Tetramer assay
टेट्रामर परख (टेट्रामर दाग के रूप में भी जाना जाता है) एक ऐसी प्रक्रिया है जो रक्त के नमूने के भीतर दिए गए प्रतिजन के लिए विशिष्ट टी कोशिकाओं का पता लगाने और उनकी मात्रा निर्धारित करने के लिए टेट्रामेरिक प्रोटीन का उपयोग करती है। परख में उपयोग किए जाने वाले टेट्रामर चार प्रमुख हिस्टोकॉम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एम. एच. सी.) अणुओं से बने होते हैं, जो शरीर में अधिकांश कोशिकाओं की सतह पर पाए जाते हैं। एम. एच. सी. अणु टी-कोशिकाओं में पेप्टाइड्स को एक कोशिका में वायरस, बैक्टीरिया, कैंसर उत्परिवर्तन या अन्य प्रतिजनों की उपस्थिति को संप्रेषित करने के तरीके के रूप में प्रस्तुत करते हैं। यदि एक टी-कोशिका का रिसेप्टर एक एम. एच. सी. अणु द्वारा प्रस्तुत किए जा रहे पेप्टाइड से मेल खाता है, तो एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू होती है। इस प्रकार, एम. एच. सी. टेट्रामर जो एक विशिष्ट पेप्टाइड प्रस्तुत करने के लिए जैव-इंजीनियर हैं, उनका उपयोग उस पेप्टाइड से मेल खाने वाले रिसेप्टर्स के साथ टी-कोशिकाओं को खोजने के लिए किया जा सकता है। टेट्रामर को एक फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है, जिससे टेट्रामर-बाउंड टी-कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा टी-कोशिकाओं की मात्रा और छंटाई शोधकर्ताओं को वायरल संक्रमण और टीका प्रशासन के साथ-साथ प्रतिजन-विशिष्ट टी-कोशिकाओं की कार्यक्षमता के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने में सक्षम बनाती है। आम तौर पर, यदि किसी व्यक्ति की प्रतिरक्षा प्रणाली एक रोगजनक का सामना करती है, तो व्यक्ति के पास उस रोगजनक पर कुछ पेप्टाइड के प्रति विशिष्टता के साथ टी कोशिकाएं होंगी। इसलिए, यदि एक रोगजनक पेप्टाइड के लिए विशिष्ट टेट्रामर दाग एक सकारात्मक संकेत में परिणाम देता है, तो यह संकेत दे सकता है कि व्यक्ति की प्रतिरक्षा प्रणाली का सामना करना पड़ा है और उस रोगजनक के प्रति प्रतिक्रिया का निर्माण किया है। यह पद्धति पहली बार 1996 में स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय की एक प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित की गई थी। प्रतिजन-विशिष्ट टी-कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के पिछले प्रयासों में कम सटीक सीमित मंदन परख शामिल थी, जो टी-कोशिकाओं की संख्या का अनुमान उनके वास्तविक स्तरों से नीचे 50-500 समय पर लगाता है। घुलनशील एम. एच. सी. मोनोमर्स का उपयोग करने वाले दाग भी टी-सेल रिसेप्टर्स और एम. एच. सी.-पेप्टाइड मोनोमर्स की कम बाध्यकारी आत्मीयता के कारण असफल रहे। एम. एच. सी. टेट्रामर लक्ष्य टी-कोशिका पर एक से अधिक रिसेप्टर से जुड़ सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कुल बंधन शक्ति में वृद्धि होती है और पृथक्करण दर कम होती है। सीडी8 + टी-कोशिकाओं का उपयोग टेट्रामर दाग आमतौर पर साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) आबादी का विश्लेषण करते हैं। सी. टी. एल. को सी. डी. 8 + टी-कोशिका भी कहा जाता है, क्योंकि उनमें सी. डी. 8 सह-रिसेप्टर होते हैं जो एम. एच. सी. वर्ग I अणुओं से जुड़ते हैं। शरीर की अधिकांश कोशिकाएं एम. एच. सी. वर्ग I अणुओं को व्यक्त करती हैं, जो अंतःकोशिकीय प्रतिजनों को संसाधित करने और कोशिका की सतह पर प्रस्तुत करने के लिए जिम्मेदार होते हैं। यदि एम. एच. सी. वर्ग I अणुओं द्वारा प्रस्तुत किए जा रहे पेप्टाइड्स विदेशी हैं-उदाहरण के लिए, कोशिका के अपने प्रोटीन के बजाय वायरल प्रोटीन से प्राप्त-पेप्टाइड से मेल खाने वाले रिसेप्टर के साथ सी. टी. एल. कोशिका को नष्ट कर देगा। टेट्रामर दाग प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इन कोशिकाओं के दृश्य, परिमाणीकरण और छंटाई की अनुमति देते हैं, जो प्रतिरक्षा विज्ञान में बेहद उपयोगी है। टी-कोशिका आबादी को वायरस की अवधि में या टीके के आवेदन के बाद ट्रैक किया जा सकता है। टेट्रामर दाग को ईएलआईस्पॉट जैसे कार्यात्मक परख के साथ भी जोड़ा जा सकता है, जो एक नमूने में साइटोकिन स्रावित करने वाली कोशिकाओं की संख्या का पता लगाता है। एम. एच. सी. क्लास I टेट्रामर निर्माण एक प्रयोगशाला में विकसित एम. एच. सी. टेट्रामर अणु कोशिकाओं पर मौजूद एंटीजन की नकल कर सकते हैं और टी-कोशिकाओं से जुड़ सकते हैं जो एंटीजन को पहचानते हैं। वर्ग I एम. एच. सी. अणु एक अपरिवर्तनीय प्रकाश श्रृंखला बीटा-2 माइक्रोग्लोबुलिन (β2m) से जुड़े बहुरूपी भारी α-श्रृंखला से बने होते हैं। एस्चेरिचिया कोलाई का उपयोग प्रकाश श्रृंखला और भारी श्रृंखला के एक छोटे संस्करण को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है जिसमें बायोटिन 15 एमिनो एसिड पहचान टैग शामिल है। इन एम. एच. सी. श्रृंखलाओं को बी. आर. ए. एंजाइम के साथ बायोटिनिलेटेड किया जाता है और रुचि के प्रतिजैविक पेप्टाइड के साथ फिर से मोड़ दिया जाता है। बायोटिन एक छोटा अणु है जो स्ट्रेप्टाविडिन नामक एक अन्य प्रोटीन के साथ एक मजबूत बंधन बनाता है। फ्लोरोफोर टैग्ड स्ट्रेप्टाविडिन को बायोइंजीनियर्ड एम. एच. सी. मोनोमर्स में जोड़ा जाता है, और बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन अंतःक्रिया चार एम. एच. सी. मोनोमर्स को स्ट्रेप्टाविडिन से बांधने और एक टेट्रामर बनाने का कारण बनती है। जब टेट्रामर को रक्त के नमूने के साथ मिलाया जाता है, तो वे उपयुक्त प्रतिजन विशिष्ट रिसेप्टर को व्यक्त करने वाली टी-कोशिकाओं से जुड़ जाते हैं। कोई भी एम. एच. सी. टेट्रामर जो बंधे नहीं होते हैं, उन्हें फ्लो साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण करने से पहले नमूने से बाहर निकाल दिया जाता है। पुनः संयोजक एम. एच. सी. अणुओं के भीतर हाल की प्रगति ने पेप्टाइड एम. एच. सी. जटिल निर्माण और बाद में बहुआयामीकरण का लोकतंत्रीकरण किया है। एम. एच. सी. वर्ग I अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला के अत्यधिक सक्रिय सूत्रीकरण अब गैर-विशेषज्ञ उपयोगकर्ताओं को बिना किसी विशेष उपकरण के किसी भी प्रयोगशाला में दिन-प्रतिदिन अपने स्वयं के कस्टम पेप्टाइड-एम. एच. सी. परिसर बनाने की अनुमति देते हैं। सीडी4 + टी-कोशिका टेट्रामर भी विकसित किए गए हैं जो सहायक टी-कोशिकाओं से जुड़ते हैं। सहायक टी-कोशिकाएँ या सीडी4 + टी-कोशिकाएँ सीडी4 सह-रिसेप्टरों को व्यक्त करती हैं। वे वर्ग II एम. एच. सी. अणुओं से जुड़ते हैं, जो केवल डेंड्राइटिक कोशिकाओं या मैक्रोफेज जैसी पेशेवर प्रतिजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं में व्यक्त किए जाते हैं। वर्ग II एम. एच. सी. अणु बाह्य कोशिकीय प्रतिजन प्रस्तुत करते हैं, जिससे सहायक टी-कोशिकाओं को बैक्टीरिया, कवक और परजीवियों का पता लगाने में मदद मिलती है। वर्ग II एम. एच. सी. टेट्रामर का उपयोग अधिक आम होता जा रहा है, लेकिन वर्ग I टेट्रामर की तुलना में टेट्रामर बनाना अधिक कठिन है और सहायक टी-कोशिकाओं और एम. एच. सी. अणुओं के बीच का बंधन और भी कमजोर है। प्राकृतिक घातक टी-कोशिकाओं को प्राकृतिक घातक टी-कोशिकाओं (एनकेटी कोशिकाओं) को भी टेट्रामर प्रौद्योगिकी के साथ देखा जा सकता है। एनकेटी कोशिकाएँ प्रोटीन से जुड़ती हैं जो लिपिड या ग्लाइकोलिपिड एंटीजन प्रस्तुत करती हैं। एंटीजन पेश करने वाला कॉम्प्लेक्स जिसे एनकेटी कोशिकाएं बांधती हैं, उसमें सीडी1 प्रोटीन शामिल होते हैं, इसलिए सीडी1 से बने टेट्रामर का उपयोग एनकेटी कोशिकाओं पर दाग लगाने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण एच. आई. वी. संक्रमण के लिए कोशिका-मध्यस्थ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर केंद्रित टेट्रामर तकनीक का एक प्रारंभिक अनुप्रयोग। एम. एच. सी. टेट्रामर को एच. आई. वी. प्रतिजन प्रस्तुत करने के लिए विकसित किया गया था और संक्रमित रोगियों के रक्त के नमूनों में उन एच. आई. वी. प्रतिजनों के लिए विशिष्ट सी. टी. एल. के प्रतिशत का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता था। एच. आई. वी. संक्रमण में सी. टी. एल. के कार्य की विशेषता के लिए इसकी तुलना साइटोटॉक्सिक परख और प्लाज्मा आर. एन. ए. वायरल लोड के परिणामों से की गई थी। टेट्रामर से बंधे सी. टी. एल. को साइटोकिन स्राव के विश्लेषण के लिए ई. एल. आई. स्पॉट कुओं में वर्गीकृत किया गया था। एक अन्य अध्ययन ने इन्फ्लूएंजा वैक्सीन वितरण विधि की प्रभावशीलता की जांच करने के लिए एम. एच. सी. टेट्रामर परिसरों का उपयोग किया। चूहों को इन्फ्लूएंजा के लिए उपचर्म और इंट्रानासल टीकाकरण दिए गए थे, और फ्लो साइटोमेट्री के साथ टेट्रामर दाग का उपयोग टीके में उपयोग किए जाने वाले प्रतिजन के लिए विशिष्ट सी. टी. एल. की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। इसने दो अलग-अलग टीका वितरण विधियों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (टी-कोशिकाओं की संख्या जो एक वायरस को लक्षित करती हैं) की तुलना करने की अनुमति दी। संदर्भ आगे पढ़ने के लिए रक्त परीक्षण प्रवाह साइटोमेट्री