GAL4/UAS system
जी. ए. एल. 4-यू. ए. एस. प्रणाली एक जैव रासायनिक विधि है जिसका उपयोग फल मक्खी जैसे जीवों में जीन अभिव्यक्ति और कार्य का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यह 1988 में हितोशी काकिदानी और मार्क पटाशने, और निकोलस वेबस्टर और पियरे चैम्बोन की खोज पर आधारित है कि यू. ए. एस. अनुक्रमों से जुड़ने वाला गैल4 जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है। इस विधि को 1993 में एंड्रिया ब्रांड और नॉर्बर्ट पेरिमोन द्वारा मक्खियों में पेश किया गया था और इसे जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक माना जाता है। प्रणाली के दो भाग हैंः गेल4 जीन, जो खमीर प्रतिलेखन सक्रियक प्रोटीन गेल4 को कूटबद्ध करता है, और यू. ए. एस. (अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम), एक वर्धक जिसे जी. ए. एल. 4 विशेष रूप से जीन प्रतिलेखन को सक्रिय करने के लिए बांधता है। अवलोकन गैल4 प्रणाली यह परिभाषित करने की समस्याओं को अलग करने की अनुमति देती है कि कौन सी कोशिकाएँ एक जीन या प्रोटीन को व्यक्त करती हैं और प्रयोगकर्ता इस ज्ञान के साथ क्या करना चाहता है। आनुवंशिकीविदों ने मॉडल जीवों (आमतौर पर फल मक्खियों) के आनुवंशिक रूप बनाए हैं, जिन्हें जी. ए. एल. 4 रेखाएं कहा जाता है, जिनमें से प्रत्येक जानवर के ऊतकों के कुछ सबसेट में जी. ए. एल. 4 को व्यक्त करता है। उदाहरण के लिए, कुछ रेखाएँ जी. ए. एल. 4 को केवल मांसपेशियों की कोशिकाओं में, या केवल नसों में, या केवल एंटीना में, और इसी तरह व्यक्त कर सकती हैं। विशेष रूप से फल मक्खियों के लिए, ऐसी हजारों लाइनें हैं, जिनमें सबसे उपयोगी व्यक्त करने वाली जी. ए. एल. 4 जानवर के केवल एक बहुत ही विशिष्ट सबसेट में होती है-शायद, उदाहरण के लिए, केवल वे न्यूरॉन्स जो मक्खी के मस्तिष्क के दो विशिष्ट डिब्बों को जोड़ते हैं। इन कोशिकाओं में जी. ए. एल. 4 की उपस्थिति का बहुत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, क्योंकि जी. ए. एल. 4 का मुख्य प्रभाव यू. ए. एस. क्षेत्र से जुड़ना है, और अधिकांश कोशिकाओं में कोई (या हानिरहित) यू. ए. एस. क्षेत्र नहीं होते हैं। चूँकि गैल4 अपने आप में दिखाई नहीं देता है, और कोशिकाओं पर इसका बहुत कम प्रभाव पड़ता है, इस प्रणाली का दूसरा आवश्यक हिस्सा "रिपोर्टर लाइन्स" है। ये एक वांछित जीन के बगल में विशेष यू. ए. एस. क्षेत्र के साथ मक्खियों के उपभेद हैं। ये आनुवंशिक निर्देश पशु की प्रत्येक कोशिका में होते हैं, लेकिन अधिकांश कोशिकाओं में कुछ नहीं होता है क्योंकि वह कोशिका जी. ए. एल. 4 का उत्पादन नहीं कर रही है। जी. ए. एल. 4 का उत्पादन करने वाली कोशिकाओं में, हालांकि, यू. ए. एस. सक्रिय हो जाता है, इसके बगल में जीन चालू हो जाता है, और यह अपने परिणामी प्रोटीन का उत्पादन शुरू कर देता है। यह अन्वेषक को रिपोर्ट कर सकता है कि कौन सी कोशिकाएं जी. ए. एल. 4 को व्यक्त कर रही हैं, इसलिए "रिपोर्टर लाइन" शब्द का उपयोग किया जाता है, लेकिन कोशिका व्यवहार में हेरफेर करने के लिए अक्सर जीन का भी उपयोग किया जाता है। विशिष्ट रिपोर्टर जीन में शामिल हैंः हरे (जी. एफ. पी.) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आर. एफ. पी.) जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जो वैज्ञानिकों को यह देखने की अनुमति देते हैं कि कौन सी कोशिकाएं गैल4 चैनलहोडॉप्सिन को व्यक्त करती हैं, जो तंत्रिका कोशिकाओं हेलोरहोडॉप्सिन के प्रकाश-संवेदनशील ट्रिगर की अनुमति देती है, जो इसके विपरीत प्रकाश को न्यूरॉन्स शिबायर के फायरिंग को दबाने की अनुमति देती है, जो न्यूरॉन्स को बंद कर देता है, लेकिन केवल उच्च तापमान (30 डिग्री सेल्सियस और उससे अधिक) पर। इस जीन के साथ मक्खियों को कम तापमान पर उठाया और परीक्षण किया जा सकता है जहां उनके न्यूरॉन्स सामान्य रूप से व्यवहार करेंगे। फिर मक्खियों के शरीर का तापमान बढ़ाया जा सकता है (क्योंकि वे ठंडे खून वाले होते हैं), और ये न्यूरॉन्स बंद हो जाते हैं। यदि मक्खी का व्यवहार बदलता है, तो यह एक मजबूत संकेत देता है कि वे न्यूरॉन्स क्या करते हैं। जी. ई. सी. आई. (जेनेटिकली एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर), अक्सर प्रोटीन के जी. सी. ए. एम. पी. परिवार का सदस्य होता है। ये प्रोटीन कैल्शियम के संपर्क में आने पर फ्लोरोसेंस करते हैं, जो अधिकांश कोशिकाओं में तब होता है जब न्यूरॉन में आग लगती है। यह वैज्ञानिकों को तस्वीरें, या फिल्में लेने की अनुमति देता है, जो तंत्रिका तंत्र के संचालन को दर्शाते हैं। उदाहरण के लिए, वैज्ञानिक पहले जी. ए. एल. 4 लाइन से एक मक्खी का चयन करके न्यूरॉन्स के एक वर्ग की कल्पना कर सकते हैं जो न्यूरॉन्स के वांछित सेट में जी. ए. एल. 4 को व्यक्त करता है, और इसे जी. एफ. पी. को व्यक्त करने वाली रिपोर्टर लाइन के साथ पार करता है। संतान में, कोशिकाओं का वांछित उपसमुच्चय जी. ए. एल. 4 बनाएगा, और इन कोशिकाओं में जी. ए. एल. 4 यू. ए. एस. से जुड़ जाएगा, और जी. एफ. पी. के उत्पादन को सक्षम करेगा। इसलिए कोशिकाओं का वांछित उपसमुच्चय अब हरे रंग में प्रतिदीप्ति करेगा और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ इसका पालन किया जा सकता है। इसके बाद, यह पता लगाने के लिए कि ये कोशिकाएं क्या कर सकती हैं, प्रयोगकर्ता चैनलहोडॉप्सिन रिपोर्टर लाइन के साथ एक ही जी. ए. एल. 4 रेखा को पार करके इनमें से प्रत्येक कोशिका में चैनलहोडॉप्सिन को व्यक्त कर सकता है। संतानों में चयनित कोशिकाओं और केवल उन्हीं कोशिकाओं में चैनलहोडॉप्सिन होगा और एक उज्ज्वल प्रकाश द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। अब वैज्ञानिक इन विशेष कोशिकाओं को अपनी इच्छानुसार सक्रिय कर सकते हैं, और यह देखने के लिए कि ये कोशिकाएं क्या कर सकती हैं, परिणामी व्यवहार की जांच कर सकते हैं। ऑपरेशन गैल4 एक मॉड्यूलर प्रोटीन है जिसमें मोटे तौर पर एक डीएनए-बाइंडिंग डोमेन और एक सक्रियण डोमेन होता है। यू. ए. एस. जिससे जी. ए. एल. 4 जुड़ता है वह सी. जी. जी.-एन11-सी. सी. जी. है, जहाँ एन. कोई भी आधार हो सकता है। हालाँकि जी. ए. एल. 4 एक खमीर प्रोटीन है जो आम तौर पर अन्य जीवों में मौजूद नहीं होता है, लेकिन इसे ड्रोसोफिला और मानव कोशिकाओं जैसे विभिन्न जीवों में प्रतिलेखन सक्रियक के रूप में काम करने के लिए दिखाया गया है, जो इस बात पर प्रकाश डालता है कि जीन अभिव्यक्ति के लिए समान तंत्र को विकास के दौरान संरक्षित किया गया है। ड्रोसोफिला में अध्ययन के लिए, जी. ए. एल. 4 जीन को एक देशी जीन प्रवर्तक, या चालक जीन के नियंत्रण में रखा जाता है, जबकि यू. ए. एस. एक लक्षित जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। जी. ए. एल. 4 को केवल उन कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है जहां चालक जीन आमतौर पर सक्रिय होता है। बदले में, जी. ए. एल. 4 को केवल जीन प्रतिलेखन को सक्रिय करना चाहिए जहां एक यू. ए. एस. पेश किया गया है। उदाहरण के लिए, जी. एफ. पी. (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) जैसे दृश्य मार्कर को एन्कोडिंग करने वाले जीन को फ्यूज करके चालक जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न को निर्धारित किया जा सकता है। जी. ए. एल. 4 और यू. ए. एस. ड्रोसोफिला में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी हैं क्योंकि वे सामान्य रूप से मौजूद नहीं होते हैं और उनकी अभिव्यक्ति कोशिका में अन्य प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप नहीं करती है। उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला में जी. ए. एल. 4/यू. ए. एस.-विनियमित ट्रांसजीनों का उपयोग वर्णक फैलाव कारक (पी. डी. एफ.) नामक एक ज्ञात लयबद्ध सर्कैडियन उत्पादन में अतालता व्यवहार उत्पन्न करने के लिए ग्लियल अभिव्यक्ति को बदलने के लिए किया गया है। हालांकि, कुछ शोधों ने संकेत दिया है कि ड्रोसोफिला में जी. ए. एल. 4 की अत्यधिक अभिव्यक्ति के दुष्प्रभाव हो सकते हैं, जो संभवतः प्रतिरक्षा और तनाव प्रतिक्रियाओं से संबंधित है जो अनिवार्य रूप से एक विदेशी प्रोटीन है। जी. ए. एल. 4-यू. ए. एस. प्रणाली को अफ्रीकी पंजों वाले मेंढक ज़ेनोपस और ज़ेबराफिश जैसे ड्रोसोफिला के अलावा जीवों में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए भी नियोजित किया गया है। जी. ए. एल. 4/यू. ए. एस. प्रणाली का उपयोग टू-हाइब्रिड स्क्रीनिंग में भी किया जाता है, जो दो प्रोटीन या डी. एन. ए. के साथ एक प्रोटीन के बीच बातचीत की पहचान करने की एक विधि है। विस्तार गैल4 अभिव्यक्ति को "प्रतिच्छेदन रणनीतियों" के माध्यम से और भी अधिक विशिष्ट बनाया जा सकता है। ये दो अलग-अलग जी. ए. एल. 4 रेखाओं को जोड़ सकते हैं-मान लीजिए, ए और बी-इस तरह से कि जी. ए. एल. 4 केवल उन कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है जो रेखा ए में हैं लेकिन रेखा बी में नहीं हैं, या जो रेखा ए और बी दोनों में हैं। जब आंतरिक रूप से विरल जी. ए. एल. 4 लाइनों के साथ जोड़ा जाता है, तो यह बहुत विशिष्ट चयन प्रदान करता है, जो अक्सर एक एकल कोशिका प्रकार तक सीमित होता है। नुकसान यह है कि कम से कम तीन स्वतंत्र सम्मिलन स्थलों की आवश्यकता होती है, इसलिए रेखाओं को अलग-अलग और स्वतंत्र सम्मिलन स्थलों का उपयोग करना चाहिए, और वांछित अंतिम जीवों को बनाने के लिए एक क्रॉस से अधिक की आवश्यकता होती है। यह अनुसंधान का एक बहुत ही सक्रिय क्षेत्र है, और ऐसी कई अंतःच्छेदन रणनीतियाँ हैं, जिनमें से दो की चर्चा नीचे की गई है। उन कोशिकाओं में जी. ए. एल. 4 अभिव्यक्ति बनाने का एक तरीका जो रेखा ए में हैं लेकिन रेखा बी में नहीं हैं, जी. ए. एल. 4 को व्यक्त करने के लिए रेखा ए की आवश्यकता होती है, और रेखा बी को जी. ए. एल. 80 को व्यक्त करने के लिए बनाया जाता है, जो एक जी. ए. एल. 4 अवरोधक है। इसलिए, केवल वे कोशिकाएँ जो ए में हैं लेकिन बी में नहीं हैं, उनमें सक्रिय जी. ए. एल. 4 होगा, जो तब रिपोर्टर जीन को चला सकती हैं। केवल ए और बी दोनों में निहित कोशिकाओं में जी. ए. एल. 4 को व्यक्त करने के लिए, "स्प्लिट-जी. ए. एल. 4" नामक एक तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। रेखा ए को जी. ए. एल. 4 प्रोटीन के आधे हिस्से को व्यक्त करने के लिए बनाया गया है, जो अपने आप में निष्क्रिय है। इसी तरह, रेखा बी को जी. ए. एल. 4 के दूसरे आधे हिस्से को व्यक्त करने के लिए बनाया गया है, जो स्वयं भी निष्क्रिय है। केवल वे कोशिकाएँ जो दोनों पंक्तियों में होती हैं, दोनों हिस्सों को बनाती हैं, जो ल्यूसीन ज़िपर द्वारा जी. ए. एल. 4 में स्वयं इकट्ठा होती हैं और रिपोर्टर जीन को सक्रिय करती हैं। संदर्भ आनुवंशिकी