Nucleoside phosphoramidite
न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट प्राकृतिक या सिंथेटिक न्यूक्लियोसाइड के व्युत्पन्न हैं। इनका उपयोग ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, न्यूक्लिक एसिड के अपेक्षाकृत छोटे टुकड़ों और उनके अनुरूपों को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है। न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट को पहली बार 1981 में ब्यूकेज और कैरूथर्स द्वारा पेश किया गया था। अवांछित दुष्प्रभावों से बचने के लिए, प्राकृतिक या सिंथेटिक न्यूक्लियोसाइड्स में मौजूद प्रतिक्रियाशील हाइड्रॉक्सी और एक्सोसाइक्लिक एमिनो समूहों को उचित रूप से संरक्षित किया जाता है। जब तक एक न्यूक्लियोसाइड एनालॉग में कम से कम एक हाइड्रॉक्सी समूह होता है, तब तक उपयुक्त सुरक्षा रणनीति का उपयोग उसे संबंधित फॉस्फोरामिडाइट में बदलने और बाद वाले को सिंथेटिक न्यूक्लिक एसिड में शामिल करने की अनुमति देता है। फॉस्फोरामिडाइट रणनीति का उपयोग करके एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला के बीच में शामिल होने के लिए, न्यूक्लियोसाइड एनालॉग में दो हाइड्रॉक्सी समूह या, कम बार, एक हाइड्रॉक्सी समूह और एक अन्य न्यूक्लियोफिलिक समूह (एमिनो या मर्केप्टो) होना चाहिए। उदाहरणों में शामिल हैं, लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं हैं, वैकल्पिक न्यूक्लियोटाइड्स, एल. एन. ए., मॉर्फोलिनो, 2 '-स्थिति (ओ. एम. ई., संरक्षित एन. एच. 2, एफ.) पर संशोधित न्यूक्लियोसाइड्स, गैर-कैनॉनिकल बेस वाले न्यूक्लियोसाइड्स (प्राकृतिक न्यूक्लियोसाइड्स इनोसिन और ज़ैंथोसिन में निहित हाइपोक्सैंथिन और ज़ैंथिन, क्रमशः, जी-क्लैंप जैसे ट्राइसाइक्लिक बेस आदि)। या एक फ्लोरोसेंट समूह या एक लिंकर भुजा के साथ व्युत्पन्न आधार। तैयारी न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट्स की तैयारी के लिए तीन मुख्य तरीके हैं। सामान्य विधि में एक कमजोर एसिड की उत्प्रेरक क्रिया के तहत फॉस्फोरोडायमिडाइट के साथ एकल मुक्त हाइड्रॉक्सी समूह वाले एक संरक्षित न्यूक्लियोसाइड का उपचार शामिल है। हालांकि कुछ बिसामिडाइट को तापीय रूप से अस्थिर यौगिकों के रूप में बताया गया था, 2-साइनोइथाइल एन, एन, एन ', एन'-टेट्राइसोप्रोपाइलफॉस्फोरोडाइमिडाइट, वाणिज्यिक न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट तैयार करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एमिडाइट अपेक्षाकृत स्थिर है। इसे दो-चरण, एक-बर्तन प्रक्रिया का उपयोग करके संश्लेषित किया जा सकता है और वैक्यूम आसवन द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। एक उत्कृष्ट समीक्षा न्यूक्लियोसिडिक और गैर-न्यूक्लियोसिडिक फॉस्फोरामिडाइट्स की तैयारी में बाद वाले अभिकर्मक के उपयोग को बहुत विस्तार से रेखांकित करती है। दूसरी विधि में, संरक्षित न्यूक्लियोसाइड को एक कार्बनिक आधार, आमतौर पर एन-एथिल-एन, एन-डाइसोप्रोपाइलैमाइन (ह्यूनिग का आधार) की उपस्थिति में फॉस्फोरोक्लोराइडाइट के साथ उपचारित किया जाता है। तीसरी विधि में, संरक्षित न्यूक्लियोसाइड को पहले क्लोरो एन, एन, एन ', एन'-टेट्राइसोप्रोपाइल फॉस्फोरोडाइमिडाइट के साथ एक कार्बनिक आधार, आमतौर पर एन-एथिल-एन, एन-डाइसोप्रोपाइलैमाइन (ह्यूनिग का आधार) की उपस्थिति में एक संरक्षित न्यूक्लियोसाइड डायमिडाइट बनाने के लिए उपचारित किया जाता है। बाद वाले को वांछित फॉस्फाइट सुरक्षा समूह से संबंधित अल्कोहल के साथ इलाज किया जाता है, उदाहरण के लिए, 2-साइनोइथेनॉल, एक कमजोर एसिड की उपस्थिति में। न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट को सिलिका जेल पर कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जाता है। फॉस्फोरामिडाइट भाग की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि स्तंभ को 3 से 5 प्रतिशत ट्राइएथैलामाइन वाले इल्यूएंट के साथ संतुलित किया जाए और अलगाव के पूरे पाठ्यक्रम के दौरान इल्यूएंट में इस सांद्रता को बनाए रखा जाए। एक फॉस्फोरामिडाइट की शुद्धता का आकलन 31 पी एन. एम. आर. स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है। चूंकि एक न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट में पी (III) परमाणु कायरल है, इसलिए यह यौगिक के दो डायस्टेरियोमर्स के अनुरूप लगभग 149 पीपीएम पर दो शिखर प्रदर्शित करता है। संभावित रूप से मौजूद फॉस्फाइट ट्रिस्टर अशुद्धता 138-140 पीपीएम पर शिखर प्रदर्शित करती है। एच-फॉस्फोनेट अशुद्धियाँ 8 और 10 पीपीएम पर शिखर प्रदर्शित करती हैं। फॉस्फोरामिडाइट भाग न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट्स के रासायनिक गुण अपेक्षाकृत स्थिर यौगिक होते हैं जो 4 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर हवा की अनुपस्थिति में निर्जल परिस्थितियों में पाउडर के रूप में संग्रहीत होने पर लंबे समय तक शेल्फ-लाइफ के साथ होते हैं। एमिडाइट हल्के बुनियादी परिस्थितियों का सामना करते हैं। इसके विपरीत, हल्के एसिड की उपस्थिति में, फॉस्फोरामिडाइट लगभग तुरंत नष्ट हो जाते हैं। फॉस्फोरामिडाइट तटस्थ परिस्थितियों में हाइड्रोलिसिस के लिए अपेक्षाकृत स्थिर होते हैं। उदाहरण के लिए, 25 डिग्री सेल्सियस पर 95 प्रतिशत जलीय एसीटोनिट्राइल में 2-साइनोइथाइल 5 '-ओ-(4,4'-डाइमेथोक्सीट्राइल) थाइमाइडिन-3 '-ओ-(एन, एन-डाइसोप्रोपिलामिनो) फॉस्फाइट का अर्ध-जीवन 200 घंटे है। फॉस्फोरामिडाइट की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता फॉस्फोरामिडाइट युग्मन प्रतिक्रिया से गुजरने की उनकी क्षमता है, जो एक अम्लीय एज़ोल उत्प्रेरक, 1एच-टेट्राज़ोल, 2-एथिलियोटेट्राज़ोल, 2-बेंज़िलथियोटेट्राज़ोल, 4,5-डायसाइनोइमिडाज़ोल की उपस्थिति में न्यूक्लियोफिलिक समूहों के साथ प्रतिक्रिया करने की क्षमता है। प्रतिक्रिया बहुत तेजी से आगे बढ़ती है। यही विशेषता न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट को ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण में उपयोगी मध्यवर्ती बनाती है। स्टीरियोकेमिकल रूप से, फॉस्फोरामिडाइट युग्मन पी (III) कायरल केंद्र में एपिमेराइजेशन (डायस्टेरियोमर्स का निर्माण) की ओर ले जाता है। जब पानी को न्यूक्लियोफाइल के रूप में परोसा जाता है, तो उत्पाद एक एच-फॉस्फोनेट डाइस्टर होता है जैसा कि ऊपर योजना में दिखाया गया है। विलायकों और अभिकर्मकों में अवशिष्ट पानी की उपस्थिति के कारण, बाद वाले यौगिक का गठन फॉस्फोरामिडाइट्स के प्रारंभिक उपयोग में सबसे आम जटिलता है, विशेष रूप से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण में। फॉस्फोरामिडाइट्स को कमजोर ऑक्सीकरण अभिकर्मकों के साथ आसानी से ऑक्सीकृत किया जाता है, उदाहरण के लिए, कमजोर क्षारों की उपस्थिति में जलीय आयोडीन के साथ या संबंधित फॉस्फोरामिडेट्स बनाने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ। इसी तरह, फॉस्फोरामिडाइट अन्य चाल्कोजेन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। जब सल्फर के घोल या कई यौगिकों के संपर्क में लाया जाता है जिन्हें सामूहिक रूप से सल्फरकारी एजेंट के रूप में संदर्भित किया जाता है, तो फॉस्फोरामिडाइट मात्रात्मक रूप से फॉस्फोरोथियोएमिडेट्स बनाते हैं। सेलेनियम या सेलेनियम व्युत्पन्न के साथ प्रतिक्रिया फॉस्फोरोसेलेनोएमिडेट्स का उत्पादन करती है। इस प्रकार की सभी प्रतिक्रियाओं में, फॉस्फोरस परमाणु पर विन्यास बनाए रखा जाता है। न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट्स संबंधित फॉस्फोनामिडेट्स बनाने के लिए माइकलिस-अर्बुज़ोव प्रतिक्रिया से गुजरते हैं। एक उदाहरण एक्रिलोनाइट्राइल की उपस्थिति में फॉस्फोनामिडेट्स की तैयारी का वर्णन करता है। कथित तौर पर, कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया फॉस्फोरस केंद्र में विन्यास के प्रतिधारण के साथ रूढ़िवादी होती है। इसके विपरीत, जब 55 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, तो प्रतिक्रिया रेसमाइज्ड उत्पादों की ओर ले जाती है। इसी तरह फॉस्फीन और तृतीयक फॉस्फाइट के लिए, फॉस्फोरामिडाइट आसानी से स्टॉडिंगर प्रतिक्रिया से गुजरते हैं। (आरओ) 2पी-एन (आर1) 2 + आर2-एन3 + एच2ओ---(आरओ) 2पी (= ओ)-एन (आर1) 2 + आर2-एनएच2 + एन2; सुरक्षा रणनीति प्राकृतिक रूप से पाए जाने वाले न्यूक्लियोटाइड्स (न्यूक्लियोसाइड-3 '-या 5'-फॉस्फेट) और उनके फॉस्फोडीस्टर एनालॉग उच्च पैदावार में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की त्वरित सिंथेटिक तैयारी का खर्च उठाने के लिए अपर्याप्त प्रतिक्रियाशील हैं। न्यूक्लियोसाइड्स (न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट्स) के 3 '-ओ-(एन, एन-डाइसोप्रोपाइल फॉस्फोरामिडाइट) व्युत्पन्न का उपयोग करके इंटरन्यूक्लियोसिडिक लिंकेज की चयनशीलता और गठन की दर में नाटकीय रूप से सुधार किया जाता है जो फॉस्फाइट ट्राइस्टर पद्धति में निर्माण खंडों के रूप में काम करते हैं। अवांछित दुष्प्रभाव प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए, न्यूक्लियोसाइड्स में मौजूद अन्य सभी कार्यात्मक समूहों को सुरक्षात्मक समूहों को जोड़कर अप्रभावी (संरक्षित) किया जाना चाहिए। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला संयोजन के पूरा होने पर, वांछित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राप्त करने के लिए सभी सुरक्षा समूहों को हटा दिया जाता है। नीचे, वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और सबसे आम न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरामिडाइट निर्माण खंडों में उपयोग किए जाने वाले सुरक्षा समूहों की संक्षेप में समीक्षा की गई हैः 5 '-हाइड्रॉक्सिल समूह एक एसिड-लेबल डीएमटी (4,4'-डाइमेथॉक्सीट्राइल) समूह द्वारा संरक्षित है। थाइमिन और यूरेसिल, क्रमशः थाइमाइडिन और यूरिडिन के नाभिकीय क्षारों में एक्सोसाइक्लिक एमिनो समूह नहीं होते हैं और इसलिए उन्हें किसी सुरक्षा की आवश्यकता नहीं होती है। इसके विपरीत, नाभिकीय क्षार एडेनिन, साइटोसिन और गुआनिन में एक्सोसाइक्लिक एमिनो समूह होते हैं, जो युग्मन प्रतिक्रिया की स्थितियों के तहत सक्रिय फॉस्फोरामिडाइट के साथ प्रतिक्रियाशील होते हैं। हालांकि, सिंथेटिक चक्र में अतिरिक्त चरणों की कीमत पर, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड चेन असेंबली को असुरक्षित अमीनो समूहों के साथ फॉस्फोरामिडाइट का उपयोग करके किया जा सकता है, अक्सर इन्हें ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड चेन असेंबली की पूरी लंबाई में स्थायी रूप से संरक्षित रखा जाता है। एक्सोसाइक्लिक अमीनो समूहों की सुरक्षा 5 '-हाइड्रॉक्सी समूह के ऑर्थोगोनल होनी चाहिए क्योंकि बाद वाले को प्रत्येक सिंथेटिक चक्र के अंत में हटा दिया जाता है। लागू करने के लिए सबसे सरल और इसलिए सबसे व्यापक रूप से स्वीकृत रणनीति है जहां एक्सोसाइक्लिक अमीनो समूह एक आधार-लेबल सुरक्षा प्रदान करते हैं। अक्सर, दो सुरक्षा योजनाओं का उपयोग किया जाता है। पहले में, मानक और अधिक मजबूत योजना (चित्र), बीज़ (बेंज़ॉयल) सुरक्षा का उपयोग ए, डी. ए., सी, डी. सी., जी के लिए किया जाता है, और डी. जी. आइसोब्यूट्रिल समूह के साथ संरक्षित होते हैं। हाल ही में, एसी (एसिटाइल) समूह का उपयोग अक्सर सी और डीसी की सुरक्षा के लिए किया जाता है जैसा कि चित्र में दिखाया गया है। दूसरी, हल्की सुरक्षा योजना में, ए और डी. ए. को आइसोब्यूट्रिल या फीनोक्सीसेटाइल समूहों (पी. ए. सी.) से संरक्षित किया जाता है। सी और डी. सी. एसिटाइल सुरक्षा प्रदान करते हैं, और जी और डी. जी. 4-आइसोप्रोपाइलफेनोक्सीएसिटाइल (आई-पी. आर.-पी. ए. सी.) या डाइमिथाइलफॉर्मामिडिनो (डी. एम. एफ.) समूहों के साथ संरक्षित हैं। मानक सुरक्षा समूहों की तुलना में हल्के सुरक्षा समूहों को अधिक आसानी से हटा दिया जाता है। हालांकि, इन समूहों को धारण करने वाले फॉस्फोरामिडाइट समाधान में संग्रहीत होने पर कम स्थिर होते हैं। फॉस्फाइट समूह बेस-लेबल 2-साइनोइथाइल समूह द्वारा संरक्षित है। एक बार जब एक फॉस्फोरामिडाइट को ठोस समर्थन-बद्ध ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ जोड़ा जाता है और फॉस्फाइट मोएटीज को पी (वी) प्रजाति में परिवर्तित कर दिया जाता है, तो आगे की युग्मन प्रतिक्रियाओं के सफल संचालन के लिए फॉस्फेट संरक्षण की उपस्थिति अनिवार्य नहीं है। आर. एन. ए. संश्लेषण में, 2 '-हाइड्रॉक्सी समूह टी. बी. डी. एम. एस. (टी-ब्यूटिलडिमिथाइलसिल) समूह के साथ संरक्षित है। या टी. ओ. एम. (ट्राइ-आइसो-प्रोपाइलसिलिलोक्सीमिथाइल) समूह के साथ, दोनों को फ्लोराइड आयन के साथ उपचार द्वारा हटाया जा सकता है। फॉस्फाइट भाग में अम्लीय स्थितियों में एक डाइसोप्रोपिलामिनो (आई. पी. आर. 2. एन.) समूह प्रतिक्रियाशील भी होता है। सक्रिय होने पर, डाइसोप्रोपिलामिनो समूह छोड़ देता है, जिसे समर्थन-बद्ध ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के 5 '-हाइड्रॉक्सी समूह द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। डी. एन. ए. संश्लेषण न्यूक्लिक एसिड एनालॉग ओलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण संदर्भ और व्यापक प्राकृतिक उत्पाद रसायन विज्ञान, खंड 7: डी. एन. ए. और आणविक जीव विज्ञान के पहलू भी देखें। कूल, एरिक टी.; संपादक। नेथ। (1999), 733 पीपी। प्रकाशकः (एल्सेवियर, एम्स्टर्डम, नेथ।) ब्यूकेज, एस. एल. ओलिगोडायोक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स संश्लेषण। फॉस्फोरामिडाइट दृष्टिकोण। आणविक जीवविज्ञान में विधियाँ (टोटोवा, एनजे, संयुक्त राज्य अमेरिका) (1993), 20 (ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और एनालॉग्स के लिए प्रोटोकॉल), 33-61। ब्राउन टी., ब्राउन डी. जे. एस. 1991. ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और एनालॉग में। एक व्यावहारिक दृष्टिकोण, एड। एफ एक्स्टीन, पीपी। 1-24। ऑक्सफोर्डः आई. आर. एल. फॉस्फोरामिडाइट्स पी. एल.: एमिडोफोस्फोरिनी