ChIP-exo
चीप-एक्सो उन स्थानों के मानचित्रण के लिए एक क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन आधारित विधि है जिस पर रुचि का एक प्रोटीन (प्रतिलेखन कारक) जीनोम से जुड़ता है। यह चिप-सेक प्रोटोकॉल का एक संशोधन है, जो बाध्यकारी साइटों के संकल्प को सैकड़ों आधार जोड़े से लगभग एक आधार जोड़े में सुधारता है। यह प्रोटीन-बद्ध डीएनए के तारों को 5 '-3' दिशा में प्रोटीन बंधन स्थल के न्यूक्लियोटाइड्स की एक छोटी संख्या के भीतर नीचा करने के लिए एक्सोन्यूक्लीज़ के उपयोग को नियोजित करता है। एक्सोन्यूक्लीज़-उपचारित छोरों के न्यूक्लियोटाइड्स को डी. एन. ए. अनुक्रमण, माइक्रोएरे और पी. सी. आर. के कुछ संयोजन का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। इन अनुक्रमों को फिर जीनोम में मैप किया जाता है ताकि जीनोम पर उन स्थानों की पहचान की जा सके जिन पर प्रोटीन बांधता है। प्रोटीन-डी. एन. ए. अंतःक्रियाओं का पता लगाने के लिए 1984 से क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (सी. आई. पी.) तकनीकों का उपयोग किया जा रहा है। परिणामों की गुणवत्ता में सुधार के लिए चीप पर कई बदलाव किए गए हैं। ऐसा ही एक सुधार, चिप-ऑन-चिप (चिप-चिप), चिप को माइक्रोएरे तकनीक के साथ जोड़ता है। इस तकनीक में सीमित संवेदनशीलता और विशिष्टता है, विशेष रूप से विवो में जहां माइक्रोएरे परमाणु डिब्बे में मौजूद हजारों प्रोटीनों द्वारा बाधित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप गलत सकारात्मक की उच्च दर होती है। इसके बाद चीप-सीक्वेंसिंग (चीप-सेक) आई, जो उच्च-थ्रूपुट सीक्वेंसिंग के साथ चीप को जोड़ती है। हालांकि, कतरित डीएनए टुकड़ों की विषम प्रकृति बंधन स्थलों को ±300 आधार जोड़े के भीतर मानचित्रित करती है, जो विशिष्टता को सीमित करती है। दूसरा, दूषित डीएनए एक गंभीर समस्या प्रस्तुत करता है क्योंकि बहुत कम आनुवंशिक स्थान रुचि के प्रोटीन से क्रॉस-लिंक्ड होते हैं, जिससे कोई भी गैर-विशिष्ट जीनोमिक डीएनए पृष्ठभूमि शोर का एक महत्वपूर्ण स्रोत बन जाता है। इन समस्याओं को हल करने के लिए, री और पुघ ने चीप-एक्सो विकसित करने के लिए क्लासिक न्यूक्लियस संरक्षण परख को संशोधित किया। यह नई चिप तकनीक एक लैम्ब्डा एक्सोन्यूक्लीज़ पर निर्भर करती है जो केवल 5′-3′ दिशा में सभी अनबाउंड डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को नष्ट करती है। संक्षेप में, रुचि का एक प्रोटीन (एक एपिटोप टैग के साथ इंजीनियरिंग जो इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए उपयोगी हो सकता है) फॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग करके जीनोम में अपने प्राकृतिक बंधन स्थानों के लिए विवो में क्रॉस-लिंक किया जाता है। फिर कोशिकाओं को एकत्र किया जाता है, तोड़ दिया जाता है, और क्रोमैटिन को कतरित किया जाता है और सोनिकेशन द्वारा घुलनशील किया जाता है। एक एंटीबॉडी का उपयोग क्रॉस-लिंक्ड डीएनए के साथ रुचि के प्रोटीन को प्रतिरक्षित करने के लिए किया जाता है। डी. एन. ए. पी. सी. आर. एडाप्टरों को फिर सिरों पर लगा दिया जाता है, जो एक्सोन्यूक्लीज़ पाचन के बाद दूसरे स्ट्रैंड डी. एन. ए. संश्लेषण के लिए एक प्राथमिक बिंदु के रूप में काम करते हैं। लैम्ब्डा एक्सोन्यूक्लीज़ तब 5 'छोर से दोहरे डी. एन. ए. तारों को पचाता है जब तक कि प्रोटीन-डी. एन. ए. सहसंयोजक अंतःक्रिया की सीमा पर पाचन अवरुद्ध नहीं हो जाता है। अधिकांश दूषित डीएनए एक दूसरे एकल-स्ट्रैंड विशिष्ट एक्सोन्यूक्लीज़ के जुड़ने से खराब हो जाता है। क्रॉस-लिंकिंग के उलट जाने के बाद, पी. सी. आर. एडाप्टर के लिए प्राइमर को दोहरे फंसे हुए डी. एन. ए. बनाने के लिए बढ़ाया जाता है, और एक दूसरे एडाप्टर को एक्सोन्यूक्लीज़ पाचन समाप्ति के सटीक स्थान का सीमांकन करने के लिए 5 'सिरों से जोड़ा जाता है। पुस्तकालय को फिर पी. सी. आर. द्वारा प्रवर्धित किया जाता है, और उत्पादों की पहचान उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण द्वारा की जाती है। यह विधि किसी भी जीनोम के भीतर किसी भी प्रोटीन बाइंडिंग साइट के लिए एकल आधार जोड़ी तक के रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देती है, जो कि चिप-चिप या चिप-सेक की तुलना में बहुत अधिक रिज़ॉल्यूशन है। लाभ चिप-एक्सो को प्रोटीन बाइंडिंग स्थानों की पहचान करने में एकल आधार जोड़ी संकल्प तक छोड़ने के लिए दिखाया गया है। यह चीप-सेक के विपरीत है जो केवल ±300 आधार जोड़े के साथ एक प्रोटीन के बंधन स्थल का पता लगा सकता है। गैर-प्रोटीन-बद्ध डीएनए टुकड़ों के संदूषण के परिणामस्वरूप चीप प्रयोगों में गलत सकारात्मक और नकारात्मक की उच्च दर हो सकती है। प्रक्रिया में एक्सोन्यूक्लीज़ को जोड़ने से न केवल बाइंडिंग-साइट कॉलिंग के समाधान में सुधार होता है, बल्कि अनुक्रमण से पहले घोल से दूषित डीएनए को हटा देता है। न्यूक्लियोटाइड के टुकड़े से अक्षम रूप से बंधे प्रोटीन का चीप-एक्सो द्वारा पता लगाने की अधिक संभावना होती है। इसने, उदाहरण के लिए, पहले की खोज की तुलना में अधिक सी. टी. सी. एफ. प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी स्थलों की मान्यता की अनुमति दी है। उच्च रिज़ॉल्यूशन और कम पृष्ठभूमि के कारण, चिप-एक्सो का उपयोग करते समय अनुक्रमण कवरेज की कम गहराई की आवश्यकता होती है। सीमाएँ यदि एक प्रोटीन-डी. एन. ए. परिसर में एक ही बाध्यकारी घटना के भीतर क्रॉस-लिंकिंग के कई स्थान हैं, तो यह ऐसा प्रतीत हो सकता है जैसे कि कई अलग-अलग बाध्यकारी घटनाएँ हैं। यह संभवतः एक ही घटना के भीतर उपलब्ध बाध्यकारी स्थलों में से एक पर इन प्रोटीनों के विकृत होने और क्रॉस-लिंकिंग के परिणामस्वरूप होता है। इसके बाद एक्सोन्यूक्लीज़ बाध्य स्थलों में से एक पर रुक जाएगा, जो इस बात पर निर्भर करता है कि प्रोटीन किस स्थान से क्रॉस-लिंक्ड है। किसी भी चीप-आधारित विधि के साथ, इस तकनीक का उपयोग करने के लिए रुचि के प्रोटीन के लिए एक उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध होने की आवश्यकता है। अनुप्रयोग री और पुघ प्रतिलेखन कारकों के एक छोटे से संग्रह पर विश्लेषण करके चिप-एक्सो का परिचय देते हैंः रीब1, गैल4, पीएचडी1, खमीर में रैप1 और मानव में सीटीसीएफ। रिब1 स्थल अक्सर समूहों में पाए जाते थे और इन समूहों में अपेक्षा से 10 गुना अधिक अधिभोग था। समूहों में माध्यमिक स्थल एक प्राथमिक बंधन स्थल से ~ 40 बी. पी. पाए गए। गैल4 के बाध्यकारी रूपांकनों ने चार न्यूक्लियोटाइड्स में से तीन के लिए एक मजबूत प्राथमिकता दिखाई, जो गैल4 और बहिष्कृत न्यूक्लियोटाइड के बीच एक नकारात्मक बातचीत का सुझाव देता है। Phd1 तीन अलग-अलग रूपांकनों को पहचानता है जो Phd1 के बाध्यकारी रूपांकनों की अस्पष्टता की पिछली रिपोर्टों की व्याख्या करता है। रैप1 को चार रूपांकनों को पहचानते हुए पाया गया। इस प्रोटीन से बंधे राइबोसोमल प्रोटीन जीन में एक मजबूत सर्वसम्मति अनुक्रम के साथ एक विशेष रूपांकन का उपयोग करने की प्रवृत्ति थी। अन्य जीन अक्सर कमजोर सर्वसम्मति रूपांकनों के समूहों का उपयोग करते थे, संभवतः एक समान अधिभोग प्राप्त करने के लिए। सी. टी. सी. एफ. के बाध्यकारी रूपांकनों में चार "मॉड्यूल" कार्यरत थे। बाध्य सी. टी. सी. एफ. स्थलों में से आधे ने मॉड्यूल 1 और 2 का उपयोग किया, जबकि बाकी ने चार के कुछ संयोजन का उपयोग किया। ऐसा माना जाता है कि सीटीसीएफ इन मॉड्यूल के विभिन्न संयोजनों को पहचानने के लिए अपनी जस्ता उंगलियों का उपयोग करता है। री और पुघ ने सैक्रोमाइसेस जीनोम में प्री-इनिशिएशन कॉम्प्लेक्स (पी. आई. सी.) संरचना और संगठन का विश्लेषण किया। चीप-एक्सो का उपयोग करते हुए, वे अन्य खोजों के अलावा, टाटा-रहित बताए गए प्रवर्तकों में टाटा जैसी विशेषताओं की सटीक पहचान करने में सक्षम थे। क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन चिप-सीक्वेंसिंग चिप-ऑन-चिप प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन संदर्भ बाहरी लिंक उच्च परिभाषा में डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन महत्वपूर्ण जीन-रेगुलेशन प्रोटीन बाइंडिंग उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन महत्वपूर्ण जीन-रेगुलेशन प्रोटीन नई विधि द्वारा पिनपॉइंटेड सेक्सोरः एक आर/बायोकंडक्टर पैकेज उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन को उजागर करने के लिए चिप-एक्सो में प्रतिकृति पेकोनिक जीनोमिक्स प्रोटीन विधियाँ आणविक जीव विज्ञान आणविक जीव विज्ञान जीनोमिक्स डीएनए सीक्वेंसिंग जैव सूचना विज्ञान तकनीकें