Ribosome profiling
राइबोसोम प्रोफाइलिंग, या राइबो-सेक (जिसे राइबोसोम फुटप्रिंटिंग भी कहा जाता है), लगभग 50 साल पहले जोन स्टिट्ज़ और मर्लिन कोज़ाक द्वारा विकसित एक तकनीक का एक रूपांतरण है जिसे निकोलस इंगोलिया और जोनाथन वीसमैन ने अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया था जो यह निर्धारित करने के लिए विशेष संदेशवाहक आरएनए (एमआरएनए) अनुक्रमण का उपयोग करता है कि कौन से एमआरएनए का सक्रिय रूप से अनुवाद किया जा रहा है। एक संबंधित तकनीक जिसका उपयोग यह निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है कि कौन से एम. आर. एन. ए. का सक्रिय रूप से अनुवाद किया जा रहा है, वह है ट्रांसलेटिंग राइबोसोम एफिनिटी प्यूरिफिकेशन (टी. आर. ए. पी.) पद्धति, जिसे रॉकफेलर विश्वविद्यालय में नथानिएल हेंट्ज़ द्वारा (पॉल ग्रीनगार्ड और मिरियम हेमन के सहयोग से) विकसित किया गया था। टी. आर. ए. पी. में राइबोसोम फुटप्रिंटिंग शामिल नहीं है लेकिन कोशिका प्रकार-विशिष्ट जानकारी प्रदान करता है। विवरण यह एक विशेष क्षण में एक कोशिका में सक्रिय रूप से अनुवाद करने वाले सभी राइबोसोम का एक "वैश्विक स्नैपशॉट" उत्पन्न करता है, जिसे ट्रांसलेटोम के रूप में जाना जाता है। नतीजतन, यह शोधकर्ताओं को अनुवाद प्रारंभ स्थलों के स्थान, एक कोशिका या ऊतक में अनुवादित ओ. आर. एफ. के पूरक, एक संदेशवाहक आर. एन. ए. पर राइबोसोम के वितरण और अनुवादित राइबोसोम की गति की पहचान करने में सक्षम बनाता है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग आरएनए-सेक के विपरीत अनुवाद द्वारा डिकोडिंग की प्रक्रिया के दौरान राइबोसोम द्वारा संरक्षित केवल एमआरएनए अनुक्रमों को लक्षित करती है, जो एक नमूने में मौजूद दिए गए अनुक्रम के सभी एमआरएनए को अनुक्रमित करता है। यह तकनीक पॉलीसोम प्रोफाइलिंग से भी अलग है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग का इतिहास इस खोज पर आधारित है कि राइबोसोम के भीतर एम. आर. एन. ए. को न्यूक्लियस के उपयोग के माध्यम से अलग किया जा सकता है जो असुरक्षित एम. आर. एन. ए. क्षेत्रों को खराब करते हैं। यह तकनीक एम. आर. एन. ए. के प्रोटीन में परिवर्तित होने वाले क्षेत्रों के साथ-साथ वैश्विक जीन अभिव्यक्ति में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए प्रत्येक क्षेत्र के अनुवाद के स्तर का विश्लेषण करती है। इसके विकास से पहले, विवो में अनुवाद को मापने के प्रयासों में पॉलीसोम से अलग किए गए आर. एन. ए. पर माइक्रोएरे विश्लेषण के साथ-साथ एपिटोप टैग किए गए राइबोसोम के आत्मीयता शुद्धिकरण के माध्यम से ट्रांसलेशनल प्रोफाइलिंग शामिल थी। ये उपयोगी और पूरक तरीके हैं, लेकिन न तो राइबोसोम प्रोफाइलिंग द्वारा प्रदान की गई संवेदनशीलता और स्थिति संबंधी जानकारी की अनुमति देते हैं। उपयोग राइबोसोम प्रोफाइलिंग के तीन मुख्य उपयोग हैंः अनुवादित एम. आर. एन. ए. क्षेत्रों की पहचान करना, यह देखना कि नवजात पेप्टाइड्स कैसे मुड़े जाते हैं, और संश्लेषित विशिष्ट प्रोटीन की मात्रा को मापना। अनुवादित एम. आर. एन. ए. क्षेत्रों की पहचान विशिष्ट दवाओं का उपयोग करके, राइबोसोम प्रोफाइलिंग एम. आर. एन. ए. के प्रारंभिक क्षेत्रों, लंबे क्षेत्रों और अनुवाद रुकने के क्षेत्रों की पहचान कर सकती है। किसी भी आगे की शुरुआत को रोकने के लिए हैरिंगटोन या लैक्टिडोमाइसिन जोड़कर प्रारंभिक क्षेत्रों का पता लगाया जा सकता है। यह पूरे कोशिका लाइसेट में एम. आर. एन. ए. के प्रारंभिक कोडॉन का विश्लेषण करने की अनुमति देता है, जिसका उपयोग गैर-ए. यू. जी. अनुक्रमों को निर्धारित करने के लिए किया गया है जो अनुवाद शुरू करते हैं। अन्य लंबे क्षेत्रों का पता साइक्लोहेक्सिमाइड जैसे एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़कर लगाया जा सकता है जो स्थानांतरण को रोकते हैं, क्लोराम्फेनिकॉल जो राइबोसोम के भीतर पेप्टाइड्स के हस्तांतरण को रोकता है, या गैर-दवा साधन जैसे थर्मल फ्रीजिंग। ये विस्तार हिमांक विधियाँ अनुवाद के गतिविज्ञान का विश्लेषण करने की अनुमति देती हैं। चूंकि कई राइबोसोम अनुवाद प्रक्रिया को तेज करने के लिए एक एकल एम. आर. एन. ए. अणु का अनुवाद कर सकते हैं, इसलिए राइबोसेक एम. आर. एन. ए. के भीतर प्रोटीन कोडिंग क्षेत्रों को प्रदर्शित करता है और एम. आर. एन. ए. के अनुक्रमण के आधार पर यह कितनी जल्दी किया जाता है। यह राइबोसोम प्रोफाइलिंग के लिए विशिष्ट कोडन पर ट्रांसक्रिप्टोम के भीतर ठहराव स्थलों को दिखाने की भी अनुमति देता है। धीमा या रुका हुआ अनुवाद के इन स्थलों को राइबोसोम घनत्व में वृद्धि द्वारा प्रदर्शित किया जाता है और ये विराम कोशिका के भीतर अपनी भूमिकाओं के साथ विशिष्ट प्रोटीन को जोड़ सकते हैं। चीप के साथ पेप्टाइड फोल्डिंग कपलिंग राइबोजोम प्रोफाइलिंग यह स्पष्ट कर सकती है कि नए संश्लेषित प्रोटीन कैसे और कब मुड़े जाते हैं। राइबो-सेक द्वारा प्रदान किए गए पैरों के निशान का उपयोग करके, चैपरोन जैसे कारकों से जुड़े विशिष्ट राइबोसोम को शुद्ध किया जा सकता है। विशिष्ट समय बिंदुओं पर राइबोसोम को रोकना, इसे समय के साथ एक पॉलीपेप्टाइड का अनुवाद करने की अनुमति देना, और विभिन्न बिंदुओं को एक चैपरोन के सामने उजागर करना और चीप का उपयोग करके अवक्षेपित करना इन नमूनों को शुद्ध करता है और यह दिखा सकता है कि पेप्टाइड को किस समय मोड़ दिया जा रहा है। मापने वाले प्रोटीन संश्लेषण का उपयोग अनुवाद दक्षता का अनुमान लगाने के लिए भी किया जा सकता है, जो प्रोटीन संश्लेषण के लिए एक प्रॉक्सी है। इस अनुप्रयोग के लिए, राइबोसोम प्रोफाइलिंग और मिलान आर. एन. ए. अनुक्रमण डेटा उत्पन्न किया जाता है। प्रारंभिक डेटा विश्लेषण समर्पित कम्प्यूटेशनल ढांचे (उदा.) द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। अनुवाद दक्षता की गणना तब प्रत्येक जीन की राइबोजोम अधिभोग के रूप में की जा सकती है जबकि इसकी आर. एन. ए. अभिव्यक्ति को नियंत्रित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण को आर. एन. ए. से जुड़ने वाले प्रोटीन के निर्देशित व्यवधान के साथ जोड़ा जा सकता है और अनुवाद में अंतर को मापने के लिए राइबोजोम प्रोफाइलिंग का उपयोग किया जा सकता है। ये बाधित एम. आर. एन. ए. प्रोटीन के साथ जुड़े हो सकते हैं, जिनके बंधन स्थलों को विनियमन को इंगित करने के लिए आर. एन. ए. पर पहले ही मैप किया जा चुका है। प्रक्रिया कोशिकाओं या ऊतकों को अलग करती है और राइबोसोम से बंधे एम. आर. एन. ए अणुओं को अलग करती है। परिसरों को स्थिर करें। यह आमतौर पर साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ किया जाता है लेकिन अन्य रसायनों का उपयोग किया जा सकता है। अनुवाद-अक्षम लिसिस स्थितियों के साथ अनुवाद अवरोधकों को छोड़ना भी संभव है। राइबो न्यूक्लियस का उपयोग करके, राइबोसोम द्वारा संरक्षित नहीं किए गए आर. एन. ए. को पचाते हैं। सुक्रोज ग्रेडिएंट डेंसिटी सेंट्रीफ्यूगेशन या विशेष क्रोमैटोग्राफी कॉलम का उपयोग करके एम. आर. एन. ए.-राइबोसोम कॉम्प्लेक्स को अलग करें। प्रोटीन को हटाने के लिए मिश्रण का फेनॉल/क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण। पहले से संरक्षित एम. आर. एन. ए. टुकड़ों के लिए आकार-चयन करें। 3 'एडाप्टर को टुकड़ों में लगाएँ। ज्ञात आर. आर. एन. ए. संदूषकों को घटाएँ (वैकल्पिक)। रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस का उपयोग करके आर. एन. ए. को सी. डी. एन. ए. में परिवर्तित करें। स्ट्रैंड-विशिष्ट तरीके से प्रवर्धन करें। अनुक्रम पढ़ता है। ट्रांसलेशनल प्रोफाइल निर्धारित करने के लिए अनुक्रम परिणामों को जीनोमिक अनुक्रम में संरेखित करें। राइबोसोम प्रोफाइलिंग के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोणों का उपयोग करके परिणामी डेटा का विश्लेषण करें। सामग्री आर. एन. ए.-राइबोसोम परिसर साइक्लोहेक्सिमाइड न्यूक्लियस फेनोल/क्लोरोफॉर्म रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस डी. एन. टी. पी. अनुक्रम विधि-सी. डी. एन. ए. पुस्तकालय। संदर्भ बाहरी लिंक जी. डब्ल्यू. आई. पी. एस.-विज़ ब्राउज़र रिबोग्लैक्सी आर. पी. एफ.-डी. बी. ट्रिप्स-वी. आई. जेड. ब्राउज़र रिबफ्लो, रिबोर, रिबोपाई जीनोमिक्स तकनीक रिबोजाइम्स आणविक जीव विज्ञान तकनीक