De novo transcriptome assembly
डी नोवो ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली एक संदर्भ जीनोम की सहायता के बिना एक ट्रांसक्रिप्टोम बनाने की डी नोवो अनुक्रम असेंबली विधि है। परिचय नवीन अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकास के परिणामस्वरूप, 2008 और 2012 के बीच के वर्षों में अनुक्रमण की लागत में बड़ी गिरावट देखी गई। प्रति मेगाबेज़ और जीनोम, लागत क्रमशः कीमत के 1/100,000 th और 1/10,000 th तक गिर गई। इससे पहले, केवल उन जीवों के प्रतिलेखों को अनुक्रमित किया गया था जो वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए व्यापक रुचि और उपयोगिता के थे; हालाँकि, ये 2010 के दशक में विकसित उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (जिसे अगली पीढ़ी अनुक्रमण भी कहा जाता है) तकनीकें लागत-और श्रम-प्रभावी दोनों हैं, और इन विधियों के माध्यम से अध्ययन किए गए जीवों की सीमा का विस्तार हो रहा है। बाद में चना, प्लानेरियन, पारहायल हवाईन्सिस के साथ-साथ नील मगरमच्छ, मकई के सांप, दाढ़ी वाले ड्रैगन और लाल कान वाले स्लाइडर के मस्तिष्क के लिए ट्रांसक्रिप्टोम बनाए गए हैं। गैर-मॉडल जीवों की जांच "आकर्षक रूपात्मक नवाचारों की विविधता" के अंतर्निहित तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है जिसने पृथ्वी ग्रह पर जीवन की प्रचुरता को सक्षम किया है। जानवरों और पौधों में, जिन "नवाचारों" की सामान्य मॉडल जीवों में जांच नहीं की जा सकती है, उनमें नकल, पारस्परिकता, परजीवीवाद और अलैंगिक प्रजनन शामिल हैं। डी नोवो ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली अक्सर गैर-मॉडल जीवों का अध्ययन करने के लिए पसंदीदा विधि है, क्योंकि यह जीनोम बनाने की तुलना में सस्ता और आसान है, और मौजूदा जीनोम के बिना संदर्भ-आधारित तरीके संभव नहीं हैं। इन जीवों के ट्रांसक्रिप्टोम इस प्रकार नए प्रोटीन और उनके आइसोफॉर्म को प्रकट कर सकते हैं जो इस तरह की अनूठी जैविक घटनाओं में शामिल हैं। डी नोवो बनाम संदर्भ-आधारित असेंबली एकत्रित प्रतिलेखों का एक सेट प्रारंभिक जीन अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए अनुमति देता है। ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली कंप्यूटर प्रोग्राम के विकास से पहले, ट्रांसक्रिप्टोम डेटा का विश्लेषण मुख्य रूप से एक संदर्भ जीनोम पर मानचित्रण करके किया जाता था। हालांकि जीनोम संरेखण प्रतिलेखन अनुक्रमों को चिह्नित करने का एक मजबूत तरीका है, लेकिन यह विधि वैकल्पिक विभाजन जैसे एम. आर. एन. ए. प्रतिलेखों के संरचनात्मक परिवर्तनों की घटनाओं के लिए जिम्मेदार होने में असमर्थता से वंचित है। चूँकि एक जीनोम में सभी इंट्रॉन और एक्सॉन का योग होता है जो एक प्रतिलेख में मौजूद हो सकते हैं, स्प्लिस किए गए रूप जो जीनोम के साथ लगातार संरेखित नहीं होते हैं, उन्हें वास्तविक प्रोटीन आइसोफॉर्म के रूप में छूट दी जा सकती है। भले ही एक संदर्भ जीनोम उपलब्ध हो, डी नोवो असेंबली की जानी चाहिए, क्योंकि यह उन प्रतिलेखों को पुनर्प्राप्त कर सकता है जो संदर्भ जीनोम असेंबली से गायब जीनोम के खंडों से प्रतिलेखित किए जाते हैं। ट्रांसक्रिप्टोम बनाम जीनोम असेंबली जीनोम अनुक्रम कवरेज स्तरों के विपरीत-जो डीएनए के गैर-कोडिंग इंट्रॉन क्षेत्रों में दोहराए जाने वाली सामग्री के परिणामस्वरूप यादृच्छिक रूप से भिन्न हो सकते हैं-ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रम कवरेज स्तर सीधे जीन अभिव्यक्ति स्तरों का संकेत हो सकते हैं। ये दोहराए गए अनुक्रम जीनोम असेंबली में कॉन्टिग्स के गठन में भी अस्पष्टता पैदा करते हैं, जबकि ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली कॉन्टिग्स में अस्पष्टता आमतौर पर स्प्लिस्ड आइसोफॉर्म या जीन परिवार के सदस्यों के बीच मामूली भिन्नता के अनुरूप होती है। जीनोम असेंबलर का उपयोग कई कारणों से ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली में सीधे नहीं किया जा सकता है। सबसे पहले, जीनोम अनुक्रमण की गहराई आमतौर पर जीनोम में समान होती है, लेकिन प्रतिलेखों की गहराई भिन्न हो सकती है। दूसरा, दोनों स्ट्रैंड हमेशा जीनोम अनुक्रमण में अनुक्रमित होते हैं, लेकिन आरएनए-सेक स्ट्रैंड-विशिष्ट हो सकते हैं। तीसरा, ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि एक ही जीन से ट्रांसक्रिप्ट संस्करण एक्सॉन साझा कर सकते हैं और इन्हें स्पष्ट रूप से हल करना मुश्किल है। विधि आर. एन. ए.-एस. ई. क्यू. एक बार जब आर. एन. ए. को कोशिकाओं से निकाला और शुद्ध किया जाता है, तो इसे एक उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण सुविधा में भेजा जाता है, जहां इसे पहले सी. डी. एन. ए. पुस्तकालय बनाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्राइब किया जाता है। इस सी. डी. एन. ए. को तब अनुक्रमण के लिए उपयोग किए जाने वाले मंच के आधार पर विभिन्न लंबाई में विभाजित किया जा सकता है। निम्नलिखित प्लेटफार्मों में से प्रत्येक लाखों लघु पाठों को क्रमबद्ध करने के लिए एक अलग प्रकार की तकनीक का उपयोग करता हैः 454 सीक्वेंसिंग, इल्यूमिना और सॉलिड। असेंबली एल्गोरिदम सी. डी. एन. ए. अनुक्रम पढ़ने को एक लघु पढ़ने वाले ट्रांसक्रिप्ट असेंबली प्रोग्राम के माध्यम से प्रतिलेखों में इकट्ठा किया जाता है। सबसे अधिक संभावना है कि प्रतिलेखों के बीच कुछ अमीनो एसिड भिन्नताएं जो अन्यथा समान हैं, विभिन्न प्रोटीन समरूपों को दर्शाती हैं। यह भी संभव है कि वे एक ही जीन परिवार के भीतर अलग-अलग जीन का प्रतिनिधित्व करते हैं, या यहां तक कि जीन जो भिन्नता की डिग्री के आधार पर केवल एक संरक्षित क्षेत्र साझा करते हैं। कई असेंबली कार्यक्रम उपलब्ध हैं (असेंबलर्स देखें)। हालांकि ये कार्यक्रम आम तौर पर जीनोम को इकट्ठा करने में सफल रहे हैं, ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली कुछ अनूठी चुनौतियों को प्रस्तुत करती है। जबकि एक जीनोम के लिए उच्च अनुक्रम कवरेज दोहराव वाले अनुक्रमों की उपस्थिति का संकेत दे सकता है (और इस प्रकार मुखौटा किया जा सकता है), एक ट्रांसक्रिप्टोम के लिए, वे बहुतायत का संकेत दे सकते हैं। इसके अलावा, जीनोम अनुक्रमण के विपरीत, ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण स्ट्रैंड-विशिष्ट हो सकता है, दोनों इंद्रिय और एंटीसेंस प्रतिलेखों की संभावना के कारण। अंत में, सभी विभाजनकारी समरूपों को फिर से बनाना और अलग करना मुश्किल हो सकता है। शॉर्ट रीड असेंबलर आम तौर पर दो बुनियादी एल्गोरिदम में से एक का उपयोग करते हैंः ओवरलैप ग्राफ और डी ब्रुइजन ग्राफ। ओवरलैप ग्राफ का उपयोग सेंगर अनुक्रमित पढ़ने के लिए डिज़ाइन किए गए अधिकांश असेंबलर के लिए किया जाता है। पढ़ने की प्रत्येक जोड़ी के बीच ओवरलैप की गणना की जाती है और एक ग्राफ में संकलित किया जाता है, जिसमें प्रत्येक नोड एक एकल अनुक्रम पढ़ने का प्रतिनिधित्व करता है। यह एल्गोरिथ्म डी ब्रुइजन ग्राफ की तुलना में अधिक कम्प्यूटेशनल रूप से गहन है, और उच्च स्तर के ओवरलैप के साथ कम रीड्स को इकट्ठा करने में सबसे प्रभावी है। डी ब्रुइजन ग्राफ के-1 अनुक्रम संरक्षण के आधार पर के-मेर्स (आमतौर पर 25-50 bp) को संरेखित करते हैं ताकि कॉन्टिग्स बनाए जा सकें। के-मेर्स पढ़ने की लंबाई से छोटे होते हैं जो तेजी से हैशिंग की अनुमति देते हैं इसलिए डी ब्रुइजन ग्राफ में संचालन आम तौर पर कम कम्प्यूटेशनल रूप से गहन होते हैं। कार्यात्मक एनोटेशन एकत्रित प्रतिलेखों की कार्यात्मक एनोटेशन विशेष आणविक कार्यों, सेलुलर घटकों और जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि की अनुमति देती है जिसमें अनुमानित प्रोटीन शामिल होते हैं। ब्लास्ट2जीओ (बी2जी) जीन ऑन्टोलॉजी आधारित डेटा माइनिंग को अनुक्रम डेटा को एनोटेट करने में सक्षम बनाता है जिसके लिए अभी तक कोई जीओ एनोटेशन उपलब्ध नहीं है। यह एक शोध उपकरण है जिसे अक्सर गैर-मॉडल प्रजातियों पर कार्यात्मक जीनोमिक्स अनुसंधान में नियोजित किया जाता है। यह एक गैर-अनावश्यक प्रोटीन डेटाबेस (एन. सी. बी. आई. में) के खिलाफ एकत्रित कोंटिग्स को विस्फोट करके काम करता है, फिर अनुक्रम समानता के आधार पर उनकी व्याख्या करता है। गोआना पशु और कृषि पादप जीन उत्पादों के लिए विशिष्ट एक और गो एनोटेशन कार्यक्रम है जो एक समान तरीके से काम करता है। यह गो एनोटेशन और विश्लेषण के लिए कम्प्यूटेशनल उपकरणों के क्यूरेटेड, सार्वजनिक रूप से सुलभ सूट के एगबेस डेटाबेस का हिस्सा है। एनोटेशन के बाद, केईजीजी (जीन और जीनोम का क्योटो विश्वकोश) ट्रांसक्रिप्टोम में पकड़े गए चयापचय मार्गों और आणविक बातचीत नेटवर्क के दृश्य को सक्षम बनाता है। जी. ओ. शर्तों के लिए टिप्पणी किए जाने के अलावा, इन प्रतिलेखों से प्राप्त प्रोटीन के एमिनो एसिड अनुक्रम की भविष्यवाणी करने के लिए खुले पढ़ने के फ्रेम (ओ. आर. एफ.) के लिए भी कोंटिग्स की जांच की जा सकती है। एक अन्य दृष्टिकोण प्रोटीन डोमेन की व्याख्या करना और विशिष्ट जीन के बजाय जीन परिवारों की उपस्थिति निर्धारित करना है। सत्यापन और गुणवत्ता नियंत्रण चूंकि एक अच्छी तरह से हल किया गया संदर्भ जीनोम शायद ही कभी उपलब्ध होता है, कंप्यूटर-इकट्ठा किए गए कोंटिग्स की गुणवत्ता को या तो इकट्ठा किए गए अनुक्रमों की तुलना उन्हें उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रीड्स (संदर्भ-मुक्त) से करके, या एमआरएनए प्रतिलेखों में पाए जाने वाले संरक्षित जीन डोमेन के अनुक्रमों को प्रतिलेखन या निकट से संबंधित प्रजातियों (संदर्भ-आधारित) के जीनोम के साथ संरेखित करके सत्यापित किया जा सकता है। ट्रांज़्रेट और डीटोनेट जैसे उपकरण इन विधियों द्वारा असेंबली गुणवत्ता के सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देते हैं। एक अन्य विधि अनुमानित प्रतिलेखों के लिए पी. सी. आर. प्राइमर तैयार करना है, फिर उन्हें सी. डी. एन. ए. पुस्तकालय से बढ़ाने का प्रयास करना है। अक्सर, असाधारण रूप से छोटे पाठों को फ़िल्टर किया जाता है। लघु अनुक्रम (<40 अमीनो एसिड) कार्यात्मक प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करने की संभावना नहीं है, क्योंकि वे स्वतंत्र रूप से मोड़ने और हाइड्रोफोबिक कोर बनाने में असमर्थ हैं। इन मेट्रिक्स के पूरक, जीन सामग्री का एक मात्रात्मक मूल्यांकन असेंबली की गुणवत्ता में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इस चरण को पूरा करने के लिए, ऐसे उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है जो संरक्षित जीन के आधार पर अपेक्षित जीन स्थान का मॉडल बनाते हैं, जैसे कि बुस्को। यूकेरियोट्स के लिए, सी. ई. जी. एम. ए. का भी उपयोग किया जा सकता है, हालांकि यह आधिकारिक तौर पर 2015 से समर्थित नहीं है। असेंबलर निम्नलिखित असेंबली सॉफ्टवेयर का एक आंशिक संग्रह है जिसका उपयोग ट्रांसक्रिप्टोम उत्पन्न करने के लिए किया गया है, और वैज्ञानिक साहित्य में भी इसका उल्लेख किया गया है। सेक्मैन एन. जी. एन. एस. ओ. ए. पी. डीनोवो-ट्रांस एस. ओ. ए. पी. डीनोवो-ट्रांस एस. ओ. ए. पी. डीनोवो2 फ्रेमवर्क से विरासत में प्राप्त एक डी नोवो ट्रांसक्रिप्टोम असेंबलर है, जिसे वैकल्पिक स्प्लिसिंग और विभिन्न अभिव्यक्ति स्तर के साथ ट्रांसक्रिप्टोम को इकट्ठा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एस. ओ. ए. पी. डेनोवो2 की तुलना में असेंबलर पूर्ण लंबाई के प्रतिलेख सेट के निर्माण का एक अधिक व्यापक तरीका प्रदान करता है। मखमली/ओस मखमली एल्गोरिदम प्रतिलेखों को इकट्ठा करने के लिए डी ब्रुइजन ग्राफ का उपयोग करता है। सिमुलेशन में, मखमल प्रोकैरियोटिक डेटा और स्तनधारी जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बी. ए. सी.) में 3-के. बी. एन. 50 का उपयोग करके 50-के. बी. एन. 50 लंबाई तक का उत्पादन कर सकता है। इन प्रारंभिक प्रतिलेखों को ओएसिस में स्थानांतरित किया जाता है, जो प्रतिलेखन समरूपों का निर्माण करने के लिए युग्मित अंत पढ़ने और लंबे समय तक पढ़ने की जानकारी का उपयोग करता है। ट्रांस-एबीवाईएसएस एबीवाईएसएस एक समानांतर, युग्मित-अंत अनुक्रम संयोजक है। ट्रांस-एबीवाईएसएस (असेंबली बाय शॉर्ट सीक्वेंसेस) एबीवाईएसएस-असेंबल्ड ट्रांसक्रिप्टोम कॉन्टिग्स का विश्लेषण करने के लिए पायथन और पर्ल में लिखी गई एक सॉफ्टवेयर पाइपलाइन है। इस पाइपलाइन को k मानों की एक विस्तृत श्रृंखला में उत्पन्न असेंबलियों पर लागू किया जा सकता है। यह पहले डेटासेट को गैर-अनावश्यक संयोजनों के छोटे समूहों में घटाता है, और एक्सॉन-स्किपिंग, नॉवेल एक्सॉन, रिटेन किए गए इंट्रॉन, नॉवेल इंट्रॉन और वैकल्पिक स्प्लिसिंग सहित स्प्लिसिंग घटनाओं की पहचान करता है। ट्रांस-एबीवाईएसएस एल्गोरिदम भी जीन अभिव्यक्ति स्तरों का अनुमान लगाने, संभावित पॉलीएडेनाइलेशन स्थलों की पहचान करने के साथ-साथ उम्मीदवार जीन-संलयन घटनाओं में सक्षम हैं। ट्रिनिटी ट्रिनिटी सबसे पहले अनुक्रम डेटा को कई डी ब्रुइजन ग्राफों में विभाजित करता है, जिनमें से प्रत्येक एक ही जीन या लोकस पर प्रतिलेखन भिन्नताओं का प्रतिनिधित्व करता है। इसके बाद यह पूर्ण लंबाई के स्प्लिसिंग आइसोफॉर्म को निकालता है और प्रत्येक ग्राफ से पैरालॉगस जीन से प्राप्त प्रतिलेखों को अलग करता है। ट्रिनिटी में तीन स्वतंत्र सॉफ्टवेयर मॉड्यूल होते हैं, जिनका उपयोग प्रतिलेखों का उत्पादन करने के लिए क्रमिक रूप से किया जाता हैः इंचवर्म आरएनए-सेक डेटा को प्रतिलेखों के अनुक्रमों में इकट्ठा करता है, अक्सर एक प्रमुख समरूप के लिए पूर्ण-लंबाई प्रतिलेखों का उत्पादन करता है, लेकिन फिर वैकल्पिक रूप से विभाजित प्रतिलेखों के केवल अद्वितीय भागों की रिपोर्ट करता है। क्राइसेलिस इंचवर्म कॉन्टिग्स का समूह बनाता है और प्रत्येक समूह के लिए पूर्ण डी ब्रुइजन ग्राफ का निर्माण करता है। प्रत्येक समूह किसी दिए गए जीन (या एक परिवार या जीन का समूह जो एक संरक्षित अनुक्रम साझा करता है) के लिए पूर्ण प्रतिलेखन जटिलता का प्रतिनिधित्व करता है। क्राइसेलिस फिर इन अलग-अलग ग्राफों के बीच पूर्ण पठित सेट को विभाजित करता है। तितली तब अलग-अलग ग्राफों को समानांतर रूप से संसाधित करती है, ग्राफ के भीतर पढ़ने के रास्तों का पता लगाती है, अंततः वैकल्पिक रूप से विभाजित समरूपों के लिए पूर्ण-लंबाई के प्रतिलेखों की रिपोर्ट करती है, और समानान्तर जीन से मेल खाने वाले प्रतिलेखों को अलग करती है। ट्रांसक्रिप्टोम ट्रांसक्रिप्टोमिक्स ह्यूमन-ट्रांसक्रिप्टोम डेटाबेस फॉर अल्टरनेटिव स्प्लिसिंग (एच-डी. बी. ए. एस.) यूनिजीन फुल-पैरासाइट्स एक्सोम सीक्वेंसिंग संदर्भ जैव सूचना विज्ञान प्रणाली जीव विज्ञान कम्प्यूटेशनल जीव विज्ञान ओमिक्स भी देखें।