Rapid amplification of cDNA ends
सी. डी. एन. ए. छोरों का त्वरित प्रवर्धन (आर. ए. सी. ई.) एक तकनीक है जिसका उपयोग आणविक जीव विज्ञान में एक कोशिका के भीतर पाए जाने वाले आर. एन. ए. प्रतिलेख के पूर्ण लंबाई अनुक्रम को प्राप्त करने के लिए किया जाता है। आर. ए. सी. ई. के परिणामस्वरूप रुचि के आर. एन. ए. अनुक्रम की सी. डी. एन. ए. प्रति का उत्पादन होता है, जो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से उत्पादित होती है, जिसके बाद सी. डी. एन. ए. प्रतियों का पी. सी. आर. प्रवर्धन होता है (आर. टी.-पी. सी. आर. देखें)। प्रवर्धित सी. डी. एन. ए. प्रतियों को फिर अनुक्रमित किया जाता है और, यदि काफी लंबा है, तो एक अद्वितीय जीनोमिक क्षेत्र में मानचित्रित किया जाना चाहिए। आर. ए. सी. ई. के बाद आमतौर पर मूल रूप से अलग-अलग आर. एन. ए. अणुओं के अनुक्रमण से पहले प्रतिरूपण किया जाता है। एक अधिक उच्च-प्रवाह क्षमता वाला विकल्प जो नवीन प्रतिलेखन संरचनाओं की पहचान के लिए उपयोगी है, वह है अगली पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों द्वारा आर. ए. सी. ई.-उत्पादों को अनुक्रमित करना। प्रक्रिया आर. ए. सी. ई. आर. एन. ए. के 5 'अंत (5' आर. ए. सी. ई.-पी. सी. आर.) या 3 'अंत (3' आर. ए. सी. ई.-पी. सी. आर.) तक प्रतिलेखन के भीतर एक छोटे से ज्ञात अनुक्रम से आर. एन. ए. प्रतिलेखन का अनुक्रम प्रदान कर सकता है। इस तकनीक को कभी-कभी एकतरफा पी. सी. आर. या लंगर डाले हुए पी. सी. आर. कहा जाता है। आर. ए. सी. ई. में पहला कदम आर. एन. ए. प्रतिलेखन के एक क्षेत्र की सी. डी. एन. ए. प्रति का उत्पादन करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन का उपयोग करना है। इस प्रक्रिया में, प्रतिलिपि के केंद्र से एक ज्ञात अनुक्रम का उपयोग करके प्रतिलिपि के एक अज्ञात अंतिम भाग की प्रतिलिपि बनाई जाती है। प्रतिलिपि क्षेत्र ज्ञात अनुक्रम से घिरा हुआ है, या तो 5 'या 3' छोर पर। 5 'या 3' नस्लों के लिए प्रोटोकॉल थोड़े भिन्न होते हैं। 5 'आर. ए. सी. ई.-पी. सी. आर. एक एंटी-सेंस (रिवर्स) ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर का उपयोग करके सी. डी. एन. ए. संश्लेषण (या रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन) प्रतिक्रिया के पहले दौर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में एम. आर. एन. ए. का उपयोग करना शुरू करता है जो रुचि के जीन के बीच में एक ज्ञात अनुक्रम को पहचानता है; प्राइमर को जीन विशिष्ट प्राइमर (जी. एस. पी.) कहा जाता है। प्राइमर एम. आर. एन. ए. से जुड़ जाता है, और एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस एक विशिष्ट एकल-फंसे हुए सी. डी. एन. ए. उत्पाद को उत्पन्न करने के लिए प्राइमर के 3 'छोर पर आधार जोड़े जोड़ता है; यह एम. आर. एन. ए. का विपरीत पूरक है। सी. डी. एन. ए. संश्लेषण के बाद, एंजाइम टर्मिनल डीऑक्सिन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफर (टी. डी. टी.) का उपयोग सी. डी. एन. ए. के 3 'छोर पर समान न्यूक्लियोटाइड्स की एक स्ट्रिंग को जोड़ने के लिए किया जाता है, जिसे होमोपॉलिमेरिक टेल के रूप में जाना जाता है। (डी नोवो सी. डी. एन. ए. संश्लेषण के पहले स्ट्रैंड के लिए 3 '-टर्मिनल अनुक्रम को जोड़ने के कुछ अन्य तरीके हैं जो होमोपॉलिमेरिक टेलिंग की तुलना में बहुत अधिक कुशल हैं, लेकिन विधि का अर्थ वही रहता है)। इसके बाद पी. सी. आर. किया जाता है, जो एक दूसरे एंटी-सेंस जीन विशिष्ट प्राइमर (जी. एस. पी. 2) का उपयोग करता है जो ज्ञात अनुक्रम से जुड़ता है, और एक सेंस (फॉरवर्ड) यूनिवर्सल प्राइमर (यू. पी.) जो 5 'छोर से एक सी. डी. एन. ए. उत्पाद को बढ़ाने के लिए सी. डी. एन. ए. के 3' सिरों में जोड़ी गई होमोपॉलिमेरिक पूंछ को बांधता है। 3 'आर. ए. सी. ई.-पी. सी. आर. प्राकृतिक पॉलीए टेल का उपयोग करता है जो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के दौरान प्राइमिंग के लिए सभी यूकेरियोटिक एम. आर. एन. ए. के 3' छोर पर मौजूद होता है, इसलिए इस विधि में टी. डी. टी. द्वारा न्यूक्लियोटाइड्स को जोड़ने की आवश्यकता नहीं होती है। सी. डी. एन. ए. एक ओलिगो-डी. टी.-एडाप्टर प्राइमर (डीऑक्सी-थाइमाइन न्यूक्लियोटाइड्स के एक छोटे अनुक्रम के साथ एक प्राइमर) का उपयोग करके उत्पन्न किया जाता है जो पॉलीए खिंचाव को पूरा करता है और प्रत्येक सी. डी. एन. ए. के 5 'छोर पर एक विशेष एडाप्टर अनुक्रम जोड़ता है। इसके बाद पी. सी. आर. का उपयोग एक ज्ञात क्षेत्र से 3 'सी. डी. एन. ए. को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जिसमें एक सेंस जी. एस. पी. और एडाप्टर अनुक्रम के पूरक एक एंटी-सेंस प्राइमर का उपयोग किया जाता है। आर. ए. सी. ई.-अनुक्रमण आर. ए. सी. ई. द्वारा उत्पन्न सी. डी. एन. ए. अणुओं को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों (जिसे आर. ए. सी. ई.-एस. ई. क्यू. भी कहा जाता है) का उपयोग करके अनुक्रमित किया जा सकता है। आणविक क्लोनिंग के साथ कुछ क्लोनों के सेंगर अनुक्रमण के बाद आर. ए. सी. ई. टुकड़ों के पारंपरिक लक्षण वर्णन की तुलना में आर. ए. सी. ई. टुकड़ों का उच्च-प्रवाह अनुक्रमण लक्षण वर्णन अत्यधिक समय-कुशल, अधिक संवेदनशील, कम खर्चीला और तकनीकी रूप से संभव है। इतिहास और अनुप्रयोग आर. ए. सी. ई. का उपयोग आर. एन. ए. अणुओं के अज्ञात 5 '(5'-आर. ए. सी. ई.) या 3 '(3'-आर. ए. सी. ई.) भागों को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है जहां आर. एन. ए. अनुक्रम का हिस्सा जीन-विशिष्ट प्राइमर द्वारा जाना और लक्षित किया जाता है। इन प्रवर्धित आर. ए. सी. ई. उत्पादों के लक्षण वर्णन के लिए उच्च-प्रवाह अनुक्रमण के साथ संयुक्त रूप से, किसी भी प्रकार के कोडिंग या गैर-कोडिंग आर. एन. ए.-अणुओं को चिह्नित करने के लिए दृष्टिकोण को लागू करना संभव है। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ आर. ए. सी. ई. के संयोजन का विचार पहली बार 2009 में डीप-आर. ए. सी. ई. के रूप में पेश किया गया था ताकि एक एकल कोशिका-रेखा में 17 जीनों के प्रतिलेखन प्रारंभ स्थलों (टी. एस. एस.) का मानचित्रण किया जा सके। उदाहरण के लिए, सिंथेटिक एस. आई. आर. एन. ए. द्वारा निर्देशित लक्ष्य आर. एन. ए. के दरार स्थलों का सटीक मानचित्रण करने के लिए 2014 के एक अध्ययन में, इस दृष्टिकोण को पहले आर. ए. सी. ई.-एस. ई. क्यू. नाम दिया गया था। इसके अलावा, इस पद्धति का उपयोग कोलोरेक्टल कैंसर में नए प्रतिलेखों और संलयन प्रतिलेखों के पूर्ण लंबाई के अज्ञात भागों को चिह्नित करने के लिए किया गया था। एक अन्य अध्ययन में एलएनसीआरएनए की अज्ञात प्रतिलेख संरचनाओं को चिह्नित करने के उद्देश्य से, आरएसीई का उपयोग अर्ध-लंबी 454 अनुक्रमण के संयोजन में किया गया था। आणविक प्रतिरूपणः एक प्रयोगशाला नियमावली (संस्करण) में संदर्भ "5 'सी. डी. एन. ए. का तेजी से प्रवर्धन समाप्त"। सैम्ब्रूक, जे। ) अध्याय 8 प्रोटोकॉल 9,854-8.60 (कोल्ड स्प्रिंग हार्बर लेबोरेटरी प्रेस, कोल्ड स्प्रिंग हार्बर, न्यूयॉर्क, यूएसए, 2001) प्रिंसिपल्स ऑफ जीन मैनिपुलेशन एंड जीनोमिक्स, एस. बी. प्रिमरोज़ और आर. एम. ट्विमैन, ब्लैकवेल पब्लिशिंग, 2006 (7वां संस्करण। ), पृष्ठ 111-12। बाहरी लिंक आर. ए. सी. ई.-एस. ई. क्यू. जैव रसायन का पता लगाने की विधियों के बारे में ब्लॉग लेख आनुवंशिक मानचित्रण आनुवांशिकी तकनीक आणविक जीव विज्ञान