Immunofluorescence
इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक तकनीक है जिसका उपयोग प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के लिए किया जाता है और इसका उपयोग मुख्य रूप से जैविक नमूनों पर किया जाता है। यह तकनीक एक कोशिका के भीतर विशिष्ट जैव अणु लक्ष्यों के लिए फ्लोरोसेंट रंगों को लक्षित करने के लिए अपने प्रतिजन के लिए एंटीबॉडी की विशिष्टता का उपयोग करती है, और इसलिए नमूने के माध्यम से लक्षित अणु के वितरण की कल्पना की अनुमति देती है। प्रतिजन पर एक एंटीबॉडी जिस विशिष्ट क्षेत्र को पहचानता है, उसे एपिटोप कहा जाता है। एपिटोप मानचित्रण में प्रयास किए गए हैं क्योंकि कई एंटीबॉडी एक ही एपिटोप को बांध सकते हैं और एक ही एपिटोप को पहचानने वाले एंटीबॉडी के बीच बंधन के स्तर भिन्न हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी के लिए फ्लोरोफोर का बंधन स्वयं एंटीबॉडी की प्रतिरक्षात्मक विशिष्टता या इसके एंटीजन की बंधन क्षमता में हस्तक्षेप नहीं कर सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इम्यूनोस्टेनिंग (प्रोटीन पर दाग लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग) का एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला उदाहरण है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (ऊतकों में एंटीबॉडी-एंटीजन संबंध का उपयोग) का एक विशिष्ट उदाहरण है। यह तकनीक मुख्य रूप से एंटीबॉडी के स्थान की कल्पना करने के लिए फ्लोरोफोर्स का उपयोग करती है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग ऊतक वर्गों, संवर्धित कोशिका रेखाओं या व्यक्तिगत कोशिकाओं पर किया जा सकता है, और इसका उपयोग प्रोटीन, ग्लाइकेन और छोटे जैविक और गैर-जैविक अणुओं के वितरण का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग मध्यवर्ती आकार के तंतुओं जैसी संरचनाओं की कल्पना करने के लिए भी किया जा सकता है। यदि एक कोशिका झिल्ली की स्थलविज्ञान अभी तक निर्धारित नहीं की गई है, तो संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए प्रोटीन में एपिटोप सम्मिलन का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस के संयोजन के साथ किया जा सकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग डीएनए मिथाइलेशन के स्तरों और स्थानीयकरण पैटर्न में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक "अर्ध-मात्रात्मक" विधि के रूप में भी किया जा सकता है क्योंकि यह वास्तविक मात्रात्मक तरीकों की तुलना में अधिक समय लेने वाली विधि है और मिथाइलेशन के स्तरों के विश्लेषण में कुछ व्यक्तिपरकता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग फ्लोरोसेंट स्टेनिंग के अन्य, गैर-एंटीबॉडी तरीकों के साथ संयोजन में किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, डीएनए को लेबल करने के लिए डीएपीआई का उपयोग। इम्यूनोफ्लोरेसेंस नमूनों के विश्लेषण के लिए कई सूक्ष्मदर्शी डिजाइनों का उपयोग किया जा सकता है; सबसे सरल एपिफ्लोरेसेंस सूक्ष्मदर्शी है, और कॉन्फोकल सूक्ष्मदर्शी का भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। विभिन्न सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप डिजाइनों का भी उपयोग किया जा सकता है जो बहुत अधिक रिज़ॉल्यूशन में सक्षम हैं। फ्लोरोसेंस की तैयारी फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले एंटीबॉडी बनाने के लिए, एक फ्लोरोक्रोम को एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित ("टैग") किया जाना चाहिए। इसी तरह, एक एंटीजन को फ्लोरोसेंट एंटीजन तकनीक नामक तकनीक में फ्लोरोसेंट जांच के साथ एंटीबॉडी के साथ भी संयोजित किया जा सकता है। धब्बा प्रक्रियाएँ कोशिका द्रव्य में स्थिर प्रतिजन या जीवित कोशिकाओं पर कोशिका सतह प्रतिजन दोनों पर लागू हो सकती हैं, जिन्हें "झिल्ली प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति" कहा जाता है। एंटीबॉडी-एंटीजन कॉम्प्लेक्स के पूरक को फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल करना भी संभव है। जिस तत्व से प्रतिदीप्ति जांच जुड़ी होती है, उसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति तकनीकों के दो सामान्य वर्ग हैंः प्राथमिक और माध्यमिक। निम्नलिखित विवरण संयुग्मित प्रतिपिंडों के संदर्भ में मुख्य रूप से इन वर्गों पर ध्यान केंद्रित करेंगे। इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीकों के दो वर्ग हैं, प्राथमिक (या प्रत्यक्ष) और माध्यमिक (या अप्रत्यक्ष)। प्राथमिक (प्रत्यक्ष) प्राथमिक (प्रत्यक्ष) इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक एकल, प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करता है, जो रासायनिक रूप से एक फ्लोरोफोर से जुड़ा होता है। प्राथमिक प्रतिरक्षी लक्ष्य अणु (प्रतिजन) को पहचानता है और एपिटोप नामक एक विशिष्ट क्षेत्र से जुड़ जाता है। यह एक ऐसी प्रक्रिया द्वारा पूरा किया जाता है जो अनुकूली प्रतिरक्षा के साथ जीव की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में हेरफेर करती है। संलग्न फ्लोरोफोर का पता फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लगाया जा सकता है, जो उपयोग किए गए संदेशवाहक के आधार पर, उत्तेजित होने पर प्रकाश की एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य का उत्सर्जन करेगा। प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस, हालांकि कुछ हद तक कम आम है, माध्यमिक (अप्रत्यक्ष) प्रक्रिया की तुलना में उल्लेखनीय लाभ है। एंटीबॉडी से संदेशवाहक का सीधा जुड़ाव प्रक्रिया में चरणों की संख्या को कम करता है, समय की बचत करता है और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत को कम करता है। यह पूरी प्रक्रिया में एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी और संभावित गलतियों की संभावना को भी सीमित करता है। हालाँकि, इस विधि में कुछ नुकसान भी हैं। चूंकि प्राथमिक एंटीबॉडी से बंधे फ्लोरोसेंट अणुओं की संख्या सीमित है, इसलिए प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तुलना में काफी कम संवेदनशील है और इसके परिणामस्वरूप गलत नकारात्मक हो सकते हैं। प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए भी बहुत अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो बेहद महंगा होता है, कभी-कभी $400.00/mL तक चलता है। माध्यमिक (अप्रत्यक्ष) माध्यमिक (अप्रत्यक्ष) इम्यूनोफ्लोरेसेंस दो एंटीबॉडी का उपयोग करता है; बिना लेबल वाला पहला (प्राथमिक) एंटीबॉडी विशेष रूप से लक्ष्य अणु को बांधता है, और माध्यमिक एंटीबॉडी, जो फ्लोरोफोर ले जाता है, प्राथमिक एंटीबॉडी को पहचानता है और उससे जुड़ता है। एकाधिक द्वितीयक एंटीबॉडी एक एकल प्राथमिक एंटीबॉडी को बांध सकते हैं। यह प्रति प्रतिजन फ्लोरोफोर अणुओं की संख्या बढ़ाकर संकेत प्रवर्धन प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल उपरोक्त प्राथमिक (या प्रत्यक्ष) प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक जटिल और समय लेने वाला है, लेकिन अधिक लचीलेपन की अनुमति देता है क्योंकि दिए गए प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विभिन्न प्रकार के माध्यमिक एंटीबॉडी और पहचान तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल संभव है क्योंकि एक एंटीबॉडी में दो भाग होते हैं, एक परिवर्तनीय क्षेत्र (जो एंटीजन को पहचानता है) और स्थिर क्षेत्र (जो एंटीबॉडी अणु की संरचना बनाता है)। यह समझना महत्वपूर्ण है कि यह विभाजन कृत्रिम है और वास्तव में एंटीबॉडी अणु चार पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएँ हैंः दो भारी श्रृंखलाएँ और दो हल्की श्रृंखलाएँ। एक शोधकर्ता कई प्राथमिक एंटीबॉडी उत्पन्न कर सकता है जो विभिन्न एंटीजनों को पहचानते हैं (जिनमें अलग-अलग परिवर्तनशील क्षेत्र होते हैं), लेकिन सभी एक ही स्थिर क्षेत्र साझा करते हैं। इसलिए इन सभी एंटीबॉडी को एकल माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जा सकता है। यह सीधे फ्लोरोफोर ले जाने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को संशोधित करने की लागत बचाता है। विभिन्न स्थिर क्षेत्रों के साथ विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी आमतौर पर विभिन्न प्रजातियों में एंटीबॉडी को बढ़ाने से उत्पन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, एक शोधकर्ता एक बकरी में प्राथमिक एंटीबॉडी बना सकता है जो कई एंटीजन को पहचानता है, और फिर डाई-युग्मित खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी को नियोजित करता है जो बकरी एंटीबॉडी स्थिर क्षेत्र ("खरगोश एंटी-बकरी" एंटीबॉडी) को पहचानता है। शोधकर्ता तब एक चूहे में प्राथमिक एंटीबॉडी का दूसरा सेट बना सकता है जिसे एक अलग "गधे एंटी-माउस" माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जा सकता है। यह कई प्रयोगों में मुश्किल से बनाए जाने वाले डाई-युग्मित एंटीबॉडी के पुनः उपयोग की अनुमति देता है। सीमाएँ अधिकांश प्रतिदीप्ति तकनीकों की तरह, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ एक महत्वपूर्ण समस्या फोटोब्लीचिंग है। फोटोब्लीचिंग के कारण होने वाली गतिविधि के नुकसान को प्रकाश के संपर्क की तीव्रता या समय-अवधि को कम या सीमित करके, फ्लोरोफोर्स की सांद्रता को बढ़ाकर, या अधिक मजबूत फ्लोरोफोर्स को नियोजित करके नियंत्रित किया जा सकता है जो ब्लीचिंग के लिए कम प्रवण हैं (जैसे, एलेक्सा फ्लोर, सेटा फ्लोर, या डायलाइट फ्लोर)। इस तकनीक से उत्पन्न होने वाली कुछ समस्याओं में ऑटोफ्लोरेसेंस, बाहरी अवांछित विशिष्ट प्रतिदीप्ति और गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति शामिल हैं। ऑटोफ्लोरेसेंस में नमूना ऊतक या कोशिका से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति शामिल है। बाहरी अवांछित विशिष्ट प्रतिदीप्ति तब होती है जब एक लक्षित प्रतिजन अशुद्ध होता है और इसमें प्रतिजन संदूषक होते हैं। गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति में फ्लोरोफोर, अनुचित निर्धारण या सूखे हुए नमूने के कारण जांच की विशिष्टता का नुकसान शामिल है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस केवल निश्चित (यानी, मृत) कोशिकाओं तक ही सीमित होती है जब कोशिका के भीतर की संरचनाओं को देखा जाना होता है क्योंकि फ्लोरोसेंट लेबल के साथ प्रतिक्रिया करते समय एंटीबॉडी कोशिका झिल्ली में प्रवेश नहीं करते हैं। एंटीजेनिक सामग्री को कोशिका के अंदर अपने प्राकृतिक स्थानीयकरण के स्थान पर मजबूती से लगाया जाना चाहिए। विवो में कैंसर कोशिकाओं को रंगने के लिए इंटैक्ट एंटीबॉडी बहुत बड़े भी हो सकते हैं। उनके आकार के परिणामस्वरूप ट्यूमर का प्रवेश धीमा हो जाता है और लंबे समय तक चलने वाला आधा जीवन होता है। इस सीमा को पार करने के लिए मधुमेह के उपयोग की जांच करने के लिए शोध किया गया है। सुपरनेटेंट या कोशिका झिल्ली के बाहर प्रोटीन एंटीबॉडी द्वारा बंधे हो सकते हैं; यह जीवित कोशिकाओं को दाग लगाने की अनुमति देता है। उपयोग किए जा रहे फिक्सेटिव के आधार पर, रुचि के प्रोटीन क्रॉस-लिंक्ड हो सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट बंधन के कारण गलत सकारात्मक या गलत नकारात्मक संकेत हो सकते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट प्रोटीन डोमेन वाले पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग करना है, जैसे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जी. एफ. पी.)। इस तरह के "टैग किए गए" प्रोटीन का उपयोग जीवित कोशिकाओं में उनके स्थानीयकरण के निर्धारण की अनुमति देता है। भले ही यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस का एक सुरुचिपूर्ण विकल्प प्रतीत होता है, कोशिकाओं को जी. एफ. पी.-टैग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट या ट्रांसड्यूस करना पड़ता है, और इसके परिणामस्वरूप वे कम से कम एस1 या उससे ऊपर के जीव बन जाते हैं जिन्हें प्रयोगशाला में सख्त सुरक्षा मानकों की आवश्यकता होती है। इस तकनीक में कोशिकाओं की आनुवंशिक जानकारी में बदलाव करना शामिल है। प्रगति इस विधि में कई सुधार फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और फ्लोरोफोर के सुधार में निहित हैं। सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियाँ आम तौर पर एब्बे सीमा (इसकी तरंग दैर्ध्य के कारण प्रकाश पर रखी गई सीमा) से नीचे रिज़ॉल्यूशन का उत्पादन करने की सूक्ष्मदर्शी की क्षमता को संदर्भित करती हैं। यह विवर्तन सीमा पार्श्व दिशा में लगभग 200-300 nm और अक्षीय दिशा में 500-700 nm है। यह सीमा कोशिका में कुछ संरचनाओं की तुलना में तुलनीय या बड़ी है, और परिणामस्वरूप, इस सीमा ने वैज्ञानिकों को उनकी संरचना में विवरण निर्धारित करने से रोक दिया। प्रतिदीप्ति में अति-विभेदन, विशेष रूप से, निकटवर्ती वर्णक्रमीय रूप से समान फ्लोरोफोर्स के एक साथ प्रतिदीप्ति को रोकने के लिए एक सूक्ष्मदर्शी की क्षमता को संदर्भित करता है। यह प्रक्रिया सूक्ष्मदर्शी के बिंदु-प्रसार कार्य को प्रभावी ढंग से तेज करती है। हाल ही में विकसित सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप विधियों के उदाहरणों में स्टिमुलेटेड एमिशन डिप्लीशन (एस. टी. ई. डी.) माइक्रोस्कोपी, सैचुरेटेड स्ट्रक्चर्ड-इल्यूमिनेशन माइक्रोस्कोपी (एस. एस. आई. एम.), फ्लोरोसेंस फोटोएक्टिवेशन लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (एफ. पी. ए. एल. एम.) और स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी (एस. टी. ओ. आर. एम.) शामिल हैं। उल्लेखनीय व्यक्ति कॉर्नेलिया मिशेल डाउन्स (1892-1987), सूक्ष्म जीवविज्ञानी और पत्रकार इम्यूनोफ्लोरेसेंस निष्कर्षों के साथ त्वचीय स्थितियों को भी देखें इम्यूनोकेमिस्ट्री पैचिंग और कैपिंग संदर्भ बाहरी लिंक बर्मिंघम विश्वविद्यालय में ऑटोइम्यून रोगों से जुड़ी छवियां डेविडसन कॉलेज में इम्यूनोलॉजिक परीक्षण जैविक तकनीक और उपकरण पैथोलॉजी एनाटॉमिकल पैथोलॉजी जीवन विज्ञान उद्योग जीव रसायन के लिए अभिकर्मक