Electrophoretic mobility shift assay
एक इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (ई. एम. एस. ए.) या मोबिलिटी शिफ्ट इलेक्ट्रोफोरेसिस, जिसे जेल शिफ्ट परख, जेल मोबिलिटी शिफ्ट परख, बैंड शिफ्ट परख, या जेल मंदन परख के रूप में भी जाना जाता है, एक सामान्य आत्मीयता इलेक्ट्रोफोरेसिस तकनीक है जिसका उपयोग प्रोटीन-डी. एन. ए. या प्रोटीन-आर. एन. ए. अंतःक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यह प्रक्रिया यह निर्धारित कर सकती है कि क्या प्रोटीन या प्रोटीन का मिश्रण किसी दिए गए डी. एन. ए. या आर. एन. ए. अनुक्रम से जुड़ने में सक्षम है, और कभी-कभी यह संकेत दे सकता है कि बंधन परिसर में एक से अधिक प्रोटीन अणु शामिल हैं या नहीं। जेल शिफ्ट परख अक्सर प्रतिलेखन दीक्षा, डी. एन. ए. गिरोह प्रतिकृति, डी. एन. ए. मरम्मत या आर. एन. ए. प्रसंस्करण और परिपक्वता, साथ ही साथ पूर्व-एम. आर. एन. ए. विभाजन का अध्ययन करते समय डी. एन. ए. एस. फुटप्रिंटिंग, प्राइमर विस्तार और प्रवर्तक-जांच प्रयोगों के साथ समवर्ती रूप से इन विट्रो में किए जाते हैं। हालांकि पूर्ववर्ती पहले के साहित्य में पाए जा सकते हैं, अधिकांश वर्तमान परख गार्नर और रेवज़िन और फ्राइड और क्रोथर्स द्वारा वर्णित तरीकों पर आधारित हैं। सिद्धांत एक गतिशीलता बदलाव परख एक छोटी अवधि के लिए एक पॉलीएक्रिलामाइड या अगरोज जेल पर प्रोटीन-डी. एन. ए. या प्रोटीन-आर. एन. ए. मिश्रण का इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण है (15-से 20-सेंटीमीटर जेल के लिए लगभग 1.5-2 एच. आर.)। जिस गति से विभिन्न अणु (और उनके संयोजन) जेल के माध्यम से आगे बढ़ते हैं, वह उनके आकार और आवेश से निर्धारित होता है, और कुछ हद तक, उनके आकार से (जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस देखें)। नियंत्रण लेन (प्रोटीन के बिना डीएनए जांच) में अनबाउंड डीएनए या आरएनए टुकड़े के अनुरूप एक एकल पट्टी होगी। हालांकि, यह मानते हुए कि प्रोटीन टुकड़े को बांधने में सक्षम है, एक प्रोटीन के साथ लेन में एक और बैंड होगा जो प्रोटीन से बंधे न्यूक्लिक एसिड प्रोब के बड़े, कम गतिशील परिसर का प्रतिनिधित्व करता है जिसे जेल पर 'स्थानांतरित' किया जाता है (क्योंकि यह अधिक धीरे-धीरे चला गया है)। सही प्रयोगात्मक परिस्थितियों में, डी. एन. ए. (या आर. एन. ए.) और प्रोटीन के बीच अंतःक्रिया स्थिर हो जाती है और जेल पर अनबाउंड न्यूक्लिक एसिड से बंधे का अनुपात मुक्त और बंधे प्रोब अणुओं के अंश को दर्शाता है क्योंकि बंधन प्रतिक्रिया जेल में प्रवेश करती है। यह स्थिरता आंशिक रूप से एक "पिंजरे के प्रभाव" के कारण होती है, जिसमें प्रोटीन, जेल मैट्रिक्स से घिरा हुआ, प्रोब से दूर फैलने में असमर्थ होता है इससे पहले कि वे फिर से जुड़ें। यदि प्रोटीन और प्रोब की प्रारंभिक सांद्रता ज्ञात है, और यदि परिसर की स्टोइकिओमेट्री ज्ञात है, तो न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम के लिए प्रोटीन की स्पष्ट आत्मीयता निर्धारित की जा सकती है। जब तक कि जटिल जेल स्थितियों के तहत बहुत लंबे समय तक जीवित नहीं रहता है, या इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान पृथक्करण को ध्यान में रखा जाता है, तब तक प्राप्त संख्या एक स्पष्ट केडी है। यदि प्रोटीन सांद्रता ज्ञात नहीं है लेकिन जटिल स्टोइकिओमेट्री है, तो प्रोटीन सांद्रता को डी. एन. ए. जांच की सांद्रता को बढ़ाकर निर्धारित किया जा सकता है जब तक कि आगे की वृद्धि प्रोटीन बाध्य के अंश को नहीं बढ़ाती है। एक ही जेल पर चलने वाले मुक्त जांच के मानक डाइलूशन के एक सेट की तुलना में, प्रोटीन के मोल की संख्या की गणना की जा सकती है। प्रकार और परिवर्धन एक एंटीबॉडी जो प्रोटीन को पहचानती है, इस मिश्रण में जोड़ा जा सकता है ताकि अधिक बदलाव के साथ और भी बड़ा परिसर बनाया जा सके। इस विधि को सुपरशिफ्ट परख के रूप में संदर्भित किया जाता है, और इसका उपयोग प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड परिसर में मौजूद प्रोटीन की स्पष्ट रूप से पहचान करने के लिए किया जाता है। अक्सर, बाध्यकारी प्रोटीन के लिए सबसे अनुकूल बंधन अनुक्रम निर्धारित करने के लिए एक प्रतियोगी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ एक अतिरिक्त लेन चलाई जाती है। परिभाषित अनुक्रम के विभिन्न ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग प्रतिस्पर्धा द्वारा सटीक बंधन स्थल की पहचान करने की अनुमति देता है (आरेख में नहीं दिखाया गया है)। प्रतिस्पर्धा परख के प्रकार बंधन की विशिष्टता को मापने और संबंध और पृथक्करण गतिविज्ञान को मापने के लिए उपयोगी हैं। इस प्रकार, ई. एम. एस. ए. का उपयोग ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का चयन करने के लिए एक एस. ई. एल. ई. एक्स. प्रयोग के हिस्से के रूप में भी किया जा सकता है जो वास्तव में किसी दिए गए प्रोटीन को बांधते हैं। एक बार डी. एन. ए.-प्रोटीन बाइंडिंग इन विट्रो में निर्धारित हो जाने के बाद, कई एल्गोरिदम प्रतिलेखन कारक की पहचान के लिए खोज को संकीर्ण कर सकते हैं। रुचि के प्रतिलेखन कारक के लिए सर्वसम्मति अनुक्रम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स बाध्यकारी के लिए प्रतिस्पर्धा करने में सक्षम होंगे, स्थानांतरित बैंड को समाप्त कर देंगे, और सुपरशिफ्ट द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए। यदि अनुमानित सर्वसम्मति अनुक्रम बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा करने में विफल रहता है, तो प्रतिलेखन कारक की पहचान को बहुआयामी प्रतियोगी ई. एम. एस. ए. (एम. सी.-ई. एम. एस. ए.) द्वारा सहायता प्रदान की जा सकती है, जिसके द्वारा प्रत्येक प्रतिक्रिया में सर्वसम्मति अनुक्रमों के बड़े सेटों को बहुगुणित किया जाता है, और जहां एक सेट बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा करता है, इस सेट से व्यक्तिगत सर्वसम्मति अनुक्रमों को आगे की प्रतिक्रिया में चलाया जाता है। दृश्य उद्देश्यों के लिए, न्यूक्लिक एसिड टुकड़े को आमतौर पर एक रेडियोधर्मी, फ्लोरोसेंट या बायोटिन लेबल के साथ लेबल किया जाता है। मानक ईथिडियम ब्रोमाइड धुंधलापन इन विधियों की तुलना में कम संवेदनशील है और यदि इन प्रयोगों में कम मात्रा में न्यूक्लिक एसिड या एकल-फंसे न्यूक्लिक एसिड (ओं) का उपयोग किया जाता है तो न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता की कमी हो सकती है। बायोटिन लेबल का उपयोग करते समय, डी. एन. ए. टुकड़े का पता लगाने के लिए हॉर्सराडिश पेरोक्सीडेस जैसे एंजाइम से संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग किया जाता है। जबकि समस्थानिक डीएनए लेबलिंग का प्रोटीन बंधन आत्मीयता पर बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, फ्लुरोफोर या बायोटिन सहित गैर-समस्थानिक लेबल का उपयोग रुचि के प्रोटीन अंतःक्रिया की आत्मीयता और/या स्टोइकिओमेट्री को बदल सकता है। फ्लोरोफोर-या बायोटिन-लेबल वाली जांच और उसी अनुक्रम के बिना लेबल वाले डीएनए के बीच प्रतिस्पर्धा का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि लेबल बाध्यकारी आत्मीयता या स्टोइकिओमेट्री को बदलता है या नहीं। संदर्भ बाहरी लिंक केमिल्युमिनेसेंट जेल शिफ्ट प्रोटोकॉल आनुवंशिकी तकनीक आणविक आनुवंशिकी आणविक जीव विज्ञान प्रोटीन विधि प्रोटिओमिक्स विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान प्रयोगशाला तकनीक इलेक्ट्रोफोरेसिस जैविक तकनीक और उपकरण