Allele-specific oligonucleotide
एक एलील-विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (ए. एस. ओ.) एक परिवर्तनीय लक्ष्य डी. एन. ए. के अनुक्रम के पूरक कृत्रिम डी. एन. ए. का एक छोटा टुकड़ा है। यह एक दक्षिणी धब्बा परख में लक्ष्य की उपस्थिति के लिए एक जांच के रूप में कार्य करता है या, अधिक सामान्य रूप से, सरल धब्बा परख में। यह आनुवंशिक परीक्षण, फोरेंसिक और आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में उपयोग किया जाने वाला एक सामान्य उपकरण है। ए. एस. ओ. आम तौर पर लंबाई में 15-21 न्यूक्लियोटाइड क्षारों का एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड होता है। इसे इस तरह से डिज़ाइन किया गया है (और उपयोग किया जाता है) जो इसे परीक्षण किए जा रहे डी. एन. ए. के केवल एक संस्करण, या एलील के लिए विशिष्ट बनाता है। ए. एस. ओ. की लंबाई, जिससे इसे चुना जाता है, और जिन स्थितियों से यह लक्षित डी. एन. ए. से बंधा होता है (और धोया जाता है), वे सभी इसकी विशिष्टता में एक भूमिका निभाते हैं। इन जांचों को आमतौर पर लक्ष्य के आनुवंशिक अनुक्रम में कम से कम 1 आधार के अंतर का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, जो एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) के परीक्षण में एक बुनियादी क्षमता है, जो जीनोटाइप विश्लेषण और मानव जीनोम परियोजना में महत्वपूर्ण है। अपने लक्ष्य से बंधे होने के बाद इसका पता लगाने के लिए, एएसओ को एक रेडियोधर्मी, एंजाइमेटिक या फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल किया जाना चाहिए। इल्यूमिना मिथाइलेशन परख तकनीक एक विशिष्ट सी. पी. जी. स्थल पर मिथाइलेशन को मापने के लिए एक आधार जोड़ी अंतर (साइटोसिन बनाम थाइमिन) का पता लगाने के लिए ए. एस. ओ. का लाभ उठाती है। उदाहरण मानव रोग सिकल सेल एनीमिया रक्त प्रोटीन बीटा-हीमोग्लोबिन के छठे एमिनो एसिड के लिए कोडन में आनुवंशिक उत्परिवर्तन के कारण होता है। एमिनो एसिड ग्लूटामेट के लिए सामान्य डीएनए अनुक्रम जी-ए-जी कोड, जबकि उत्परिवर्तन मध्य एडेनिन को थाइमिन में बदल देता है, जिससे अनुक्रम जी-टी-जी (एमआरएनए में जी-यू-जी) हो जाता है। यह परिवर्तित अनुक्रम एक वेलाइन को अंतिम प्रोटीन में प्रतिस्थापित करता है, जिससे इसकी संरचना विकृत हो जाती है। डी. एन. ए. नमूने में उत्परिवर्तन की उपस्थिति का परीक्षण करने के लिए, एक ए. एस. ओ. जांच को परिवर्तित अनुक्रम के पूरक के रूप में संश्लेषित किया जाएगा, जिसे यहाँ "एस" के रूप में लेबल किया गया है। एक नियंत्रण के रूप में, एक अन्य ए. एस. ओ. को सामान्य अनुक्रम "ए" के लिए संश्लेषित किया जाएगा। प्रत्येक ए. एस. ओ. अपने लक्ष्य अनुक्रम के लिए पूरी तरह से पूरक है (और दृढ़ता से बंधेगा), लेकिन इसके गैर-लक्ष्य एलील (कमजोर बातचीत के लिए अग्रणी) के खिलाफ एक एकल बेमेल है। पहला आरेख दिखाता है कि कैसे "एस" जांच पूरी तरह से "एस" लक्ष्य (शीर्ष) के पूरक है, लेकिन "ए" लक्ष्य (नीचे) के खिलाफ आंशिक रूप से बेमेल है। नमूना डी. एन. ए. (ओं) में बीटा-हीमोग्लोबिन जीन के एक खंड को पी. सी. आर. द्वारा प्रवर्धित किया जाएगा, और परिणामी उत्पादों को डॉट ब्लॉट्स के रूप में समर्थन झिल्ली की नकल करने के लिए लागू किया जाएगा। नमूने के डी. एन. ए. तारों को क्षार के साथ अलग किया जाता है, और प्रत्येक ए. एस. ओ. जांच को एक अलग धब्बे पर लगाया जाता है। संकरण के बाद, एक धुलाई प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है जो पूरी तरह से पूरक और बेमेल संकरों के बीच अंतर कर सकता है। बेमेल एएसओ को धब्बों से धोया जाता है, जबकि मेल खाने वाले एएसओ (और उनके लेबल) बने रहते हैं। दूसरे आरेख में, दो धब्बों में से प्रत्येक पर प्रवर्धित डीएनए के छह नमूने लगाए गए हैं। धोने के बाद बने एएसओ लेबल का पता लगाने से नमूनों के जीनोटाइप को सीधे पढ़ने की अनुमति मिलती है, जिनमें से प्रत्येक में बीटा-हीमोग्लोबिन जीन की दो प्रतियां होती हैं। नमूने 1 और 4 में केवल सामान्य "ए" युग्मविकल्प होता है, जबकि नमूने 3 और 5 में "ए" और "एस" युग्मविकल्प दोनों होते हैं (और इसलिए इस अप्रभावी उत्परिवर्तन के विषमयुग्म वाहक होते हैं)। नमूना 2 और 6 में केवल "एस" युग्मविकल्प होता है, और यह रोग से प्रभावित होगा। दिखाए गए 'क्रॉस हाइब्रिडाइजेशन' की छोटी मात्रा विशिष्ट है, और अंतिम परिणामों की व्याख्या करने की प्रक्रिया में माना जाता है। वैकल्पिक ए. एस. ओ. विश्लेषण आनुवंशिक बहुरूपता का पता लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों में से केवल एक है। प्रत्यक्ष डी. एन. ए. अनुक्रमण का उपयोग शुरू में उत्परिवर्तन को चिह्नित करने के लिए किया जाता है, लेकिन नियमित जांच के लिए यह बहुत कठिन है। इससे पहले की एक विधि, रिस्ट्रिक्शन फ्रैगमेंट लेंथ पॉलीमॉर्फिज्म (आर. एफ. एल. पी.) को अनुक्रम परिवर्तन को पहले से जानने की आवश्यकता नहीं थी, लेकिन यह आवश्यक था कि उत्परिवर्तन एक रिस्ट्रिक्शन एंजाइम के दरार स्थल को प्रभावित करे। आर. एफ. एल. पी. परख को संक्षिप्त रूप से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन इस तकनीक को जल्दी से पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पी. सी. आर.) प्रवर्धित डी. एन. ए. के ए. एस. ओ. विश्लेषण द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। पी. सी. आर. तकनीक को एलील-विशिष्ट पी. सी. आर. के रूप में बहुरूपता का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, संयुक्त पी. सी. आर./ए. एस. ओ. विधि की सरलता और बहुमुखी प्रतिभा ने इसका निरंतर उपयोग किया है, जिसमें गैर-रेडियोधर्मी लेबल शामिल हैं, और एक "रिवर्स डॉट ब्लॉट" प्रारूप में जहां ए. एस. ओ. जांच झिल्ली से बंधी होती है और संवर्धित नमूना डी. एन. ए. का उपयोग संकरण के लिए किया जाता है। आनुवंशिक अनुक्रम भिन्नताओं के लिए विशिष्ट जांच के रूप में सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग आर. ब्रूस वालेस द्वारा किया गया था, जो कैलिफोर्निया के डुआर्ट में सिटी ऑफ होप नेशनल मेडिकल सेंटर में काम कर रहे थे। 1979 में वालेस और उनके सहकर्मियों ने एकल-फंसे हुए जीवाणु वायरस में भिन्नताओं का पता लगाने के लिए ए. एस. ओ. जांच के उपयोग की सूचना दी, और बाद में मानव जीन का प्रतिरूपण करने के लिए तकनीक का उपयोग किया। 1983 और 1985 में वालेस की प्रयोगशाला ने पूरे जीनोमिक डी. एन. ए. के नमूनों में सिकल सेल एनीमिया के लिए उत्परिवर्तन का पता लगाने की सूचना दी, हालांकि इस अनुप्रयोग को लेबल की छोटी मात्रा से बाधित किया गया था जिसे ए. एस. ओ. द्वारा ले जाया जा सकता था। सौभाग्य से पी. सी. आर., डी. एन. ए. के एक विशिष्ट खंड को बहुत अधिक बढ़ाने की एक विधि, 1985 में भी रिपोर्ट की गई थी। एक साल से भी कम समय में पीसीआर को एएसओ विश्लेषण के साथ जोड़ा गया था। इस संयोजन ने ए. एस. ओ. लेबलिंग की समस्या को हल किया, क्योंकि लक्षित डी. एन. ए. की मात्रा को दस लाख गुना से अधिक बढ़ाया जा सकता था। इसके अलावा, पी. सी. आर. प्रक्रिया की विशिष्टता को ए. एस. ओ. जांच में जोड़ा जा सकता है, जिससे ए. एस. ओ. के गैर-लक्ष्य अनुक्रमों के साथ नकली बंधन की समस्या बहुत कम हो जाती है। संयोजन इतना विशिष्ट था कि इसका उपयोग एक साधारण डॉट ब्लॉट में किया जा सकता था, श्रमसाध्य और अक्षम दक्षिणी ब्लॉट विधि से बचा जा सकता था। ए. एस. ओ.-पी. सी. आर. के अन्य उपयोगों का उपयोग रक्त कैंसर जैसे मल्टीपल मायलोमा में न्यूनतम अवशिष्ट रोग का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। संदर्भ बाहरी लिंक एएसओ ऑटोरैडियोग्राम डीएनए प्रोफाइलिंग तकनीकों की छवि आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला तकनीक आणविक जीव विज्ञान तकनीक