Terminal amine isotopic labeling of substrates
टर्मिनल एमाइन आइसोटोपिक लेबलिंग ऑफ सब्सट्रेट्स (टी. ए. आई. एल. एस.) मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स में एक विधि है जो प्रत्येक प्रोटीन (एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स) के एन-टर्मिनल टुकड़ों के आधार पर नमूनों की प्रोटीन सामग्री की पहचान करती है और नमूनों के बीच प्रोटीन की प्रचुरता में अंतर का पता लगाती है। एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स पर आधारित अन्य विधियों की तरह, यह परख प्रोटीन को टुकड़ों में तोड़ने के लिए ट्रिप्सिन का उपयोग करती है और एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स (मूल प्रोटीन के एन-टर्मिनल वाले टुकड़े) को अन्य टुकड़ों (आंतरिक ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स) से अलग करती है। टी. ए. आई. एल. एस. आंतरिक ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स की पहचान करके और उन्हें हटाकर एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स को अलग करता है। यह नकारात्मक चयन टी. ए. आई. एल. एस. विधि को दिए गए नमूनों में सभी एन-टर्मिनियों का पता लगाने की अनुमति देता है। वैकल्पिक तरीके जो एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए एन-टर्मिनस के मुक्त अमीनो समूह पर निर्भर करते हैं, वे कुछ एन-टर्मिनल का पता नहीं लगा सकते हैं क्योंकि वे "स्वाभाविक रूप से अवरुद्ध" हैं (यानी। प्राकृतिक प्रोटीन में एक मुक्त अमीनो समूह नहीं होता है)। टी. ए. आई. एल. एस. विधि के कई अनुप्रयोग हैं जिनमें नए सब्सट्रेट और प्रोटीज की पहचान (जिनमें वे भी शामिल हैं जिनकी एक अज्ञात और व्यापक विशिष्टता है) और प्रोटीन की समाप्ति को परिभाषित करने का एक तरीका है जो प्रोटीन एनोटेशन को सक्षम बनाता है। टी. ए. आई. एल. एस. का उपयोग कैंसर जैसी बीमारियों में विभिन्न प्रकार के परिभाषित जैविक मार्गों के साथ प्रोटीज को जोड़ने के लिए भी किया जा सकता है, ताकि रोग की स्थिति में शामिल सब्सट्रेट और प्रोटीज की स्पष्ट समझ प्राप्त की जा सके। मेथड टेल्स एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स के लेबलिंग और अलगाव के लिए एक 2डी या 3डी प्रोटिओमिक्स आधारित परख है, जिसे ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय के एक समूह द्वारा विकसित किया गया है। टी. ए. आई. एल. एस. विधि को कई प्रोटीज उपचारित कोशिकाओं की तुलना करने और प्रोटिओम कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए बनाया गया है। नमूने ऊतक, फाइब्रोब्लास्ट, कैंसर कोशिकाओं और द्रव प्रवाह सहित विभिन्न स्रोतों से प्राप्त किए जा सकते हैं। यह परीक्षण अल्ट्राफिल्ट्रेशन के माध्यम से आंतरिक ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स को हटाकर एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स को अलग करता है और लेबल किए गए परिपक्व एन-टर्मिनल और नियो-एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स का टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) द्वारा विश्लेषण किया जाता है। यह नकारात्मक चयन टी. ए. आई. एल. एस. विधि को दिए गए नमूनों में सभी एन-टर्मिनियों का पता लगाने की अनुमति देता है। वैकल्पिक तरीके जो एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए एन-टर्मिनल के मुक्त अमीनो समूह पर निर्भर करते हैं, वे प्राकृतिक रूप से अवरुद्ध एन-टर्मिनल का पता नहीं लगा सकते हैं क्योंकि उनके पास एक मुक्त अमीनो समूह नहीं है। टी. ए. आई. एल. एस. को प्रयोग (100-300 यू. जी.) के लिए पेप्टाइड के केवल छोटे नमूने की आवश्यकता होती है, जिसका उपयोग प्रोटीज के साथ किया जा सकता है जिसमें अज्ञात या व्यापक विशिष्टता होती है और नमूना लेबलिंग के लिए विभिन्न तरीकों का समर्थन करता है। हालांकि, यह दो या अधिक अलग-अलग और अद्वितीय पेप्टाइड्स (मूल परिपक्व एन-टर्मिनस में से एक और/या क्लीवेज साइट के माध्यम से एक या अधिक नियो-एन-टर्मिनल पेप्टाइड) द्वारा 50 प्रतिशत प्रोटीन की पहचान करता है जो स्वतंत्र जैविक घटनाओं का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, इस प्रकार परिमाणीकरण के लिए औसत नहीं किया जा सकता है। एकल पेप्टाइड-क्षार एन-टर्मिनम विश्लेषण के लिए परिणामों को मान्य करने में भी कठिनाई होती है। एक नियंत्रण नमूने (सामान्य प्रोटीयोलिटिक गतिविधि का प्रदर्शन) और एक उपचारित नमूने (जो इस उदाहरण में एक अतिरिक्त प्रोटीयोलिटिक गतिविधि का प्रदर्शन करता है) की तुलना करते हुए, डाइमिथाइलेशन-टी. ए. आई. एल. एस. परख के लिए निम्नलिखित चरण हैं। उपचारित नमूने में अतिरिक्त प्रोटीयोलिटिक गतिविधि के साथ उपचारित और नियंत्रण दोनों नमूनों में होने वाला प्रोटिओम-वाइड प्रोटीयोलिसिस। प्रोटीज का निष्क्रियकरण और प्रोटीन विकृतीकरण और कमी। स्थिर समस्थानिकों के साथ लेबलिंग। यह नियंत्रण नमूने में उत्पन्न होने वाले पेप्टाइड्स को उपचारित नमूने में उत्पन्न होने वाले पेप्टाइड्स से अलग करने की अनुमति देता है ताकि उनकी सापेक्ष प्रचुरता की तुलना की जा सके। इस उदाहरण में, लेबलिंग को उपचारित नमूनों के लिए भारी या नियंत्रण के लिए प्रकाश का उपयोग करके प्राथमिक एमाइन के रिडक्टिव डाइमिथाइलेशन द्वारा लागू किया जाता है। यह प्रतिक्रिया सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड द्वारा उत्प्रेरित होती है और लेबल किए गए मिथाइल समूहों को लाइसिन-एमाइन और प्रोटीन और प्रोटीज क्लीवेज उत्पादों के एन-टर्मिनल पर मुक्त (िली)-एमिनो समूहों से जोड़ती है। प्रतिक्रियाशील अमीनो समूहों को अवरुद्ध करना। यह आंतरिक ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स को प्रक्रिया में बाद में पहचाने जाने की अनुमति देता है क्योंकि वे प्रतिक्रियाशील अमीनो समूहों वाले एकमात्र पेप्टाइड्स होंगे। इस उदाहरण में लेबलिंग प्रतिक्रिया (रिडक्टिव डाइमिथाइलेशन) भी प्रतिक्रियाशील अमीनो समूहों को अवरुद्ध करती है। पूलिंग। दो लेबल वाले प्रोटिओम अब मिश्रित हैं। यह सुनिश्चित करता है कि नमूनों को बाद के सभी चरणों में समान रूप से उपचारित किया जाता है जिससे दोनों नमूनों में प्रोटीन की सापेक्ष मात्रा को अधिक सटीक रूप से मापा जा सके। ट्रिप्सिनीकरण। यह प्रत्येक प्रोटीन को टुकड़ों में तोड़ता है। मूल प्रोटीन के लेबल वाले एन-टर्मिनस अवरुद्ध रहते हैं, जबकि नए आंतरिक ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स में एक मुक्त एन-टर्मिनस होता है। नकारात्मक चयन। ट्रिप्टिक पेप्टाइड बाइंडिंग के लिए विशिष्ट एक हाइपरब्रांच्ड पॉलीग्लिसरॉल और एल्डिहाइड (एच. पी. जी.) बहुलक को नमूने में जोड़ा जाता है और नए उत्पन्न ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स के साथ उनके मुक्त एन-टर्मिनल के माध्यम से प्रतिक्रिया करता है। जैसा कि ऊपर चरण 3 में है, यह प्रतिक्रिया सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड द्वारा उत्प्रेरित होती है। डाइमिथाइलेटेड लाइसिन के एसिटिलेटेड और आइसोटोपिक रूप से लेबल किए गए प्रोटीन पेप्टाइड्स और नियो (नए)-एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स प्रतिक्रियाशील नहीं होते हैं और अनबाउंड रहते हैं और अल्ट्राफिल्ट्रेशन का उपयोग करके पॉली-आंतरिक ट्रिप्टिक पेप्टाइड परिसरों से अलग किए जा सकते हैं। एलुटेड अनबाउंड प्रोटीन एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स और नियो-एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स के साथ अत्यधिक केंद्रित होते हैं। इस एल्यूटेड नमूने को फिर परिमाणित किया जाता है और विश्लेषण एमएस/एमएस द्वारा पूरा किया जाता है। टी. ए. आई. एल. एस. में अंतिम चरण में जैव सूचना विज्ञान शामिल है। एक पदानुक्रमित सब्सट्रेट विन्नोइंग प्रक्रिया का उपयोग करना जो एक पेप्टाइड आइसोटोप परिमाणीकरण और कुछ जैव-सूचनात्मक खोज मानदंडों द्वारा पृष्ठभूमि प्रोटीयोलिसिस उत्पादों और गैर-क्लीव्ड प्रोटीन से भेदभाव करता है। प्रकार टी. ए. आई. एल. एस. के प्रकार प्रोटीन और प्रोटीज क्लीवेज उत्पादों के एमिनो समूहों को अवरुद्ध करने और लेबल करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों में भिन्न होते हैं। इन अमीनो समूहों में लाइसिन-एमाइन और प्रोटीन के एन-टर्मिनल के मुक्त (जी. ए.)-एमिनो समूह शामिल हैं। डाइमिथाइलेशन-टेल्स प्रक्रिया एक रासायनिक लेबलिंग आधारित प्रक्रिया है जिसे एमाइन-प्रतिक्रियाशील समस्थानिक अभिकर्मकों का उपयोग करके एक चरण में किया जाता है। दो नमूनों की लेबलिंग में या तो 12CH2-फॉर्मेल्डिहाइड (हल्का) या 13CD2-फॉर्मेल्डिहाइड (भारी) का उपयोग किया जाता है और उत्प्रेरक के रूप में सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड का उपयोग किया जाता है। इस विधि का लाभ यह है कि यह मजबूत, कुशल और लागत प्रभावी है। नियंत्रण और प्रोटीज उपचारित नमूनों के लिए लेबलिंग प्रक्रिया को इकट्ठा करने से पहले अलग से किया जाना चाहिए, और यह प्रति प्रयोग दो नमूनों तक सीमित है, जो एक नुकसान हो सकता है यदि एक साथ कई नमूनों का अध्ययन करने की आवश्यकता है। सेल कल्चर (एस. आई. एल. ए. सी.) में एमिनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग एक ऐसी प्रक्रिया है जिसे विवो में किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का उपयोग सभी कोशिका संवर्धन प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है और यह एक नियमित रूप से उपयोग की जाने वाली लेबलिंग तकनीक है। यह चयापचय लेबलिंग जैविक नमूनों में दिए गए प्रोटीज के अवरोध और एक्स विवो प्रसंस्करण के विश्लेषण को सक्षम बनाती है। रासायनिक लेबलिंग की तुलना में इस चयापचय लेबलिंग विधि का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि यह सीरम प्रोटीन जैसे दूषित पदार्थों से जांच किए जा रहे वास्तविक सेलुलर व्युत्पन्न प्रोटीन के बीच विश्वसनीय, तेज़ और कुशल भेदभाव की अनुमति देता है। एस. आई. एल. ए. सी. टेल्स का उपयोग पांच मल्टीप्लेक्स नमूनों के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। एस. आई. एल. ए. सी. नैदानिक रूप से प्रासंगिक मानव नमूनों के लिए उपयुक्त नहीं है जिन्हें चयापचय रूप से लेबल नहीं किया जा सकता है। एस. आई. एल. ए. सी. एक महंगी विधि है और अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए एक व्यवहार्य विकल्प नहीं हो सकता है। रिलेटिव एंड एब्सोल्यूट क्वांटिफिकेशन (आई. टी. आर. ए. क्यू.) विधि या आई. टी. आर. ए. क्यू.-टी. ए. आई. एल. एस. के लिए आइसोबैरिक टैग एक साथ कई नमूनों की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाता है। इस विधि में चार-और आठ-प्लेक्स आई. टी. आर. ए. क्यू. अभिकर्मकों का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स प्रयोगों में 4 से 8 नमूनों का एक साथ विश्लेषण करने की क्षमता है। यह विधि नमूनों की उच्च सटीकता पहचान और मात्रा प्रदान करती है और नमूना प्रतिकृतियों के अधिक पुनरुत्पादक विश्लेषण की अनुमति देती है। अन्य आईट्रैक विधियों की तरह, आईट्रैक-टेल्स के लिए एक माल्डी मास स्पेक्ट्रोमीटर और महंगे आईट्रैक अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक विधियाँ एन टर्मिनस और प्रोटीयोलिसिस उत्पादों का अध्ययन करने के लिए कई वैकल्पिक तरीके हैं। एमाइनों के एसिटिलेशन के बाद ट्रिप्टिक पाचन और मुक्त एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स के बायोटिनिलेशन में मुक्त लाइसिन और एन-टर्मिनल को लेबल करने के लिए रसायन (एसिटिलेशन) का उपयोग किया जाता है। अवरुद्ध एन-टर्मिनल को फिर नकारात्मक रूप से चुना जाता है। हालांकि, प्राकृतिक रूप से मुक्त आंतरिक एन-टर्मिनल और अवरुद्ध एन-टर्मिनल को एसिटिलेशन के बाद अलग नहीं किया जा सकता है। यह विधि समस्थानिक लेबलिंग का उपयोग नहीं करती है, इसलिए निष्कर्षों की मात्रा निर्धारित करना मुश्किल है। इसके अलावा, प्रायोगिक और पृष्ठभूमि प्रोटीयोलिसिस उत्पादों के बीच अंतर करना मुश्किल है। लाइसिन ग्वानिडिनेशन के बाद एन-टर्मिनल का बायोटिनिलेशन लाइसिन अवशेषों को अवरुद्ध करने और एन-टर्मिनल को टैग मुक्त करने के लिए एक रसायन का उपयोग करता है। फिर टैग किए गए मुक्त एन-टर्मिनल का चयन किया जाता है। इस विधि का नकारात्मक पक्ष यह है कि निष्कर्षों को प्राकृतिक रूप से अवरुद्ध एन-टर्मिनल को पकड़ने में सक्षम नहीं होने के कारण गैर-क्लीव्ड पेप्टाइड्स का उपयोग करके सांख्यिकीय मॉडल पर लागू नहीं किया जा सकता है। चूँकि इसमें समस्थानिक लेबलिंग शामिल नहीं है, इसलिए परिणामों की मात्रा निर्धारित नहीं की जा सकती है। दरार स्थल को भी पहले से ही लेबलिंग करने के लिए जाना जाना चाहिए। एन-टर्मिनल का सबटिलिगेज बायोटिनिलेशन एन-टर्मिनल पेप्टाइड्स के एंजाइमेटिक लेबलिंग का उपयोग करता है, लेकिन लाइसिन अवरुद्ध करने वाले रसायनों का उपयोग नहीं करता है। लाइसिन ब्लॉकिंग के बिना, कई कटे हुए एन-टर्मिनल पेप्टाइड पहचान के लिए बहुत छोटे होंगे। परिणाम सबटिलिगेस के गुणों पर अत्यधिक निर्भर हो सकते हैं इस प्रकार पक्षपाती हो सकते हैं। यह विधि प्राकृतिक रूप से अवरुद्ध एन-टर्मिनल को नहीं पकड़ती है और समस्थानिक लेबलिंग का भी उपयोग नहीं करती है इसलिए निष्कर्षों की मात्रा निर्धारित करना मुश्किल होगा। एन-टर्मिनल की आई. टी. आर. ए. क्यू.-लेबलिंग एन-टर्मिनल को लेबल करने के लिए आई. टी. आर. ए. क्यू. का उपयोग करती है। नियो-एन-टर्मिनस पेप्टाइड्स का चयन सिलिको के माध्यम से किया जाता है। इस तकनीक का नकारात्मक पक्ष यह है कि माल्डी मास स्पेक्ट्रोमीटर की आवश्यकता होती है और आवश्यक आईट्रैक अभिकर्मक महंगे होते हैं। यह विधि प्राकृतिक रूप से अवरुद्ध एन-टर्मिनल को नहीं पकड़ती है। पूरी प्रक्रिया के लिए 50-100 मिलीग्राम पेप्टाइड नमूनों की आवश्यकता होगी। कंबाइंड फ्रैक्शनल डायगोनल क्रोमैटोग्राफी (सी. ओ. एफ. आर. ए. डी. आई. सी.) प्राकृतिक रूप से अवरुद्ध एन-टर्मिनल और प्रोटीज उत्पन्न नियो-एन-टर्मिनल के लिए अलग-अलग लेबलिंग की अनुमति देता है। सभी अवरुद्ध एन-टर्मिनियों को नकारात्मक रूप से चुना जाता है। हालांकि इस प्रक्रिया के लिए कई रासायनिक प्रसंस्करण, क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री की आवश्यकता होती है। सबसे अच्छा पृथक्करण परिणाम अमीनो एसिड संशोधन पर निर्भर करते हैं जैसे कि मेथियोनीन ऑक्सीकरण जो हैंडलिंग के दौरान नहीं होता है। इस विधि के लिए प्रति नमूने 150 एमएस/एमएस विश्लेषण की आवश्यकता होती है लेकिन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूनों को एकत्र किया जा सकता है (और विश्लेषण की संख्या को कम किया जा सकता है)। यह तकनीक अज्ञात या व्यापक विशिष्टता वाले प्रोटीज के लिए उपयोग करने के लिए उपयुक्त है। एस. आई. एल. ए. सी. आई. टी. आर. ए. क्यू. संदर्भ प्रोटिओमिक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री भी देखें।