से बांधने की अनुमति मिल सके। नमूना, जिसमें अब टैग किए गए और बाध्य एंटीबॉडी होते हैं, एक डिटेक्टर के माध्यम से पारित किया जाता है। यह उपकरण एक फ्लो साइटोमीटर या अन्य उपकरण हो सकता है जो टैग को रोशन करता है और प्रतिक्रिया को पंजीकृत करता है। यह परीक्षण एक ही समय में कई प्रतिजनों को चिह्नित करने और गिनने की अनुमति देता है। यह बैक्टीरिया के विशिष्ट उपभेदों को दो (या अधिक) अलग-अलग रंग टैग द्वारा पहचाने जाने की अनुमति देता है। यदि दोनों टैग एक कोशिका पर मौजूद हैं, तो कोशिका वह विशिष्ट तनाव है। यदि केवल एक मौजूद है, तो ऐसा नहीं है। यह परीक्षण आम तौर पर एक बार में एक बार किया जाता है और इसे माइक्रोटाइटर प्लेट से नहीं किया जा सकता है। आवश्यक उपकरण आमतौर पर कम जटिल होते हैं और इनका उपयोग खेत में किया जा सकता है। आम तौर पर उपयोग किए जाने वाले एंजाइमेटिक मार्कर निम्नलिखित तालिका में आमतौर पर एलिसा परख में उपयोग किए जाने वाले एंजाइमेटिक मार्करों को सूचीबद्ध किया गया है, जो परख के परिणामों को पूरा होने पर मापा जा सकता है। ओ. पी. डी. (ओ-फेनिलीनेडियामाइन डाइहाइड्रोक्लोराइड) एच. आर. पी. (हॉर्सराडिश पेरोक्सीडेस) का पता लगाने के लिए एम्बर को बदल देता है, जिसका उपयोग अक्सर संयुग्मित प्रोटीन के रूप में किया जाता है। टी. एम. बी. (3,3 ', 5,5'-टेट्रामीथाइलबेन्ज़ीडाइन) एच. आर. पी. का पता लगाने पर नीला हो जाता है और सल्फ्यूरिक या फॉस्फोरिक एसिड मिलाने के बाद पीला हो जाता है। एचआरपी का पता लगाने पर एबीटीएस (2,2 '-एज़िनोबिस [3-एथिलबेंज़ोथियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड]-डायमोनियम नमक) हरा हो जाता है। पीएनपीपी (पी-नाइट्रोफिनाइल फॉस्फेट, डिसोडियम सॉल्ट) क्षारीय फॉस्फेट का पता लगाने पर पीला हो जाता है। अनुप्रयोग क्योंकि एलिसा को प्रतिजन की उपस्थिति या नमूने में एंटीबॉडी की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, यह सीरम एंटीबॉडी सांद्रता (जैसे एचआईवी परीक्षण या वेस्ट नाइल वायरस के साथ) निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इसने खाद्य उद्योग में दूध, मूंगफली, अखरोट, बादाम और अंडे जैसे संभावित खाद्य एलर्जी कारकों का पता लगाने और सीलिएक रोग के लिए सीरोलॉजिकल रक्त परीक्षण के रूप में भी अनुप्रयोग पाए हैं। एलिसा का उपयोग विष विज्ञान में दवाओं के कुछ वर्गों के लिए एक त्वरित अनुमानित स्क्रीन के रूप में भी किया जा सकता है। एलिसा एच. आई. वी. की उच्च संवेदनशीलता के कारण एच. आई. वी. के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला पहला जांच परीक्षण था। एलिसा में, एक व्यक्ति के सीरम को 400 बार पतला किया जाता है और एक प्लेट पर लगाया जाता है जिसमें एचआईवी एंटीजन जुड़े होते हैं। यदि एच. आई. वी. के एंटीबॉडी सीरम में मौजूद हैं, तो वे इन एच. आई. वी. एंटीजनों से जुड़ सकते हैं। प्लेट को फिर सीरम के अन्य सभी घटकों को हटाने के लिए धोया जाता है। एक विशेष रूप से तैयार "द्वितीयक एंटीबॉडी"-एक एंटीबॉडी जो अन्य एंटीबॉडी से जुड़ती है-को फिर प्लेट पर लगाया जाता है, उसके बाद एक और धोया जाता है। यह द्वितीयक एंटीबॉडी रासायनिक रूप से एक एंजाइम से पहले से जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, प्लेट में प्लेट से बंधी द्वितीयक एंटीबॉडी की मात्रा के अनुपात में एंजाइम होगा। एन्जाइम के लिए एक सब्सट्रेट लगाया जाता है, और एंजाइम द्वारा उत्प्रेरण रंग या प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की ओर ले जाता है। एलिसा परिणाम एक संख्या के रूप में रिपोर्ट किए जाते हैं; इस परीक्षण का सबसे विवादास्पद पहलू सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम के बीच "कट-ऑफ" बिंदु का निर्धारण करना है। एक ज्ञात मानक के साथ तुलना करके एक कट-ऑफ बिंदु निर्धारित किया जा सकता है। यदि कार्यस्थल पर दवा की जांच के लिए एक एलिसा परीक्षण का उपयोग किया जाता है, तो उदाहरण के लिए, एक कट-ऑफ सांद्रता, 50 एनजी/एमएल स्थापित की जाती है, और एनालाइट की मानक सांद्रता वाला एक नमूना तैयार किया जाएगा। अज्ञात जो ज्ञात नमूने की तुलना में एक मजबूत संकेत उत्पन्न करते हैं वे "सकारात्मक" होते हैं। जो कमजोर संकेत उत्पन्न करते हैं वे "नकारात्मक" होते हैं। डेंगू, मलेरिया, चागस रोग, जॉन्स रोग और अन्य विभिन्न प्रकार की बीमारियों का पता लगाने के लिए एलिसा परीक्षण हैं। चिकित्सा प्रयोगशाला में इन विट्रो डायग्नोस्टिक्स के लिए एलिसा परीक्षणों का भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। एलिसा के अन्य उपयोगों में शामिल हैंः रक्त के नमूनों में सार्स-कोव-2 एंटीबॉडी का पता लगाना-एग्लूटिनेशन-पी. सी. आर. इम्यूनोस्क्रीनिंग लेटरल फ्लो टेस्ट भी देखें मैग्नेटिक इम्यूनोएस्से माइक्रोटाइटर प्लेट नेफेलोमेट्री प्लाक रिडक्शन न्यूट्रलाइजेशन टेस्ट प्लेट रीडर स्राव परख टिप्पणियाँ और संदर्भ बाहरी लिंक "एलिसा गतिविधि का परिचय"-एच. आई. वी. का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एलिसा के शुरुआती वॉक-थ्रू, जिसमें एरिजोना विश्वविद्यालय में एनिमेशन शामिल हैं "एलिसा परख सिद्धांत"-एक एलिसा के सिद्धांत का अवलोकन और परख जीनी नैदानिक विषाणु विज्ञान प्रतिरक्षाविज्ञान परीक्षणों में विश्लेषण का पता लगाने के लिए उपकरण।