Primer walking
प्राइमर वॉकिंग एक तकनीक है जिसका उपयोग एक जीन (जैसे, रोग जीन) को उसके ज्ञात निकटतम मार्करों (जैसे, ज्ञात जीन) से क्लोन करने के लिए किया जाता है। नतीजतन, यह पौधों, कवक और स्तनधारियों में मामूली परिवर्तनों के साथ प्रतिरूपण और अनुक्रमण प्रयासों में नियोजित है। यह तकनीक, जिसे "निर्देशित अनुक्रमण" के रूप में भी जाना जाता है, या तो संदर्भ अनुक्रम (अनुक्रम पुष्टि सेवा) के आधार पर एक ज्ञात प्लास्मिड या पीसीआर उत्पाद के संदर्भ अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए या एक पूर्ण प्लास्मिड या पीसीआर उत्पाद के अज्ञात अनुक्रम की खोज करने के लिए सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला को नियोजित करती है। प्राइमर वॉकिंगः एक डी. एन. ए. अनुक्रमण विधि प्राइमर वॉकिंग 1.3-7.0 के. बी. सीमा तक डी. एन. ए. के अनुक्रम को निर्धारित करने की एक विधि है जबकि गुणसूत्र वॉकिंग का उपयोग जीन के पहले से ज्ञात अनुक्रमों के क्लोन का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। बहुत लंबे टुकड़ों को श्रृंखला समाप्ति विधि का उपयोग करके एक ही अनुक्रम में अनुक्रमित नहीं किया जा सकता है। यह विधि लंबे अनुक्रम को कई लगातार छोटे अनुक्रमों में विभाजित करके काम करती है। रुचि का डी. एन. ए. एक प्लास्मिड इन्सर्ट, एक पी. सी. आर. उत्पाद या एक जीनोम अनुक्रमण करते समय एक अंतराल का प्रतिनिधित्व करने वाला एक टुकड़ा हो सकता है। "प्राइमर वॉकिंग" शब्द का उपयोग किया जाता है जहाँ मुख्य उद्देश्य जीनोम को अनुक्रमित करना है। "गुणसूत्र चलना" शब्द का उपयोग तब किया जाता है जब अनुक्रम ज्ञात होता है लेकिन जीन का कोई क्लोन नहीं होता है। उदाहरण के लिए, एक बीमारी के लिए जीन एक विशिष्ट मार्कर के पास स्थित हो सकता है जैसे कि अनुक्रम पर एक आर. एफ. एल. पी। गुणसूत्र चलना एक तकनीक है जिसका उपयोग एक जीन (जैसे, रोग जीन) को उसके ज्ञात निकटतम मार्करों (जैसे, ज्ञात जीन) से क्लोन करने के लिए किया जाता है और इसलिए इसका उपयोग पौधों, कवक और जानवरों में क्लोनिंग और अनुक्रमण परियोजनाओं में मध्यम संशोधनों में किया जाता है। इसे दूसरे तरीके से कहने के लिए, इसका उपयोग मानचित्रित किए जाने वाले जीन के पास मौजूद एक विशिष्ट अनुक्रम को खोजने, अलग करने और क्लोन करने के लिए किया जाता है। बड़े टुकड़ों के पुस्तकालय, मुख्य रूप से जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र पुस्तकालय, ज्यादातर जीनोमिक परियोजनाओं में उपयोग किए जाते हैं। वांछित कॉलोनी की पहचान करने और एक विशेष क्लोन का चयन करने के लिए पुस्तकालय की पहले वांछित जांच के साथ जांच की जाती है। जाँच के बाद, क्लोन को जांच के साथ ओवरलैप किया जाता है और ओवरलैपिंग टुकड़ों को मैप किया जाता है। इन टुकड़ों को फिर अन्य क्लोनों की पहचान करने के लिए एक नई जांच (क्लोन के 3′ या 5′ सिरों से प्राप्त छोटे डीएनए टुकड़े) के रूप में उपयोग किया जाता है। एक पुस्तकालय में लगभग 96 क्लोन होते हैं और प्रत्येक क्लोन में एक अलग इन्सर्ट होता है। जांच एक λ1 और λ2 की पहचान करता है क्योंकि यह उन्हें ओवरलैप करता है। λ2 क्लोन से प्राप्त प्रोब दो का उपयोग λ3 आदि की पहचान करने के लिए किया जाता है। क्लोनों का अभिविन्यास क्लोनों के प्रतिबंध मानचित्रण द्वारा निर्धारित किया जाता है। इस प्रकार, एक जीन के आसपास मौजूद नए गुणसूत्र क्षेत्रों की पहचान की जा सकती है। गुणसूत्र चलना समय लेने वाला है, और गुणसूत्र लैंडिंग जीन पहचान के लिए पसंद की विधि है। इस विधि के लिए एक मार्कर की खोज की आवश्यकता होती है जो उत्परिवर्ती लोकस से दृढ़ता से संबंधित है। टुकड़े को पहले अनुक्रमित किया जाता है जैसे कि यह एक छोटा टुकड़ा हो। अनुक्रम प्रत्येक छोर से या तो सार्वभौमिक प्राइमर या विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए का उपयोग करके किया जाता है। इससे पहले 1000 या उससे अधिक आधारों की पहचान की जानी चाहिए। रुचि के क्षेत्र को पूरी तरह से अनुक्रमित करने के लिए, सन्निहित अनुक्रम जानकारी प्राप्त करने के लिए नए प्राइमर (ज्ञात अनुक्रम के अंतिम 20 आधारों के पूरक) की रचना और संश्लेषण आवश्यक है। प्राइमर वॉकिंग बनाम शॉटगन सीक्वेंसिंग प्राइमर वॉकिंग निर्देशित सीक्वेंसिंग का एक उदाहरण है क्योंकि प्राइमर को एक विशिष्ट दिशा में सीक्वेंसिंग का मार्गदर्शन करने के लिए डीएनए के एक ज्ञात क्षेत्र से डिज़ाइन किया गया है। निर्देशित अनुक्रमण के विपरीत, डी. एन. ए. की बन्दूक अनुक्रमण एक अधिक तीव्र अनुक्रमण रणनीति है। जीनोम अनुक्रमण की "पुराने समय" से एक तकनीक है। अनुक्रमण के लिए अंतर्निहित विधि सेंगर श्रृंखला समाप्ति विधि है जिसमें 100 और 1000 बेसपेयर (उपयोग किए गए उपकरणों के आधार पर) के बीच पढ़ने की लंबाई हो सकती है। इसका मतलब है कि आपको लंबे डीएनए अणुओं को तोड़ना होगा, क्लोन करना होगा और बाद में उन्हें अनुक्रमित करना होगा। दो तरीके संभव हैं। पहले को गुणसूत्र (या प्राइमर) चलना कहा जाता है और पहले टुकड़े के अनुक्रमण के साथ शुरू होता है। अनुक्रम के अगले (सन्निहित) टुकड़े को फिर एक प्राइमर का उपयोग करके अनुक्रमित किया जाता है जो पहले अनुक्रम के अंत के पूरक है और इसी तरह पढ़ा जाता है। इस तकनीक के लिए बहुत अधिक संयोजन की आवश्यकता नहीं है, लेकिन आपको बहुत सारे प्राइमर की आवश्यकता है और यह अपेक्षाकृत धीमा है। इस समस्या को दूर करने के लिए बन्दूक अनुक्रमण विधि विकसित की गई थी। यहाँ डी. एन. ए. को अलग-अलग टुकड़ों में विभाजित किया जाता है (सभी एक ही स्थान पर नहीं टूटे), प्रतिरूपण किया जाता है और प्रतिरूपण के लिए उपयोग किए जाने वाले वेक्टर के लिए विशिष्ट प्राइमर के साथ अनुक्रमित किया जाता है। यह अतिव्यापी अनुक्रमों की ओर ले जाता है जिन्हें फिर कंप्यूटर पर एक अनुक्रम में इकट्ठा करना पड़ता है। यह विधि अनुक्रमण के समानांतरकरण की अनुमति देती है (आप एक ही समय में बहुत सारी अनुक्रमण प्रतिक्रियाएं तैयार कर सकते हैं और उन्हें चला सकते हैं) जो प्रक्रिया को बहुत तेज बनाती है और अनुक्रम विशिष्ट प्राइमर की आवश्यकता से भी बचाती है। चुनौती अनुक्रमों को उनके क्रम में व्यवस्थित करने की है, क्योंकि ओवरलैप यहाँ उतने स्पष्ट नहीं हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, एक पहला मसौदा बनाया जाता है और फिर प्राइमर वॉकिंग जैसी अन्य तकनीकों का उपयोग करके महत्वपूर्ण क्षेत्रों को फिर से क्रमबद्ध किया जाता है। प्रक्रिया समग्र प्रक्रिया इस प्रकार हैः एक प्राइमर जो डी. एन. ए. की शुरुआत से अनुक्रम से मेल खाता है, का उपयोग अज्ञात अनुक्रम से सटे एक छोटे डी. एन. ए. स्ट्रैंड को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है, जो प्राइमर से शुरू होता है (पी. सी. आर. देखें)। नए छोटे डीएनए स्ट्रैंड को चेन टर्मिनेशन विधि का उपयोग करके अनुक्रमित किया जाता है। अनुक्रमित स्ट्रैंड के अंत का उपयोग लंबे डीएनए अनुक्रम के अगले भाग के लिए प्राइमर के रूप में किया जाता है, इसलिए "वॉकिंग" शब्द का उपयोग किया जाता है। विधि का उपयोग पूरे गुणसूत्रों को अनुक्रमित करने के लिए किया जा सकता है (इसलिए "गुणसूत्र चलना")। प्राइमर वॉकिंग भी शॉटगन अनुक्रमण के विकास का आधार था, जो विशेष रूप से चुने गए लोगों के बजाय यादृच्छिक प्राइमर का उपयोग करता है। क्रोमोजोम जंपिंग क्रोमोजोम लैंडिंग शॉटगन सीक्वेंसिंग भी देखें-एक वैकल्पिक विधि, जिसमें लगातार, उप-स्ट्रैंड के बजाय यादृच्छिक का उपयोग किया जाता है। संदर्भ डीएनए आणविक जीव विज्ञान