Fiber photometry
फाइबर फोटोमेट्री एक कैल्शियम इमेजिंग तकनीक है जो तंत्रिका परिपथ का अध्ययन करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्र या कार्यात्मक नेटवर्क के भीतर विशिष्ट कोशिका-प्रकारों से 'थोक' या जनसंख्या-स्तर कैल्शियम (Ca2 +) गतिविधि को पकड़ती है। जनसंख्या-स्तर कैल्शियम गतिविधि को व्यवहार संबंधी कार्यों के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है, जैसे कि स्थानिक शिक्षा, स्मृति स्मरण और लक्ष्य-निर्देशित व्यवहार। तकनीक में जीवित जानवरों के मस्तिष्क में फाइबर ऑप्टिक्स का शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण शामिल है। शोधकर्ताओं के लिए लाभ यह है कि ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपण के लिए सरल, कम आक्रामक और अन्य कैल्शियम विधियों की तुलना में कम खर्चीले होते हैं, और मिनीस्कोप की तुलना में जानवर पर कम वजन और तनाव होता है। यह कई अंतःक्रियाशील मस्तिष्क क्षेत्रों की इमेजिंग और अन्य तंत्रिका विज्ञान तकनीकों के साथ एकीकरण की भी अनुमति देता है। फाइबर फोटोमेट्री की सीमाएँ कम सेलुलर और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन हैं, और यह तथ्य कि जानवरों को सुरक्षित रूप से एक कठोर फाइबर बंडल से जोड़ा जाना चाहिए, जो चूहों जैसे छोटे स्तनधारियों के प्राकृतिक व्यवहार को प्रभावित कर सकता है। तकनीकी विवरण फाइबर फोटोमेट्री आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों (जी. ई. सी. आई.) की अभिव्यक्ति पर निर्भर करती है, जैसे जी. सी. ए. एम. पी. या आर. सी. ए. एम. पी., जिसे कोशिका-विशिष्ट प्रवर्तकों जैसे सी. ए. 2 +/कैलमोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज़ II (सी. ए. एम. के. आई. आई.) और मानव सिनेप्सिन (एच. एस. आई. एन.) का उपयोग करके विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित किया जा सकता है जो क्रमशः उत्तेजक न्यूरोनल और पैन-न्यूरोनल अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं। इन प्रवर्तकों का उपयोग ग्लियल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन (जी. एफ. ए. पी.) प्रवर्तक का उपयोग करके विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकारों के साथ-साथ गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है जो कैल्शियम गतिशीलता प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि एस्ट्रोसाइट्स। न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स दोनों में, क्रिया क्षमता के रूप में सेलुलर गतिविधि, न्यूरोट्रांसमीटर का एक्सोसाइटोसिस, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में परिवर्तन और जीन प्रतिलेखन Ca2 + आयनों के प्रवाह से जुड़ा होता है। अंतःकोशिकीय कैल्शियम के स्तर में इन गतिविधि-निर्भर परिवर्तनों की निगरानी कोशिका में जी. ई. सी. आई. को पेश करके की जा सकती है। आयनों के इस प्रवाह के बाद, जी. ई. सी. आई. सी. ए. 2 + बंधन पर प्रतिदीप्ति करते हैं और प्रतिदीप्ति में परिवर्तन अंतःकोशिकीय कैल्शियम परिवर्तनों के अनुपात में होता है। फाइबर फोटोमेट्री (और विवो इमेजिंग विधि में अन्य) के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला कैल्शियम संकेतक जीसीएएमपी6 है, हालांकि अतिरिक्त जीईसीआई को अद्वितीय प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा, गतिविज्ञान, संकेत-से-शोर अनुपात और कैल्शियम-संवेदनशीलता के साथ विकसित किया जाना जारी है। इन संकेतकों को मस्तिष्क में दो मुख्य तरीकों से व्यक्त किया जा सकता हैः वायरल अभिव्यक्ति और ट्रांसजेनिक माउस लाइनें। हाल ही में, संकेतकों की एक बढ़ती सूची रही है जो विभिन्न रासायनिक संकेतों को मापने के लिए उपलब्ध हो गए हैं, जैसे कि डोपामाइन सिग्नलिंग को रिकॉर्ड करने के लिए डी. लाइट, या ऑरेक्सिन को रिकॉर्ड करने के लिए ऑक्सलाइट, उदाहरण के लिए। जीसीएएमपी, आरसीएएमपी, डीएलाइट और अन्य संकेतक एक इष्टतम तरंग दैर्ध्य पर एक प्रकाश स्रोत द्वारा उत्तेजित होते हैं और बदले में अपने स्वयं के प्रकाश का उत्सर्जन करते हैं, जिससे समय के साथ कैल्शियम या न्यूरोट्रांसमीटर गतिशीलता की रिकॉर्डिंग की जा सकती है। फाइबर फोटोमेट्री प्रणालियों को प्रकाश की सटीक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो एक कैल्शियम के लिए विशिष्ट हैं (जैसे। जीसीएएमपी) या न्यूरोट्रांसमीटर संकेतक (जैसे। डी लाइट)। यह प्रकाश एक ऑप्टिकल फाइबर से एक फाइबर ऑप्टिक तक जाता है जिसे मस्तिष्क क्षेत्र या रुचि के क्षेत्रों में प्रत्यारोपित किया जाता है। कैल्शियम संकेतक यह है कि एक कोशिका-प्रकार विशिष्ट तरीके से व्यक्त किया जाता है जो इस प्रकाश से उत्तेजित होता है और बदले में, अपना संकेत उत्सर्जित करता है जो उसी फाइबर के माध्यम से वापस यात्रा करता है। ये एकत्र किए गए उत्सर्जन संकेत एक द्विकोणीय दर्पण द्वारा वर्णक्रमीय रूप से अलग किए जाते हैं, एक फिल्टर के माध्यम से पारित होते हैं और एक फोटोडिटेक्टर, वैज्ञानिक कैमरा या पीएमटी पर केंद्रित होते हैं। संग्रहित संकेत प्रारंभिक आधार रेखा (एफ) के सापेक्ष प्रतिदीप्ति (एफ) में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है। बदले में, शोधकर्ता एक संकेत का निरीक्षण कर सकते हैं जो कैल्शियम ट्रांसिएंट (δF/F) से मेल खाता है। इस समय श्रृंखला डेटा का विश्लेषण विभिन्न प्रकार की ओपन-सोर्स पाइपलाइनों का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसे कि पी. एम. ए. टी., पाईफोटोमेट्री और जी. यू. पी. पी.। महत्वपूर्ण रूप से, समस्थानिक संकेत कैल्शियम-स्वतंत्र संकेत हैं (अर्थात। लगभग 405-415 nm) जो कैल्शियम-निर्भर तरंग दैर्ध्य (यानी. जीसीएएमपी के लिए 470 एनएम)। चूँकि जीसीएएमपी की दो अवस्थाएँ हैं, सी. ए. 2 + बाध्य और अन-बाध्य, दोनों प्रोटीन संरचनाओं में अद्वितीय उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है। उत्तेजना की तरंग दैर्ध्य जिस पर जीसीएएमपी में Ca2 + के साथ और उसके बिना समान अवशोषण होता है, वह आइसोस्बेस्टिक है और कैल्शियम-स्वतंत्र प्रतिदीप्ति आधार रेखा को निर्धारित करता है। इस कैल्शियम-स्वतंत्र संकेत में पशु गति और ऊतक स्व-प्रतिदीप्ति परिलक्षित होते हैं और प्रतिदीप्ति में वास्तविक परिवर्तन को प्रकट करने के लिए घटाया या प्रतिदीप्ति किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से कूटबद्ध कैल्शियम संकेतक (जी. ई. सी. आई.) आनुवंशिक रूप से कूटबद्ध कैल्शियम संकेतक क्या हैं? आनुवंशिक रूप से कूटबद्ध कैल्शियम संकेतकों (जी. ई. सी. आई.) की इष्टतम अभिव्यक्ति को दो तरीकों से पूरा किया जा सकता हैः एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर और ट्रांसजेनिक कृंतक रेखाएँ। वायरल इंजेक्शन के लिए रुचि के मस्तिष्क क्षेत्र में जी. ई. सी. आई. जलसेक की आवश्यकता होती है। इस वायरस को क्रमशः उत्तेजक न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स को लक्षित करने के लिए सी. ए. एम. के. आई. आई. और जी. एफ. ए. पी. जैसे कोशिका-विशिष्ट प्रवर्तकों के उपयोग के माध्यम से अद्वितीय कोशिका-प्रकारों को संक्रमित करने के लिए लक्षित किया जा सकता है। यह तंत्रिका गतिविधि को एक प्रत्यारोपित ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से न्यूरॉन्स या ग्लियल कोशिकाओं की आनुवंशिक रूप से परिभाषित उप-जनसंख्या से दर्ज करने की अनुमति देता है। वायरल अभिव्यक्ति के लिए मस्तिष्क में इष्टतम अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए डाइलूशन के अनुमापन की आवश्यकता होती है, जो कुछ प्रयोगों के लिए ट्रांसजेनिक कृंतक रेखाओं का उपयोग करने के बजाय आवश्यक हो सकता है। जी. ई. सी. आई. की अभिव्यक्ति ट्रांसजेनिक रेखाओं के उपयोग के माध्यम से भी की जा सकती है जो पूरे मस्तिष्क में सर्वव्यापी अभिव्यक्ति की अनुमति देती हैं। चूहे या चूहे के तनाव के आधार पर, अभिव्यक्ति मस्तिष्क क्षेत्रों में भिन्न हो सकती है, जो रिकॉर्डिंग के दौरान संभावित चुनौतियों का सामना कर सकती है। जीसीएएमपी क्या है? जीसीएएमपी एक आनुवंशिक रूप से कूटबद्ध कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) है जिसका उपयोग आमतौर पर कई इमेजिंग विधियों में किया जाता है। जी. सी. ए. एम. पी. प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है जब संकेतक कैल्शियम आयन (सी. ए. 2 +) से बंधा होता है। यह कैल्शियम संकेत सीधे तंत्रिका प्रतिक्रिया पैटर्न, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और झिल्ली उत्तेजना से जुड़ा हुआ है। जीसीएएमपी और इसके समस्थानिक संकेत के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य क्रमशः लगभग 470 एनएम और 415 एनएम (नीला) है। लक्ष्य संकेतक के अधिकतम अवशोषण और समस्थानिक बिंदुओं को फोटो-उत्तेजित करना है। जीसीएएमपी का समस्थानिक बिंदु कैल्शियम-स्वतंत्र संकेत है, लगभग 405-415 एनएम। यह जीसीएएमपी के आधार पर निर्धारित किया जाता है जिसमें दो कार्यात्मक अवस्थाएँ होती हैं, जो कैल्शियम आयनों से बंधी और अनबाउंड होती हैं। इन दोनों राज्यों में अद्वितीय प्रोटीन उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है। उत्तेजना की तरंग दैर्ध्य जहां इन दो प्रोटीन अवस्थाओं में समान अवशोषण होता है, वह समस्थानिक बिंदु है और बेसलाइन प्रतिदीप्ति निर्धारित करता है। इस कैल्शियम-स्वतंत्र संकेत में गति और स्व-प्रतिदीप्ति प्रतिबिंबित होती है और एक व्यवहार कार्य या प्रयोगात्मक हेरफेर के दौरान सेलुलर प्रतिदीप्ति में वास्तविक परिवर्तन को प्रकट करने के लिए घटाया या वापस किया जा सकता है। जीसीएएमपी की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य लगभग 525 एनएम (हरा) है, जिसका विश्लेषण किया जा सकता है और व्यवहार संबंधी कार्यों के दौरान समय के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। मल्टीपल-कलर फाइबर फोटोमेट्री कई कोशिका प्रकारों में एक साथ कैल्शियम गतिशीलता का निरीक्षण करने के लिए, शोधकर्ताओं ने एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में दो या दो से अधिक जी. ई. सी. आई. को जोड़ा है। उदाहरण के लिए, एक शोध समूह ने हरे और लाल जी. ई. सी. आई., जी. सी. ए. एम. पी. 6. एफ. और जे. आर. जी. ई. सी. ओ. 1. ए. से प्रतिदीप्ति दर्ज की, जो स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों में स्ट्रैटल डायरेक्ट-एंड इनडायरेक्ट-पाथवे स्पाईनी प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स में भिन्न रूप से व्यक्त किए गए थे। एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में कई जी. ई. सी. आई. की अभिव्यक्ति केवल न्यूरॉन्स के दो सेटों में नहीं की जा सकती है, जैसा कि पिछले अध्ययन में दिखाया गया है। थोक कैल्शियम की ये एक साथ रिकॉर्डिंग कई प्रकार की कोशिकाओं के साथ भी की जा सकती हैं, जैसे कि न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स। ये कोशिका प्रकार जी. एफ. ए. पी. और एच. सिन जैसे अद्वितीय प्रवर्तकों को व्यक्त करते हैं, और जी. ई. सी. आई. को विशेष रूप से इस तरह से लक्षित किया जा सकता है। एक अन्य शोध समूह ने एस्ट्रोसाइट-और न्यूरॉन-विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग करके सफल दोहरे रंग के फाइबर फोटोमेट्री का प्रदर्शन किया, जबकि चूहों ने स्वतंत्र रूप से एक कार्यशील स्मृति कार्य (टी-मेज़) का प्रदर्शन किया। उपकरण फाइबर फोटोमेट्री का लक्ष्य मस्तिष्क के रुचि वाले क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं की विशिष्ट आबादी से थोक कैल्शियम संकेत को सटीक रूप से वितरित करना, निकालना और रिकॉर्ड करना है। संकेत तक पहुँचने के लिए, जी. ई. सी. आई. अभिव्यक्ति स्थल पर एक ऑप्टिकल कैनुला/फाइबर को शल्य चिकित्सा द्वारा प्रत्यारोपित किया जाना चाहिए। यह ऑप्टिकल फाइबर केवल जनसंख्या-स्तर के कैल्शियम संकेत को एकत्र कर सकता है, व्यक्तिगत कोशिका गतिविधि को नहीं। इसके अतिरिक्त, ऑप्टिकल फाइबर गहरी और उथली मस्तिष्क संरचनाओं दोनों से रिकॉर्डिंग की अनुमति देते हैं, और जीआरआईएन लेंस या कॉर्टिकल खिड़कियों के विपरीत ऊतक क्षति को कम करते हैं। जीसीएएमपी में क्रमशः लगभग 470 एनएम और 530 एनएम पर विशिष्ट उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है। जी. ई. सी. आई. को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक कम प्रकाशिक शक्ति के कारण एल. ई. डी. प्रकाश स्रोत सबसे अधिक चुने जाने वाले स्रोतों में से हैं। मस्तिष्क से इमेजिंग उपकरण तक द्विदिशात्मक रूप से उत्तेजना और उत्सर्जन संकेतों का उचित संचरण द्विध्रुवीय दर्पण और उत्तेजना/उत्सर्जन फिल्टर द्वारा समन्वित किया जाता है। तीन अलग-अलग प्रकार के इमेजिंग उपकरण हैंः फोटोडिटेक्टर, फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) और वैज्ञानिक कैमरे। एकल मस्तिष्क क्षेत्र से संकेत एकत्र करते समय, उनके तेज अधिग्रहण और कम संकेत-से-शोर अनुपात (एस. एन. आर.) के कारण एक फोटोडिटेक्टर या पी. एम. टी. का उपयोग करना विशिष्ट है। वैकल्पिक रूप से, मस्तिष्क के कई क्षेत्रों से एकत्र करते समय, वैज्ञानिक कैमरों या कई फोटोडिटेक्टर या पीएमटी का उपयोग किया जाना चाहिए। कुल मिलाकर, यह प्रणाली ऑप्टिकल कैनुला, प्रकाश स्रोत और इमेजिंग उपकरण के बीच युग्मन की अनुमति देती है। जी. ई. सी. आई. को सटीक प्रकाश वितरण ऑप्टिकल कैनुला/फाइबर द्वारा सक्षम किया जाता है और रिकॉर्डिंग के दौरान इमेजिंग डिवाइस द्वारा उत्सर्जन संकेत एकत्र किया जाता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फाइबर फोटोमेट्री प्रणालियों के कुछ उदाहरणों में न्यूरोफोटोमेट्रिक्स, इंस्कोपिक्स और माइटेक्सबायो शामिल हैं। लाभ और सीमाएँ सभी वैज्ञानिक विधियों में विचार होते हैं जिन्हें उपयोग करने से पहले ध्यान में रखा जाना चाहिए। कैल्शियम इमेजिंग के लिए अन्य तकनीकों की तुलना में फाइबर फोटोमेट्री के कई लाभ हैं, लेकिन यह सीमाओं के साथ आता है। लाभ प्रयोगशाला में उन व्यक्तियों के लिए जो अपने प्रयोगों में कैल्शियम इमेजिंग को एकीकृत करना चाहते हैं, लेकिन अभी तक ऐसा करने के लिए वित्तीय या तकनीकी परिस्थितियाँ नहीं हो सकती हैं, फाइबर फोटोमेट्री प्रवेश की एक कम बाधा है। ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यारोपण के लिए सरल, कम आक्रामक होते हैं और अन्य कैल्शियम विधियों जैसे कि एक या दो-फोटॉन इमेजिंग की तुलना में अधिक सस्ते होते हैं। यह अनुदैर्ध्य व्यवहार प्रतिमानों के लिए अच्छा है क्योंकि मिनीस्कोप की तुलना में जानवर पर कम वजन और तनाव होता है। यह अन्य तरीकों की तुलना में जानवर की गतिशीलता को काफी कम सीमित करता है, जिससे बड़े कृंतक मॉडल में अधिक स्वतंत्र रूप से चलने वाले, प्राकृतिक व्यवहार की अनुमति मिलती है। यह एक बहुमुखी तकनीक है, जो कई अंतःक्रियाशील मस्तिष्क क्षेत्रों की इमेजिंग और ऑप्टोजेनेटिक्स, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और अधिक सिस्टम-स्तरीय तंत्रिका विज्ञान तकनीकों के साथ एकीकरण की अनुमति देती है। हाल ही में, इस तकनीक को न्यूरोट्रांसमीटर गतिविधि या पीएच परिवर्तन के लिए अन्य फ्लोरोसेंट संकेतकों के साथ जोड़ा जा सकता है। प्रयोगों की योजना बनाते समय फाइबर फोटोमेट्री की प्रमुख सीमा पर विचार करना महत्वपूर्ण हैः कम सेलुलर और स्थानिक संकल्प। ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन की इस कमी को देखने के क्षेत्र के भीतर गतिविधि के एकत्रीकरण के संग्रह के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जो केवल फ्लोरोसेंट सिग्नल में 'थोक' परिवर्तनों की अनुमति देता है। यद्यपि एक ऑप्टिकल कैनुला का आकार अन्य कैल्शियम इमेजिंग विधियों में उपयोग की जाने वाली तकनीक की तुलना में बहुत छोटा है, जैसे कि एक-और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, जानवरों को सुरक्षित रूप से एक कठोर फाइबर बंडल से जोड़ा जाना चाहिए। यह चूहों जैसे छोटे स्तनधारियों के प्राकृतिक व्यवहार को सीमित कर सकता है। अन्य विधियों ऑप्टोजेनेटिक्स और डी. आर. ई. ए. डी. डी. के साथ एकीकरण तंत्रिका गतिविधि और व्यवहार के बीच एक कारण संबंध बनाने के लिए फाइबर फोटोमेट्री को सेलुलर हेरफेर के साथ एकीकृत किया जा सकता है। मस्तिष्क में परिभाषित कोशिका प्रकारों और अनुमानों के लक्षित मॉडुलन को ऑप्टोजेनेटिक्स या डिजाइनर रिसेप्टर्स एक्सक्लूसिवली एक्टिवेटेड बाय डिजाइनर ड्रग्स (डी. आर. ई. ए. डी. डी.) का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। विधि का चयन अन्य कारकों के साथ-साथ प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक अस्थायी सटीकता के आधार पर किया जाता है। ऑप्टोजेनेटिक्स उच्च अस्थायी परिशुद्धता के साथ एक विशिष्ट कोशिका-प्रकार के हेरफेर की अनुमति देता है। डी. आर. ई. ए. डी. डी. में लिगैंड के फार्माकोकाइनेटिक्स, जैसे कि क्लोज़ापाइन-एन-ऑक्साइड (सी. एन. ओ.) या डेस्क्लोरोक्लोज़ापाइन (डी. सी. जेड.) के कारण बहुत कम अस्थायी सटीकता होती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एक साथ ऑप्टिकल रीडआउट और ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर कई संभावित मुद्दों के साथ आता है जिन पर नीचे चर्चा की गई है। इसके अतिरिक्त, फाइबर फोटोमेट्री को एक ही जानवर के भीतर इन विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ जोड़ा जा सकता है। जब संयुक्त किया जाता है, तो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग और कैल्शियम इमेजिंग के इस संयोजन का उपयोग स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले पशु मॉडल में न्यूरोनल एक्शन पोटेंशियल के उच्च अस्थायी परिशुद्धता रीड-आउट के साथ कोशिका-प्रकार विशिष्ट गतिविधि का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। संभावित समस्याएं और समाधान समान न्यूरॉन्स को ऑप्टोजेनेटिक जांच और कैल्शियम संकेतकों की डिलीवरी और अभिव्यक्ति समस्याएं पैदा कर सकती है। कैल्सियम संकेतकों और हेरफेर चैनलों में अतिव्यापी उत्तेजना स्पेक्ट्रम हो सकते हैं, जैसे कि जीसीएएमपी और चैनलहोडॉप्सिन (सीएचआर2), दोनों में लगभग 470 एनएम पर उत्तेजना की चरम तरंग दैर्ध्य होती है। कैल्शियम संकेतक की उत्तेजना संभावित रूप से ऑप्टोजेनेटिक प्रकाश-संवेदनशील आयन चैनल को सक्रिय कर सकती है। कैल्शियम संकेत में मापा गया परिवर्तन आसानी से कैल्शियम या ऑप्टोजेनेटिक-प्रेरित संकेत में वास्तविक परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार नहीं ठहराया जा सकता है। इस मुद्दे के समाधान में उन संकेतकों का संयोजन शामिल है जिनमें आपके ऑप्टोजेनेटिक जांच या कैल्शियम संकेतक के साथ गैर-अतिव्यापी उत्तेजना स्पेक्ट्रम है। कैल्सियम संकेतक (जीसीएएमपी, आरसीएएमपी) और ऑप्टोजेनेटिक प्रोब फॉर एक्साइटेशन (सीएचआर2, क्रिमसन) और इनहिबिशन (ईएनपीएचआर, आर्क, जॉज) इसके लिए विकल्प हैं। अन्य कैल्शियम इमेजिंग विधियाँ मिनीस्कोप और एकल-फोटॉन इमेजिंग मिनीस्कोप सिर-घुड़सवार, लघु सूक्ष्मदर्शी हैं जो स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों और चूहों में तंत्रिका गतिविधि की बड़ी आबादी की इमेजिंग की अनुमति देते हैं। यह उनके छोटे आकार के कारण संभव है, क्योंकि वे एक चूहे या चूहे के लिए व्यवहार में बहुत हस्तक्षेप किए बिना आसानी से ले जाने के लिए पर्याप्त हल्के हैं। शोधकर्ता प्रत्यारोपित ग्रेडिएंट-रिफ्रैक्टिव-इंडेक्स (जीआरआईएन) लेंस या कॉर्टिकल खिड़कियों के साथ मिनीस्कोप जोड़ते हैं जो गहरी और सतही मस्तिष्क इमेजिंग को सक्षम करते हैं। यह विधि एक ही जानवर के भीतर सैकड़ों आनुवंशिक रूप से और स्थानिक रूप से परिभाषित कोशिकाओं की गतिविधि की निगरानी के लिए आदर्श है। फाइबर फोटोमेट्री की तुलना में, मिनीस्कोप उच्च सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ इमेजिंग की अनुमति देते हैं, जो व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम में परिवर्तन का पता लगाते हैं। इसके अतिरिक्त, यह विधि समय के साथ बार-बार इमेजिंग को 'स्वस्थ' से रोगजनक स्थितियों या व्यवहार के दौरान परिवर्तनों का विश्लेषण करने में सक्षम बनाती है। हालांकि, इमेजिंग की इस विधि में कम संवेदनशीलता और उच्च शोर होता है, जो दो-फोटॉन जैसी अन्य बहु-फोटॉन विधियों की तुलना में कम रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का उत्पादन करता है। ये लघु सूक्ष्मदर्शी दूर-लाल-स्थानांतरित संकेतकों का पता लगाने की अपनी क्षमता में सीमित हैं जो यहां ऑप्टोजेनेटिक्स और कैल्शियम इमेजिंग के संयोजन के लिए आवश्यक होंगे, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है। टू-फोटॉन इमेजिंग टू-फोटॉन इमेजिंग एक अन्य कैल्शियम इमेजिंग विधि है जो सेलुलर जी. ई. सी. आई. डायनामिक्स में उतार-चढ़ाव को रिकॉर्ड करती है। यह मस्तिष्क की सतह के नीचे 600-700 माइक्रोन तक अत्यधिक प्रकाश-प्रकीर्णित मस्तिष्क ऊतक में प्रवेश करने का एक तरीका प्रदान करता है। अन्य तकनीकों की तुलना में, दो-फोटॉन एक अच्छी तरह से परिभाषित फोकल प्लेन के भीतर उच्च सेलुलर और उप-सेलुलर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, जैसे कि डेंड्राइट और एक्सोनल बाउटॉन के भीतर। हालांकि, एक ऑप्टिकल कैनुला या माइक्रो-एंडोस्कोप की सहायता के बिना, यह विधि अधिक सतही मस्तिष्क क्षेत्रों तक सीमित है। इस प्रकार की इमेजिंग के लिए यह भी आवश्यक है कि जानवर सिर-स्थिर रहें, कुछ जटिल व्यवहार कार्यों के लिए आवश्यक प्राकृतिक व्यवहार को सीमित करें। संदर्भ विकिपीडिया छात्र कार्यक्रम कैल्शियम इमेजिंग तंत्रिका विज्ञान