Bicinchoninic acid assay
बाइसिनकोनिनिक एसिड परख (बी. सी. ए. परख), जिसे स्मिथ परख के रूप में भी जाना जाता है, इसके आविष्कारक, पियर्स केमिकल कंपनी में पॉल के. स्मिथ के बाद, जो अब थर्मो फिशर साइंटिफिक का हिस्सा है, लॉरी प्रोटीन परख, ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख या बायुरेट अभिकर्मक के समान एक घोल (0.5 माइक्रोग्राम/एमएल से 1.5 मिलीग्राम/एमएल) में प्रोटीन की कुल सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक जैव रासायनिक परख है। कुल प्रोटीन सांद्रता प्रोटीन सांद्रता के अनुपात में हरे से बैंगनी रंग में नमूना समाधान के रंग परिवर्तन द्वारा प्रदर्शित की जाती है, जिसे फिर रंगीन तकनीकों का उपयोग करके मापा जा सकता है। बी. सी. ए. परख को 1989 में पियर्स केमिकल कंपनी द्वारा पेटेंट कराया गया था और पेटेंट 2006 में समाप्त हो गया था। एक स्टॉक बी. सी. ए. घोल में पी. एच. 11.25 के साथ अत्यधिक क्षारीय घोल में निम्नलिखित तत्व होते हैंः बाइसिनकोनिनिक एसिड, सोडियम कार्बोनेट, सोडियम बाइकार्बोनेट, सोडियम टार्ट्रेट और कॉपर (II) सल्फेट पेंटाहाइड्रेट। बी. सी. ए. परख मुख्य रूप से दो प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करती है। सबसे पहले, प्रोटीन में पेप्टाइड बंधन कॉपर (II) सल्फेट से सी. यू. 2 + आयनों को सी. यू. 1 + (एक तापमान निर्भर प्रतिक्रिया) में कम कर देते हैं। क्यू2 + की मात्रा में कमी घोल में मौजूद प्रोटीन की मात्रा के समानुपाती होती है। इसके बाद, प्रत्येक क्यू1 + आयन के साथ बाइसिनकोनिनिक एसिड के दो अणु चीलेट होते हैं, जो एक बैंगनी रंग का परिसर बनाते हैं जो 562 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को दृढ़ता से अवशोषित करता है। बाइसिनकोनिनिक एसिड क्यू1 + कॉम्प्लेक्स प्रोटीन के नमूनों में सिस्टीन/सिस्टिन, टायरोसिन और ट्रिप्टोफैन साइड चेन की उपस्थिति से प्रभावित होता है। उच्च तापमान (37 से 60 डिग्री सेल्सियस) पर, पेप्टाइड बंधन प्रतिक्रिया परिसर के निर्माण में सहायता करते हैं। असमान अमीनो एसिड संरचना के कारण होने वाले अंतर को कम करते हुए उच्च तापमान पर बी. सी. ए. परख को इनक्यूबेट करने की सिफारिश परख संवेदनशीलता को बढ़ाने के तरीके के रूप में की जाती है। विलयन में मौजूद प्रोटीन की मात्रा को अवशोषण स्पेक्ट्रा को मापकर और ज्ञात सांद्रता के प्रोटीन विलयनों के साथ तुलना करके निर्धारित किया जा सकता है। सीमाएं बी. सी. ए. परख काफी हद तक कम करने वाले एजेंटों और धातु चेलेटरों के साथ असंगत है, हालांकि अल्प मात्रा को सहन किया जा सकता है। बी. सी. ए. परख कथित तौर पर सामान्य झिल्ली लिपिड और फॉस्फोलिपिड के लिए भी प्रतिक्रिया करता है। परख प्रकार बी. सी. ए. परख के कुछ वैकल्पिक रूप हैंः मूल बी. सी. ए. परख जैसा कि स्मिथ द्वारा वर्णित है, मूल बी. सी. ए. परख एक दो-घटक प्रोटोकॉल है। दोनों अभिकर्मक "कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल तक स्थिर" हैं। कम से कम दो वाणिज्यिक विक्रेताओं से आधुनिक (संभवतः सटीक या अत्यधिक समान) सूत्रीकरण उपलब्ध हैं। बी. सी. ए. कार्यशील समाधान अभिकर्मक ए और अभिकर्मक बी को 50:1 के अनुपात में मिलाकर उत्पन्न किया जाता है, और इसे या तो साप्ताहिक (यह मध्यम रूप से स्थिर है), या आवश्यकतानुसार तैयार किया जा सकता है। अभिकर्मक ए 1 प्रतिशत डब्ल्यू/वी बीसीए-ना 2 (सीएएसः 979-88-4) 2 प्रतिशत डब्ल्यू/वी ना 2सीओ 3 · एच 2 ओ (सीएएसः 5968-11-6) 0.16% डब्ल्यू/वी ना 2 टार्ट्रेट (सीएएसः 868-18-8) 4 प्रतिशत डब्ल्यू/वी नाओएच (सीएएसः 1310-73-2) 0.95% डब्ल्यू/वी नाहको 3 (सीएएसः 144-55-8) पीएच को 11.25 में समायोजित करने के लिए 50 प्रतिशत नाओएच या ठोस नाहको 3 जोड़ें। विशेष रूप से, स्मिथ ने इसैटिन और एसीटॉइन की पिफ़ित्ज़िंगर प्रतिक्रिया के माध्यम से अपने स्वयं के बी. सी. ए. को संश्लेषित किया, के. ओ. एच. के लिए एन. ए. ओ. एच. को प्रतिस्थापित किया, लेकिन अन्यथा लेसीन और हेंज़ की सिंथेटिक विधि का पालन किया, क्योंकि उस समय के वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध बी. सी. ए. उनके उपयोग के लिए बहुत अशुद्ध था। परख के लिए इसे पर्याप्त रूप से शुद्ध करने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पानी से उनके संश्लेषित बी. सी. ए. के कम से कम तीन क्रमिक पुनः क्रिस्टलीकरण की आवश्यकता थी। अभिकर्मक बी 4% डब्ल्यू/वी क्यूएसओ 4 · 5एच2ओ माइक्रो बीसीए परख (मंद समाधानों के लिए) बीसीए माइक्रो बीसीए परख एक 3-घटक प्रोटोकॉल है जो बायुरेट प्रतिक्रिया, बीसीए और तांबे (II) अभिकर्मकों के केंद्रित भंडार का उपयोग करता है। यह मूल बी. सी. ए. परख की ~ 2-40 माइक्रोग्राम/एमएल बनाम 20-2000 माइक्रोग्राम/एमएल की बेहतर संवेदनशीलता की अनुमति देता है। हालाँकि, इसमें एक अलग, और आम तौर पर अधिक संवेदनशील, गैर-प्रोटीन घटकों से हस्तक्षेप होता है। माइक्रो बी. सी. ए. परख के लिए किट कम से कम दो वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध हैं। विशेष रूप से, "माइक्रो बी. सी. ए. अभिकर्मक और प्रोटोकॉल" की संरचना और उपयोग का वर्णन स्मिथ द्वारा मूल पांडुलिपि में किया गया था, और आधुनिक किट में संभवतः एक सटीक या अत्यधिक समान सूत्रीकरण शामिल है। प्रोटोकॉल में सूक्ष्म-अभिकर्मक बी और तांबा समाधान 25:1 को मिलाकर सूक्ष्म-अभिकर्मक सी (एमसी) बनाया जाता है, जो शेल्फ स्थिर नहीं है और इसे नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए, और फिर एमसी 1:1 को सूक्ष्म-अभिकर्मक ए के साथ मिलाकर अंतिम (अस्थिर भी) परख कार्य समाधान तैयार किया जाना चाहिए। माइक्रो-रिएजेंट ए, माइक्रो-रिएजेंट बी और कॉपर सॉल्यूशन कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल तक स्थिर रहते हैं। सूक्ष्म-अभिकर्मक ए (एमए) 8 प्रतिशत डब्ल्यू/वी ना2सीओ3 · एच2ओ (सीएएसः 5968-11-6) 1.6 प्रतिशत डब्ल्यू/वी ना2 टार्ट्रेट (सीएएसः 1310-73-2) 1.6 प्रतिशत डब्ल्यू/वी ना2 टार्ट्रेट (सीएएसः 868-18-8) (ऊपर मूल बीसीए परख में अभिकर्मक ए के रूप में 10 गुना सांद्रता) पर्याप्त नाहको3 (सीएएसः 144-55-8) पीएच को 11.25 सूक्ष्म-अभिकर्मक बी (एमबी) 4 प्रतिशत डब्ल्यू/वी बीसीए-ना2 (सीएएसः 979-88-4) (ऊपर मूल बीसीए परख में अभिकर्मक ए के रूप में 4 गुना सांद्रता) कॉपर एस हालांकि यह कम करने वाले एजेंटों के साथ अधिक संगतता की अनुमति देता है, परख में अन्य गैर-प्रोटीन घटकों से अलग हस्तक्षेप प्रोफ़ाइल होती है। रैपिड गोल्ड बी. सी. ए. इस प्रकार का बी. सी. ए. परख केवल थर्मो फिशर साइंटिफिक से उपलब्ध प्रतीत होता है। कथित तौर पर यह एक अद्वितीय [स्वामित्व वाले] तांबे के चेलेटर के साथ पारंपरिक बी. सी. ए. प्रोटीन परख के समान तांबे को कम करने की विधि का उपयोग करता है। ", जो 562 एनएम के बजाय 480 एनएम पर अवशोषित होता है। यह प्रोपराइटर चेलेटर और अनुमानित अनुकूलित बायुरेट प्रतिक्रिया सूत्रीकरण मूल बी. सी. ए. परख के 37 डिग्री सेल्सियस + ऊष्मायन के बिना परख को तेजी से (<5 मिनट) परिणाम प्रदान करने की अनुमति देता है। हालांकि परख में अन्य गैर-प्रोटीन घटकों से एक अलग हस्तक्षेप प्रोफ़ाइल है। पियर्स क्वांटिटेटिव कलरिमेट्रिक पेप्टाइड परख (जो अब थर्मो फिशर साइंटिफिक के स्वामित्व में है और उससे उपलब्ध है) एक समान या समान 480 एनएम अवशोषित करने वाले स्वामित्व वाले तांबे के चेलेटर का उपयोग करता प्रतीत होता है। बायुरेट परीक्षण ब्रैडफोर्ड परख कोलॉइडल गोल्ड प्रोटीन परख संदर्भ बाहरी लिंक ओपनवेटवेयर बी. सी. ए. परख रसायन विज्ञान जैव रसायन विधियाँ रासायनिक परीक्षण डीः बाइसिनकोनिन्सौर देखें।