Illumina dye sequencing
इल्यूमिना डाई अनुक्रमण एक तकनीक है जिसका उपयोग डीएनए में आधार जोड़े की श्रृंखला को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जिसे डीएनए अनुक्रमण के रूप में भी जाना जाता है। प्रतिवर्ती समाप्त रसायन विज्ञान अवधारणा का आविष्कार ब्रुनो कैनार्ड और साइमन सरफाती ने पेरिस के पाश्चर संस्थान में किया था। इसे कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय के शंकर बालासुब्रमण्यम और डेविड क्लेनरमैन द्वारा विकसित किया गया था, जिन्होंने बाद में सोलेक्सा की स्थापना की, जिसे बाद में इलुमिना द्वारा अधिग्रहित किया गया। यह अनुक्रमण विधि प्रतिवर्ती डाई-टर्मिनेटर पर आधारित है जो एकल न्यूक्लियोटाइड्स की पहचान को सक्षम करती है क्योंकि वे डीएनए स्ट्रैंड पर धोए जाते हैं। इसका उपयोग पूरे जीनोम और क्षेत्र अनुक्रमण, ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण, मेटाजेनॉमिक्स, छोटे आर. एन. ए. की खोज, मिथाइलेशन प्रोफाइलिंग और जीनोम-वाइड प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है। अवलोकन यह तीन बुनियादी चरणों में काम करता हैः प्रवर्धन, अनुक्रम और विश्लेषण। प्रक्रिया शुद्ध डीएनए के साथ शुरू होती है। डी. एन. ए. विखंडित होता है और एडेप्टर जोड़े जाते हैं जिनमें ऐसे खंड होते हैं जो प्रवर्धन, अनुक्रमण और विश्लेषण के दौरान संदर्भ बिंदु के रूप में कार्य करते हैं। संशोधित डी. एन. ए. को एक प्रवाह कोशिका पर लोड किया जाता है जहाँ प्रवर्धन और अनुक्रमण होगा। प्रवाह कोशिका में नैनोवेल होते हैं जो टुकड़ों को बाहर निकालते हैं और भीड़भाड़ में मदद करते हैं। प्रत्येक नैनोवेल में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स होते हैं जो एडेप्टरों को संलग्न करने के लिए एक लंगर बिंदु प्रदान करते हैं। एक बार जब टुकड़े जुड़ जाते हैं, तो क्लस्टर पीढ़ी नामक एक चरण शुरू होता है। यह चरण डी. एन. ए. के प्रत्येक टुकड़े की लगभग एक हजार प्रतियां बनाता है और पुल प्रवर्धन पी. सी. आर. द्वारा किया जाता है। इसके बाद, प्राइमर और संशोधित न्यूक्लियोटाइड्स को चिप पर धोया जाता है। इन न्यूक्लियोटाइड्स में एक प्रतिवर्ती फ्लोरोसेंट अवरोधक होता है इसलिए डीएनए पोलीमरेज़ डीएनए टुकड़े पर एक बार में केवल एक न्यूक्लियोटाइड जोड़ सकता है। संश्लेषण के प्रत्येक दौर के बाद, एक कैमरा चिप की एक तस्वीर लेता है। एक कंप्यूटर यह निर्धारित करता है कि फ्लोरोसेंट टैग की तरंग दैर्ध्य द्वारा कौन सा आधार जोड़ा गया था और चिप पर प्रत्येक स्थान के लिए इसे रिकॉर्ड करता है। प्रत्येक दौर के बाद, गैर-निगमित अणुओं को धोया जाता है। फिर 3 'फ्लोरोसेंट टर्मिनल ब्लॉकिंग समूह को हटाने के लिए एक रासायनिक डीब्लॉकिंग चरण का उपयोग किया जाता है। प्रक्रिया तब तक जारी रहती है जब तक कि पूर्ण डी. एन. ए. अणु अनुक्रमित नहीं हो जाता। इस तकनीक के साथ, पूरे जीनोम में हजारों स्थानों को बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण के माध्यम से एक साथ अनुक्रमित किया जाता है। प्रक्रिया जीनोमिक पुस्तकालय डी. एन. ए. को शुद्ध करने के बाद एक डी. एन. ए. पुस्तकालय, जीनोमिक पुस्तकालय, उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है। जीनोमिक पुस्तकालय बनाने के दो तरीके हैं, सोनिकेशन और टैगमेंटेशन। टैगमेंटेशन के साथ, ट्रांसपोज़ेस यादृच्छिक रूप से डी. एन. ए. को 50 और 500 बी. पी. टुकड़ों के बीच के आकार में काटते हैं और एक साथ एडेप्टर जोड़ते हैं। जीनोमिक डीएनए को विखंडित करने के लिए सोनिकेशन का उपयोग करके एक आनुवंशिक पुस्तकालय भी बनाया जा सकता है। सोनिकेशन अल्ट्रासोनिक ध्वनि तरंगों का उपयोग करके डीएनए को समान आकारों में विभाजित करता है। सोनिकेशन के बाद दाएँ और बाएँ एडेप्टरों को टी7 डी. एन. ए. पोलीमरेज़ और टी4 डी. एन. ए. लाइगेज द्वारा संलग्न करने की आवश्यकता होगी। जिन स्ट्रैंड्स में एडेप्टर नहीं होते हैं, वे बह जाते हैं। एडाप्टर एडाप्टर में तीन अलग-अलग खंड होते हैंः ठोस समर्थन के पूरक अनुक्रम (प्रवाह कोशिका पर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स), बारकोड अनुक्रम (सूचकांक), और अनुक्रमण प्राइमर के लिए बंधन स्थल। सूचकांक आमतौर पर छह आधार जोड़े लंबे होते हैं और नमूनों की पहचान करने के लिए डीएनए अनुक्रम विश्लेषण के दौरान उपयोग किए जाते हैं। सूचकांक 96 विभिन्न नमूनों को एक साथ चलाने की अनुमति देते हैं, इसे मल्टीप्लेक्सिंग के रूप में भी जाना जाता है। विश्लेषण के दौरान, कंप्यूटर सभी पाठों को एक ही सूचकांक के साथ एक साथ समूहित करेगा। इल्यूमिना "संश्लेषण द्वारा अनुक्रम" दृष्टिकोण का उपयोग करता है। यह प्रक्रिया एक्रिलामाइड-लेपित कांच प्रवाह कोशिका के अंदर होती है। प्रवाह कोशिका में कोशिका के निचले हिस्से को कोटिंग करने वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (छोटे न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम) होते हैं, और वे अनुक्रमण के दौरान डीएनए स्ट्रैंड को पकड़ने के लिए ठोस समर्थन के रूप में काम करते हैं। जैसे ही खंडित डी. एन. ए. को प्रवाह कोशिका के ऊपर धोया जाता है, उपयुक्त एडाप्टर पूरक ठोस आधार से जुड़ जाता है। पुल प्रवर्धन एक बार जुड़ने के बाद, क्लस्टर उत्पादन शुरू हो सकता है। लक्ष्य डीएनए के सैकड़ों समान तारों का निर्माण करना है। कुछ आगे की ओर होंगे; बाकी, विपरीत। यही कारण है कि दाएँ और बाएँ एडाप्टर का उपयोग किया जाता है। क्लस्टर पुल प्रवर्धन के माध्यम से उत्पन्न होते हैं। डी. एन. ए. पोलीमरेज़ डी. एन. ए. के एक स्ट्रैंड के साथ चलता है, जिससे इसका पूरक स्ट्रैंड बनता है। मूल स्ट्रैंड को धोया जाता है, केवल रिवर्स स्ट्रैंड छोड़ दिया जाता है। रिवर्स स्ट्रैंड के शीर्ष पर एक एडाप्टर अनुक्रम होता है। डी. एन. ए. स्ट्रैंड झुकता है और ओलिगो से जुड़ता है जो शीर्ष एडाप्टर अनुक्रम का पूरक है। पॉलीमरेज़ रिवर्स स्ट्रैंड से जुड़ते हैं, और इसके पूरक स्ट्रैंड (जो मूल के समान है) बनाए जाते हैं। अब दोहरे फंसे डीएनए को विकृत कर दिया जाता है ताकि प्रत्येक स्ट्रैंड अलग से प्रवाह कोशिका में लंगर डाले हुए एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम से जुड़ सके। एक विपरीत स्ट्रैंड होगा; दूसरा, आगे। इस प्रक्रिया को पुल प्रवर्धन कहा जाता है, और यह एक ही बार में प्रवाह कोशिका में हजारों समूहों के लिए होता है। क्लोनल प्रवर्धन बार-बार, डीएनए स्ट्रैंड झुकेंगे और ठोस आधार से जुड़ेंगे। डी. एन. ए. पोलीमरेज़ एक दोहरे फंसे हुए खंड को बनाने के लिए एक नए स्ट्रैंड को संश्लेषित करेगा, और इसे विकृत किया जाएगा ताकि एक क्षेत्र में सभी डी. एन. ए. स्ट्रैंड एक ही स्रोत (क्लोनल प्रवर्धन) से हों। गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए क्लोनल प्रवर्धन महत्वपूर्ण है। यदि एक स्ट्रैंड में एक विषम अनुक्रम पाया जाता है, तो वैज्ञानिक यह सुनिश्चित करने के लिए रिवर्स स्ट्रैंड की जांच कर सकते हैं कि इसमें समान विषमता का पूरक है। आगे और पीछे के तार कलाकृतियों से बचाव के लिए जाँच के रूप में कार्य करते हैं। क्योंकि इल्यूमिना अनुक्रमण डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करता है, आधार प्रतिस्थापन त्रुटियाँ देखी गई हैं, विशेष रूप से 3 'छोर पर। क्लस्टर पीढ़ी के साथ युग्मित एंड रीड्स एक त्रुटि होने की पुष्टि कर सकते हैं। रिवर्स और फॉरवर्ड स्ट्रैंड एक-दूसरे के पूरक होने चाहिए, सभी रिवर्स रीड्स एक-दूसरे से मेल खाना चाहिए, और सभी फॉरवर्ड रीड्स एक-दूसरे से मेल खाना चाहिए। यदि कोई रीड अपने समकक्षों के समान नहीं है (जिसके साथ यह एक क्लोन होना चाहिए), तो एक त्रुटि हो सकती है। कुछ प्रयोगशालाओं के विश्लेषणों में 97 प्रतिशत समानता की न्यूनतम सीमा का उपयोग किया गया है। संश्लेषण द्वारा अनुक्रम क्लोनल प्रवर्धन के अंत में, सभी विपरीत तार प्रवाह कोशिका से धोए जाते हैं, जिससे केवल आगे के तार रह जाते हैं। एक प्राइमर फॉरवर्ड स्ट्रैंड्स एडाप्टर प्राइमर बाइंडिंग साइट से जुड़ जाता है, और एक पोलीमरेज़ डीएनए स्ट्रैंड में एक फ्लोरोसेंटली टैग किए गए डीएनटीपी को जोड़ता है। एक अवरोधक समूह के रूप में कार्य करने वाले फ्लोरोफोर के कारण प्रति दौर केवल एक आधार जोड़ा जा सकता है; हालाँकि, अवरोधक समूह प्रतिवर्ती है। चार-रंग रसायन विज्ञान का उपयोग करते हुए, चार आधारों में से प्रत्येक में एक अद्वितीय उत्सर्जन होता है, और प्रत्येक दौर के बाद, मशीन रिकॉर्ड करती है कि कौन सा आधार जोड़ा गया था। एक बार जब रंग दर्ज हो जाता है तो फ्लोरोफोर बह जाता है और एक अन्य डी. एन. टी. पी. प्रवाह कोशिका पर धोया जाता है और प्रक्रिया को दोहराया जाता है। नेक्स्टसेक और बाद में मिनीसेक के लॉन्च के साथ शुरुआत करते हुए, इलुमिना ने एक नया दो-रंग अनुक्रमण रसायन विज्ञान पेश किया। न्यूक्लियोटाइड्स को दो रंगों में से एक (लाल या हरा), कोई रंग ("काला") या दोनों रंगों के संयोजन (लाल और हरे रंग के बीच मिश्रण के रूप में नारंगी दिखाई देने) से अलग किया जाता है। एक बार डीएनए स्ट्रैंड को पढ़ने के बाद, जो स्ट्रैंड अभी जोड़ा गया था, वह बह जाता है। फिर, सूचकांक 1 प्राइमर संलग्न होता है, सूचकांक 1 अनुक्रम को बहुलक बनाता है, और धोया जाता है। स्ट्रैंड फिर से एक पुल बनाता है, और डीएनए स्ट्रैंड का 3 'छोर प्रवाह कोशिका पर एक ऑलिगो से जुड़ जाता है। सूचकांक 2 प्राइमर संलग्न होता है, अनुक्रम को बहुलक बनाता है, और धोया जाता है। एक पोलीमरेज़ धनुषाकार स्ट्रैंड के शीर्ष पर पूरक स्ट्रैंड को अनुक्रमित करता है। वे अलग हो जाते हैं, और प्रत्येक स्ट्रैंड के 3 'छोर को अवरुद्ध कर दिया जाता है। आगे की स्ट्रैंड को धो दिया जाता है, और संश्लेषण द्वारा अनुक्रम की प्रक्रिया रिवर्स स्ट्रैंड के लिए दोहराई जाती है। डेटा विश्लेषण अनुक्रमण एक बार में लाखों समूहों के लिए होता है, और प्रत्येक समूह में डीएनए प्रविष्टि की लगभग 1,000 समान प्रतियां होती हैं। अनुक्रम डेटा का विश्लेषण अतिव्यापी क्षेत्रों के साथ टुकड़ों को ढूंढकर किया जाता है, जिन्हें कॉन्टिग्स कहा जाता है, और उन्हें पंक्तिबद्ध किया जाता है। यदि एक संदर्भ अनुक्रम ज्ञात है, तो विभिन्न प्रकार की पहचान के लिए इसकी तुलना की जाती है। यह पीसमील प्रक्रिया वैज्ञानिकों को पूर्ण अनुक्रम को देखने की अनुमति देती है, भले ही एक विखंडित अनुक्रम कभी नहीं चलाया गया था; हालाँकि, क्योंकि इल्यूमिना पढ़ने की लंबाई बहुत लंबी नहीं होती है (हाईसेक अनुक्रमण लगभग 90 बी. पी. लंबी पढ़ने की लंबाई का उत्पादन कर सकता है), यह छोटे टेंडम रिपीट क्षेत्रों को हल करने के लिए एक संघर्ष हो सकता है। इसके अलावा, यदि अनुक्रम डी नोवो है और कोई संदर्भ मौजूद नहीं है, तो दोहराए गए क्षेत्र अनुक्रम असेंबली में बहुत कठिनाई का कारण बन सकते हैं। अतिरिक्त कठिनाइयों में गलत पोलीमरेज़, चिमेरिक अनुक्रम और पी. सी. आर.-बायस द्वारा आधार प्रतिस्थापन (विशेष रूप से 3 'रीड्स के अंत में) शामिल हैं, जो सभी एक गलत अनुक्रम उत्पन्न करने में योगदान कर सकते हैं। अन्य अनुक्रमण विधियों के साथ तुलना यह तकनीक सेंगर अनुक्रमण जैसी पारंपरिक अनुक्रमण विधियों पर कई लाभ प्रदान करती है। सेंगर अनुक्रमण के लिए दो प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता होती है, एक फॉरवर्ड प्राइमर के लिए और दूसरा रिवर्स प्राइमर के लिए। इल्यूमिना के विपरीत, सेंगर अनुक्रमण डीएनए टुकड़े के अनुक्रम को निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति लेबल वाले डाइडॉक्सिन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (डी. डी. एन. टी. पी.) का उपयोग करता है। डी. डी. एन. टी. पी. में 3 'ओ. एच. समूह नहीं है और डी. एन. ए. संश्लेषण को स्थायी रूप से समाप्त कर देते हैं। प्रत्येक प्रतिक्रिया नली में, डी. एन. ए. पोलीमरेज़ और प्राइमर के साथ डी. एन. टी. पी. और डी. डी. एन. टी. पी. जोड़े जाते हैं। डी. डी. एन. टी. पी. और डी. एन. टी. पी. का अनुपात मायने रखता है क्योंकि टेम्पलेट डी. एन. ए. को पूरी तरह से संश्लेषित करने की आवश्यकता होती है, और डी. डी. एन. टी. पी. की अधिकता डी. एन. ए. टेम्पलेट के समान आकार और स्थिति के कई टुकड़े बनाएगी। जब डी. एन. ए. पोलीमरेज़ एक डी. डी. एन. टी. पी. जोड़ता है तो टुकड़ा समाप्त हो जाता है और एक नया टुकड़ा संश्लेषित किया जाता है। संश्लेषित प्रत्येक टुकड़ा पिछले की तुलना में एक न्यूक्लियोटाइड लंबा होता है। एक बार जब डी. एन. ए. टेम्पलेट पूरी तरह से संश्लेषित हो जाता है, तो टुकड़ों को केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जाता है। केशिका नली के नीचे एक लेजर फ्लोरोसेंट लेबल वाले डी. डी. एन. टी. पी. को उत्तेजित करता है और एक कैमरा उत्सर्जित रंग को पकड़ता है। इल्यूमिना डाई अनुक्रमण की स्वचालित प्रकृति के कारण एक बार में कई किस्मों को अनुक्रमित करना और वास्तविक अनुक्रमण डेटा को जल्दी से प्राप्त करना संभव है। सेंगर अनुक्रमण के साथ, एक समय में केवल एक स्ट्रैंड को अनुक्रमित किया जा सकता है और यह अपेक्षाकृत धीमा होता है। इल्यूमिना अन्य अनुक्रमण तकनीकों द्वारा आवश्यक कई, महंगे एंजाइमों के विपरीत केवल डी. एन. ए. पोलीमरेज़ का उपयोग करता है। पायरोसीक्वेंसिंग)। संदर्भ डीएनए अनुक्रमण विधियाँ