Cell synchronization
कोशिका तुल्यकालन एक ऐसी प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों में एक संवर्धन में कोशिकाओं को एक ही चरण में लाया जाता है। कोशिका समकालिकता कोशिका चक्र के माध्यम से प्रगति करने वाली कोशिकाओं के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है क्योंकि यह केवल एकल-कोशिका प्रयोगों पर निर्भर रहने के बजाय जनसंख्या-व्यापी डेटा एकत्र करने की अनुमति देता है। समन्वय के प्रकारों को मोटे तौर पर दो समूहों में वर्गीकृत किया गया है; भौतिक विभाजन और रासायनिक अवरोध। शारीरिक पृथक्करण एक ऐसी प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोशिकाओं को लगातार विभाजित करने वाली कोशिकाओं को निम्नलिखित विशेषताओं के आधार पर चरण-समृद्ध आबादी में अलग किया जाता है जैसे किः कोशिका घनत्व कोशिका का आकार एंटीबॉडी द्वारा चिह्नित कोशिका सतह एपिटोप की उपस्थिति लेबल वाली कोशिकाओं द्वारा हल्का बिच्छुरित फ्लोरोसेंट उत्सर्जन। यह देखते हुए कि कोशिकाएं पूरे कोशिका चक्र में अलग-अलग आकृति विज्ञान और सतह मार्कर लेती हैं, इन लक्षणों का उपयोग चरण द्वारा अलग करने के लिए किया जा सकता है। आमतौर पर दो विधियों का उपयोग किया जाता है। सेन्ट्रीफ्यूगल एल्युट्रिएशन (पहले काउंटर स्ट्रीमिंग सेंट्रीफ्यूगेशन कहा जाता था) सेंट्रीफ्यूगल एल्युट्रिएशन का उपयोग कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं को उनके आकार और अवसादन वेग (अवसादन गुणांक से संबंधित) के आधार पर अलग करने के लिए किया जा सकता है। पूरे कोशिका चक्र में लगातार विकास के पैटर्न के कारण, कोशाणु विषमता और एक विशिष्ट आकार परिवर्तन की कमी के कारण जी2 और एम चरणों के बीच कम रिज़ॉल्यूशन के साथ आकार बढ़ाकर (और अवसादन गुणांक बढ़ाकर) अपकेंद्रण विच्छेदन कोशिकाओं को जी1, एस, जी2 और एम चरणों में अलग कर सकता है। बड़ी कोशिकाएं तेजी से तलछट करती हैं, इसलिए जी2 में एक कोशिका, जिसने अधिक विकास समय का अनुभव किया है, जी1 में एक कोशिका की तुलना में तेजी से तलछट करेगी और इसलिए इसे विभाजित किया जा सकता है। निलंबन में विकसित कोशिकाओं को बाहर निकालना आसान होता है क्योंकि वे एक दूसरे से चिपके नहीं रहते हैं और उनके आकार गोल, एक समान होते हैं। हालांकि, कुछ प्रकार की अनुवर्ती कोशिकाओं को ट्रिप्सिन के साथ इलाज किया जा सकता है और निष्कासन के लिए फिर से निलंबित किया जा सकता है क्योंकि वे निलंबन में अधिक गोल आकार ग्रहण करेंगे। फ्लो साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग फ्लो साइटोमेट्री कोशिकाओं के भौतिक और रासायनिक गुणों का पता लगाने, गिनती करने और मापने की अनुमति देते हैं। कोशिकाओं को द्रव में निलंबित किया जाता है और प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से डाला जाता है। कोशिकाओं को लेजर बीम के माध्यम से एक-एक करके भेजा जाता है और प्रकाश के फैलाव को एक डिटेक्टर द्वारा मापा जाता है। कोशिकाओं या उनके घटकों को फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ लेबल किया जा सकता है ताकि वे लेजर के जवाब में प्रकाश की विभिन्न तरंग दैर्ध्य का उत्सर्जन करें, जिससे अतिरिक्त डेटा संग्रह की अनुमति मिलती है। मात्रात्मक कोशिका चक्र विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को आमतौर पर इथेनॉल के साथ स्थिर किया जाता है और प्रोपिडियम आयोडाइड, होक्स्ट 33342, डी. ए. पी. आई., 7-एमिनोएक्टिनोमिसिन डी, मिथ्रामाइसिन, डी. आर. ए. क्यू. 5, या टी. ओ.-पी. आर. ओ.-3 जैसे डी. एन. ए.-बाध्यकारी रंगों से रंगा जाता है, जिससे डी. एन. ए. मात्रा द्वारा चरण का निर्धारण किया जा सकता है। हालांकि, अगर इन कोशिकाओं को ठीक कर दिया गया है, तो वे मृत हैं और निरंतर विकास के लिए बनाए नहीं रखा जा सकता है। कोशिकाओं को मीडिया में फिर से निलंबित किया जा सकता है और जीवित संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए गैर-विषैले रंगों से रंगा जा सकता है। कोशिकाओं को जीनोम संपादित भी किया जा सकता है जैसे कि कुछ सेलुलर प्रोटीन संयुग्मित फ्लोरोसेंट टैग जैसे जी. एफ. पी., एम. चेरी और लूसिफ़ेरेज़ के साथ बनाए जाते हैं जिनका उपयोग उन घटकों का पता लगाने और उनकी मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चिमेरिक हिस्टोन एच2बी-जी. एफ. पी. निर्माण किए जा सकते हैं और डी. एन. ए. सामग्री को मापने और कोशिका चरण को समझने के साधन के रूप में प्रतिकृति की स्थिति निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। आकार जैसी विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए प्रकाश प्रकीर्णन माप का उपयोग किया जा सकता है, जिससे बिना टैगिंग के कोशिका चरण का अंतर किया जा सकता है। फ्लो साइटोमीटर का उपयोग मल्टीपैरामीटर साइटोमेट्री डेटा एकत्र करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन इसका उपयोग कोशिकाओं को अलग करने या शुद्ध करने के लिए नहीं किया जा सकता है। फ्लोरोसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफ. ए. सी. एस.) उन अंतरों के आधार पर कोशिकाओं को छांटने की एक तकनीक है जिनका पता प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा लगाया जा सकता है। कोशिका का आकार) या प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (डीएनए, आरएनए, प्रोटीन या प्रतिजन द्वारा)। प्रणाली बहुत हद तक फ्लो साइटोमेट्री की तरह काम करती है, लेकिन एक परिभाषित पैरामीटर के आधार पर मापा जाने के बाद प्रत्येक कोशिका बूंद को भी चार्ज करेगी। चार्ज की गई बूंद तब एक स्थिरविद्युत विक्षेपण प्रणाली का सामना करेगी जो उस चार्ज के आधार पर कोशिका को एक अलग पात्र में क्रमबद्ध करेगी। यह कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट सामग्री या स्कैटर के आधार पर अलग करने की अनुमति देता है। संक्षेप में, केवल फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग कोशिका चक्र चरण वितरण के बारे में मात्रात्मक डेटा एकत्र करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन एफ. ए. सी. एस. के साथ समन्वय में फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग मात्रात्मक डेटा एकत्र करने और आगे के अध्ययन के लिए चरण दर चरण कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है। सीमाओं में शामिल हैंः प्रकाश प्रकीर्णन मापों के लिए, स्थिर कोशिकाओं के लिए जी2 और एम के बीच खराब रिज़ॉल्यूशन (जैसा कि अपकेंद्र विच्छेदन के साथ), अपरिवर्तित लेकिन रंगीन कोशिकाओं के लिए जीवित संस्कृतियों को बनाए रखने में असमर्थ, रंग उपचार के कारण कोशिकाओं का संभावित व्यवधान या उत्परिवर्तन कुछ जनसंख्या विषमता को बनाए रखा जा सकता है, क्योंकि आकार पृथक्करण हमेशा चरण को मापने के लिए सटीक नहीं हो सकता है और सभी कोशिकाएं डी. एन. ए.-संपादित कोशिकाओं के लिए प्रत्येक चरण (प्रारंभिक जी1 बनाम देर से जी1) के भीतर एक ही बिंदु पर नहीं हो सकती हैं, इस प्रक्रिया में रासायनिक अवरोध की एक विस्तारित अवधि लग सकती है। इन तकनीकों को इन विट्रो में किया जा सकता है और इन्हें कल्चर वातावरण से हटाने की आवश्यकता नहीं होती है। सबसे आम प्रकार की रासायनिक नाकाबंदी गिरफ्तारी और रिहाई है, जिसमें एक रासायनिक ब्लॉक के साथ एक संस्कृति का उपचार और ब्लॉक के लिए एक तटस्थ एजेंट को धोकर या जोड़कर बाद में रिहाई शामिल है। जबकि रासायनिक अवरोध आम तौर पर भौतिक पृथक्करण की तुलना में अधिक प्रभावी और सटीक होता है, कुछ तरीके विभिन्न कारणों से अपूर्ण हो सकते हैं, जिनमें शामिल हैंः समकालिक कोशिकाओं का अनुपात अपर्याप्त रासायनिक हेरफेर सेलुलर कार्य को बाधित कर सकता है और/या कोशिकाओं के एक हिस्से को मार सकता है उपचार विषाक्त है और विवो में लागू नहीं होता है (केवल नैदानिक अनुप्रयोग पर विचार करने पर प्रासंगिक) एम माइटोटिक गिरफ्तारी में गिरफ्तारी कई तरीकों के माध्यम से और एम-चरण के भीतर विभिन्न बिंदुओं पर प्राप्त की जा सकती है, जिसमें जी2/एम संक्रमण, मेटाफ़ेज़/एनाफ़ेज़ संक्रमण और माइटोटिक निकास शामिल हैं। नोकोडाज़ोल माइक्रोट्यूब्यूल पोलीमराइजेशन का एक तेजी से प्रतिवर्ती अवरोधक है जिसका उपयोग मेटाफ़ेज़/एनाफ़ेज़ संक्रमण में स्पिंडल असेंबली चेकप्वाइंट पर एनाफ़ेज़ से पहले कोशिकाओं को रोकने के लिए किया जा सकता है। माइक्रोट्यूबुल ज़हर माइटोटिक स्पिंडल के गठन को अवरुद्ध करके काम करता है जो विभाजित कोशिकाओं में बहन क्रोमैटिड्स से जुड़ते हैं और उन्हें अलग करते हैं। कोशिकाएँ तब तक बंद रहती हैं जब तक कि नोकोडाज़ोल बह नहीं जाता। नोकोडाज़ोल अंतर-चरण चयापचय को बाधित नहीं करता है, और जारी की गई कोशिकाएं सामान्य कोशिका चक्र प्रगति पर लौट आती हैं। चूँकि सूक्ष्मनलिकाएँ अन्य कोशिकीय कार्यों में महत्वपूर्ण हैं, इसलिए नोकोडाज़ोल के निरंतर उपयोग के परिणामस्वरूप उन कार्यों में व्यवधान हो सकता है, जिससे कोशिका की मृत्यु हो सकती है। जी2 से एम चरण में संक्रमण के लिए सीडीके1 सीडीके1 का अवरोध आवश्यक है। आरओ-3306 एक चयनात्मक सीडीके1 अवरोधक है जो जी2/एम सीमा पर कोशिकाओं को प्रतिवर्ती रूप से रोक सकता है। आरओ-3306 95 प्रतिशत साइकिल चलाने वाली कोशिकाओं (कैंसर कोशिकाओं सहित) को समन्वित करता है, और मुक्त कोशिकाएं तेजी से माइटोसिस में प्रवेश करती हैं। रोस्कोविटाइन रोस्कोविटाइन का उपयोग काइनेज के ए. टी. पी.-बाध्यकारी क्षेत्र में ए. टी. पी. के साथ प्रतिस्पर्धा करके साइक्लिन-निर्भर काइनेस (सी. डी. के.) की गतिविधि को रोकने के लिए किया जा सकता है। इसके प्रभाव शक्तिशाली होते हैं, कोशिका चक्र की प्रगति के लिए आवश्यक सी. डी. के. के कार्य को कम करके कोशिकाओं को गिरफ्तार करते हैं। रोसकोविटाइन का उपयोग जी0/जी1, जी1/एस, या जी2/एम संक्रमणों में कोशिकाओं को रोकने के लिए किया जा सकता है। कोल्चिसिन मेटाफ़ेज़ में कोशिकाओं को गिरफ्तार करता है और नोकोडाज़ोल की तरह माइटोटिक स्पिंडल के गठन को रोकने वाला एक माइक्रोट्यूबुल जहर है। यह सूक्ष्म नलिकाओं में ट्यूबलिन को अपघटनीय करके काम करता है, जो स्पिंडल असेंबली चेकप्वाइंट पर निरंतर गिरफ्तारी के माध्यम से एनाफ़ेज़ की प्रगति को अवरुद्ध करता है। एस (जी1/एस गिरफ्तारी) में गिरफ्तारी एस चरण में गिरफ्तारी में आमतौर पर डी. एन. ए. संश्लेषण का अवरोध शामिल होता है क्योंकि जीनोम की प्रतिकृति बनाई जा रही होती है। अधिकांश विधियाँ धोने के माध्यम से प्रतिवर्ती होती हैं। डबल थाइमाइडिन ब्लॉक थाइमाइडिन की उच्च सांद्रता प्रतिस्पर्धी अवरोध के माध्यम से डीऑक्सिन्यूक्लियोटाइड चयापचय मार्ग को बाधित करती है, इस प्रकार डीएनए प्रतिकृति को अवरुद्ध करती है। थाइमिडीन के साथ एक एकल उपचार पूरे एस चरण में कोशिकाओं को गिरफ्तार करता है, इसलिए एक दोहरा उपचार प्रारंभिक एस चरण में एक अधिक समान ब्लॉक को प्रेरित करने का कार्य करता है। प्रक्रिया थाइमाइडिन के साथ उपचार, कल्चर को धोने, और उसके बाद एक और थाइमाइडिन उपचार के साथ शुरू होती है। हाइड्रॉक्सीयुरिया राइबोन्यूक्लियोटाइड रिडक्टेज एंजाइम को रोककर डीएनटीपी के उत्पादन को कम कर देता है। यह प्रतिकृति कांटे पर डी. एन. टी. पी. के डी. एन. ए. पोलीमरेज़ को वंचित करके डी. एन. ए. संश्लेषण को रोकने का काम करता है। हाइड्रॉक्सीयुरिया का उपयोग कुछ प्रकार के कैंसर और रक्त विकारों के इलाज के लिए भी किया जाता है। एफिडिकोलिन एफिडोकॉलिन एक कवक-व्युत्पन्न टेट्रासाइक्लिक डाइटरपेनॉइड है जो डीएनए पोलीमरेज़ α के लिए एक चयनात्मक अवरोधक के रूप में कार्य करता है। यह एंजाइम प्रतिकृति डीएनए संश्लेषण के लिए आवश्यक है, लेकिन डीएनए मरम्मत संश्लेषण या माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए प्रतिकृति को बाधित नहीं करता है। जी1 में गिरफ्तारी जी1 में कोशिकाओं के समन्वय के लिए एक एकल सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली रासायनिक विधि मौजूद है। इसमें लोवास्टैटिन शामिल है, जो 3-हाइड्रॉक्सी-3-मिथाइलग्लूटेरिल-कोएंजाइम ए रिडक्टेज का एक प्रतिवर्ती प्रतिस्पर्धी अवरोधक है, जो मेवालोनिक एसिड के उत्पादन में महत्वपूर्ण एंजाइम है। मेवालोनिक एसिड कोलेस्ट्रॉल के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार मेवालोनेट मार्ग में एक प्रमुख मध्यवर्ती है। लोवास्टैटिन-उपचारित कोशिकाओं में कोलेस्ट्रॉल का जुड़ाव गिरफ्तारी के प्रभाव को पूर्ववत नहीं करता है, इसलिए लोवास्टैटिन मार्ग में कुछ प्रारंभिक मध्यवर्ती के गठन को रोकता है जो प्रारंभिक जी1 के माध्यम से प्रगति के लिए आवश्यक है। सिंक्रोनाइजेशन के अन्य तरीके माइटोटिक चयन माइटोटिक चयन एक मोनोलेयर से माइटोटिक कोशिकाओं के चयन के लिए एक दवा-मुक्त प्रक्रिया है जो घातीय विकास से गुजर रही है। माइटोसिस के दौरान, कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में परिवर्तन होता है, और माइटोटिक चयन एक एकल परत में विकसित अनुवर्ती कोशिकाओं में इसका लाभ उठाता है। कोशिकाएँ अधिक गोलाकार हो जाती हैं, जिससे कल्चर प्लेट से जुड़ी कोशिका झिल्ली का सतह क्षेत्र कम हो जाता है। इसलिए माइटोटिक कोशिकाओं को धीरे-धीरे हिलाकर और सुपरनेटेंट से एकत्र करके पूरी तरह से अलग किया जा सकता है। पोषक तत्व/सीरम की कमी लगभग 24 घंटों के लिए संवर्धन माध्यम से सीरम के उन्मूलन के परिणामस्वरूप जी0 शांति और प्रारंभिक जी1 के बीच संक्रमण पर कोशिकाओं का संचय होता है। यह गिरफ्तारी सीरम या वंचित पोषक तत्व को जोड़ने के माध्यम से आसानी से प्रतिवर्ती होती है। रिलीज होने पर, कोशिका चक्र के माध्यम से प्रगति परिवर्तनशील होती है, क्योंकि कुछ कोशिकाएं शांत रहती हैं जबकि अन्य परिवर्तनशील दरों पर कोशिका चक्र के माध्यम से आगे बढ़ती हैं। संपर्क अवरोध तब होता है जब कोशिकाओं को उच्च या पूर्ण संगम तक बढ़ने दिया जाता है, जिससे कोशिका-से-कोशिका संपर्क अधिकतम हो जाता है। यह सामान्य कोशिकाओं में प्रारंभिक जी1 में गिरफ्तारी को ट्रिगर करता है। कम घनत्व पर कोशिकाओं की प्रतिकृति बनाकर गिरफ्तारी को उलट दिया जाता है। कैंसर के लिए आंतरिक प्रसार-बढ़ावा देने वाले उत्परिवर्तनों के कारण, ट्यूमर कोशिका रेखाएं आमतौर पर संपर्क अवरोध से गुजरने में सक्षम नहीं होती हैं, हालांकि अपवाद हैं। बाहरी लिंक कोशिका तुल्यकालन प्रोटोकॉल संदर्भ कोशिका जीव विज्ञान