Digital transcriptome subtraction
डिजिटल ट्रांसक्रिप्टोम घटाव (डी. टी. एस.) मेजबान अनुक्रमों के कम्प्यूटेशनल हटाने के माध्यम से नए रोगजनक प्रतिलेखों की उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक जैव सूचना विज्ञान विधि है। डी. टी. एस. वेट-लैब एप्रोच रिप्रेजेंटेशनल डिफरेंस एनालिसिस (आर. डी. ए.) का डायरेक्ट इन सिलिको एनालॉग है, और इसे निष्पक्ष उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण और मेजबान के उच्च-गुणवत्ता, एनोटेटेड संदर्भ जीनोम की उपलब्धता द्वारा संभव बनाया गया है। विधि विशेष रूप से संक्रामक रोगों के एटियोलॉजिकल एजेंट की जांच करती है और मर्केल सेल पॉलीओमावायरस की खोज के लिए जानी जाती है, जो मर्केल-सेल कार्सिनोमा में संदिग्ध कारक एजेंट है। नए रोगजनकों की खोज के लिए कम्प्यूटेशनल घटाव का उपयोग करने का इतिहास पहली बार 2002 में मेयर्सन एट अल द्वारा प्रस्तावित किया गया था। मानव व्यक्त अनुक्रम टैग (ई. एस. टी.) डेटासेट का उपयोग करना। सिद्धांत प्रयोग के प्रमाण में, मेयर्सन और अन्य। यह प्रदर्शित किया कि यह पोस्ट-ट्रांसप्लांट लिम्फोप्रोलिफरेटिव डिसऑर्डर (पीटीएलडी) में एपस्टीन-बार वायरस-संक्रमित लिम्फोसाइट्स का उपयोग करके एक व्यवहार्य दृष्टिकोण था। 2007 में, "डिजिटल ट्रांसक्रिप्टोम सबट्रैक्शन" शब्द चांग-मूर समूह द्वारा गढ़ा गया था, और इसका उपयोग मर्केल-सेल कार्सिनोमा में मर्केल सेल पॉलीमावायरस की खोज के लिए किया गया था। एमसीवी की खोज के साथ-साथ, इस दृष्टिकोण का उपयोग एक ऐसे मामले में मृत्यु के कारण के रूप में एक नए एरेनावायरस को फंसाने के लिए किया गया था, जहां एक ही दाता से अंग प्रत्यारोपण के तुरंत बाद तीन रोगियों की इसी तरह की बीमारियों से मृत्यु हो गई थी। विधि सी. डी. एन. ए. पुस्तकालय का निर्माण मानव जीनोमिक डी. एन. ए. को समाप्त करने के लिए डी. एन. ए. एस. I के साथ उपचार के बाद, प्राथमिक संक्रमित ऊतक से कुल आर. एन. ए. निकाला जाता है। मैसेंजर आर. एन. ए. को फिर एक ऑलिगो-डी. टी. स्तंभ का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है जो पॉली-ए पूंछ से जुड़ता है, एक संकेत जो विशेष रूप से प्रतिलेखित जीन पर पाया जाता है। यादृच्छिक हेक्सामर प्राइमिंग का उपयोग करते हुए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (आर. टी.) सभी एम. आर. एन. ए. को सी. डी. एन. ए. में परिवर्तित करता है और बैक्टीरियल वैक्टर में क्लोन करता है। बैक्टीरिया, आमतौर पर ई. कोलाई, को फिर सी. डी. एन. ए. वैक्टर का उपयोग करके परिवर्तित किया जाता है और एक मार्कर का उपयोग करके चुना जाता है, परिवर्तित क्लोन का संग्रह सी. डी. एन. ए. पुस्तकालय है। यह ऊतक एम. आर. एन. ए. का एक स्नैप-शॉट उत्पन्न करता है जो स्थिर है और बाद के चरण में अनुक्रमित किया जा सकता है। अनुक्रमण और गुणवत्ता नियंत्रण सी. डी. एन. ए. पुस्तकालय को बहुत गहराई तक अनुक्रमित किया जाना चाहिए (अर्थात। एक सैद्धांतिक दुर्लभ रोगजनक अनुक्रम (तालिका 1) का पता लगाने के लिए अनुक्रमित क्लोनों की संख्या), विशेष रूप से यदि विदेशी अनुक्रम नया है। चांग-मूर कई अनुक्रमण प्लेटफार्मों का उपयोग करके 200,000 प्रतिलेखों या उससे अधिक की अनुक्रमण गहराई की सिफारिश करते हैं। गलत-सकारात्मक परिणामों को कम करने के लिए कच्चे अनुक्रमों पर सख्त गुणवत्ता नियंत्रण लागू किया जाता है। प्रारंभिक गुणवत्ता वाली स्क्रीन अस्पष्ट अनुक्रमों को बाहर करने के लिए कई सामान्य मापदंडों का उपयोग करती है, जो उच्च-निष्ठा (हाई-फाई) के एक डेटासेट को पीछे छोड़ देती है। लो फ्रेड स्कोर कटऑफ का उपयोग निम्न-गुणवत्ता वाले अंत अनुक्रमों को हटाने के लिए किया जाता है। आमतौर पर, प्रत्येक बेस-कॉलिंग में 99%-99.9% सटीकता सुनिश्चित करने के लिए 20 या 30 के फ्रेड स्कोर कटऑफ का उपयोग किया जाता है। वेक्टर और एडाप्टर हटाने। कम जटिलता-एक अनुक्रम का जटिलता स्कोर एक श्रृंखला (होमो-पॉलिमर) जैसे पॉली-डीटी या पॉली-डीए में समान आधारों की संख्या को दर्शाता है। मानव दोहराए जाने वाले डीएनए। लंबाई-पैरामीटर अनुक्रमण तकनीक के लिए विशिष्ट अनुकूलित पढ़ने की लंबाई पर निर्भर करता है जिसका उपयोग किया गया था। ब्लास्ट करें और ई. कोलाई जीनोम अनुक्रमों को बाहर करें। मेगाब्लेस्ट का उपयोग करके जीनोम को होस्ट करने के लिए ब्लास्ट, हाई-फाई रीड्स को फिर एनोटेटेड डेटाबेस में अनुक्रमों के साथ मिलान किया जाता है और किसी भी सकारात्मक मिलान को डेटासेट से घटाया जाता है। मानव अनुक्रम के एक सकारात्मक मिलान के लिए न्यूनतम हिट लंबाई आम तौर पर 30 लगातार समान आधार होती है, जो 60 के ब्लास्ट स्कोर के बराबर होती है; आम तौर पर, शेष अनुक्रम को फिर से कम कठोर मापदंडों के साथ ब्लास्ट किया जाता है ताकि मामूली बेमेल (20 में से 1 न्यूक्लियोटाइड) की अनुमति दी जा सके। इस स्तर पर अधिकांश अनुक्रमों (> 99 प्रतिशत) को डेटासेट से हटा दिया जाना चाहिए। घटाए गए अनुक्रमों में आम तौर पर शामिल हैंः संदर्भ मानव प्रतिलेख-अभिव्यक्ति पुस्तकालय सेट से किसी भी ज्ञात मानव प्रतिलेख को समाप्त करता है। मानव जीनोम का संदर्भ-उन जीनों को समाप्त करता है जो सी. डी. एन. ए. पुस्तकालय निर्माण के दौरान एनोटेशन प्रक्रिया और किसी भी दूषित जीनोमिक अनुक्रम से चूक गए हैं। माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए-माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए तेजी से उत्परिवर्तन दर के कारण अत्यधिक प्रचुर मात्रा में और बहुरूपी होते हैं। इम्यूनोग्लोबुलिन क्षेत्र-इम्यूनोग्लोबुलिन लोकी अत्यधिक बहुरूपी है और अन्यथा संदर्भ जीनोम के खराब संरेखण के कारण गलत-सकारात्मक परिणाम देगा। अन्य कशेरुकी अनुक्रम "गैर-मेजबान" उम्मीदवारों का असंक्रमित अनुक्रम विश्लेषण रोगजनक डेटाबेस के लिए संरेखण घटाव के कड़े दौर के बाद, शेष अनुक्रमों को गैर-अनावश्यक संयोजनों में क्लस्टर किया जाता है और कम-कठोरता मापदंडों का उपयोग करके ज्ञात रोगजनक अनुक्रमों के लिए संरेखित किया जाता है। जैसे-जैसे रोगजनक जीनोम जल्दी से उत्परिवर्तित होते हैं, न्यूक्लियोटाइड-न्यूक्लियोटाइड संरेखण, या ब्लास्टन, आमतौर पर सूचनात्मक नहीं होते हैं क्योंकि कोडन अपक्षय के कारण अमीनो एसिड अवशेष को बदले बिना कुछ आधारों पर उत्परिवर्तन होना संभव है। सभी 6 ओपन रीडिंग फ्रेमों के इन सिलिको अनुवादित प्रोटीन अनुक्रमों को एमिनो एसिड अनुक्रम से एनोटेटेड प्रोटीन, या ब्लास्टएक्स से मिलान करना पसंदीदा संरेखण विधि है क्योंकि यह एक संबंधित तनाव/प्रजाति से मिलान करके एक नए रोगजनक की पहचान करने की संभावना को बढ़ाती है। सकारात्मक मिलान की संभावनाओं को अधिकतम करने के लिए इस स्तर पर उम्मीदवार अनुक्रमों के प्रयोगात्मक विस्तार का भी उपयोग किया जा सकता है। डी नोवो असेंबली उन मामलों में जहां ज्ञात रोगजनकों के लिए संरेखण गैर-सूचनात्मक या अस्पष्ट है, पूर्ण रोगजनक जीनोम अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए प्राथमिक संक्रमित ऊतक में प्राइमर चलने के लिए उम्मीदवार अनुक्रम के संयोजन का उपयोग टेम्पलेट के रूप में किया जा सकता है। चूंकि वायरल प्रतिलेख अत्यधिक दुर्लभ अनुपात ऊतक एम. आर. एन. ए. (1 मिलियन में 10 प्रतिलेख) हैं, इसलिए कम कवरेज के कारण अकेले मूल उम्मीदवार अनुक्रमों के आधार पर एक प्रतिलेख उत्पन्न करने की संभावना नहीं है। रोगजनक का सत्यापन एक बार उच्च-प्रवाह अनुक्रमण डेटा में एक अनुमानित रोगजनक की पहचान हो जाने के बाद, अधिक संवेदनशील तकनीकों का उपयोग करके संक्रमित रोगियों में रोगजनक की उपस्थिति को मान्य करना अनिवार्य है, जैसे किः आर. टी.-पी. सी. आर. और रोगजनक एम. आर. एन. ए. के अस्तित्व की पुष्टि करने के लिए 3 '-और 5'-आर. ए. सी. ई. सहित व्युत्पन्न विधियाँ। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ऊतकों में रोगजनक के अस्तित्व को निर्धारित करने के लिए संबंधित रोगजनक के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करती है। रोगजनक-विशिष्ट एंटीबॉडी टाइटर को मापने के लिए सीरोलॉजिकल परीक्षण। बैक्टीरियल कल्चर/वायरल कल्चर, जिसे प्रयोगशाला निदान में स्वर्ण मानक माना जाता है। अनुप्रयोग डी. टी. एस. के लिए प्राथमिक अनुप्रयोग कैंसर में रोगजनक वायरस की पहचान में निहित है। इसका उपयोग गैर-कैंसर संबंधित बीमारी में वायरल रोगजनकों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है। भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों में व्यक्तियों में नियमित आधार पर डी. टी. एस. का उपयोग शामिल हो सकता है। डी. टी. एस. कृषि पर भी लागू हो सकता है, जिससे उत्पादन पर प्रभाव डालने वाले रोगजनकों की पहचान की जा सकती है। कम्प्यूटेशन घटाव का उपयोग पहले से ही एक मेटाजेनॉमिक्स अध्ययन में किया गया था जो आई. ए. पी. वी. द्वारा वायरल संक्रमण को मधुमक्खियों में कॉलोनी पतन विकार से जोड़ता है। लाभ रोगजनक अनुक्रम के बारे में कोई पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं है। पहले से असंबद्ध, संभावित रूप से उपचार योग्य रोगजनकों की पहचान कर सकते हैं। पहले से उपलब्ध आणविक विधियों और संसाधनों का उपयोग करता है। नुकसान रोगजनक की उपस्थिति की पहचान करता है लेकिन रोग के लिए कारण संबंध स्थापित नहीं करता है। कोच की अभिधारणा और ब्रैडफोर्ड हिल मानदंड देखें। अध्ययन किए जा रहे जीव के लिए एक अत्यधिक विश्वसनीय, पूर्ण संदर्भ प्रतिलेखन होना चाहिए। विदेशी अनुक्रम पहचान की कमी एक रोगजनक विदेशी निकाय को पूरी तरह से बाहर नहीं कर सकती है। संदर्भ जैव सूचना विज्ञान