Photoacoustic flow cytometry
फोटोएकॉस्टिक फ्लो साइटोमेट्री या पी. ए. एफ. सी. एक बायोमेडिकल इमेजिंग विधि है जो फ्लो साइटोमेट्री करने के लिए फोटोएकॉस्टिक इमेजिंग का उपयोग करती है। कोशिकाओं का एक प्रवाह एक फोटोएकॉस्टिक प्रणाली से गुजरता है जो व्यक्तिगत संकेत प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है। प्रत्येक संकेत को इनपुट नमूने का मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए गिना जाता है। विवरण पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री एक लैमिनार एकल फ़ाइल धारा में कोशिकाओं का उपयोग करती है जो फिर एक प्रकाश स्रोत से गुजरती है। कोशिकाओं से प्रकाश प्रकीर्णन के विभिन्न परिमाणीकरण का उपयोग करने से प्रणाली को कोशिकीय आकार और जटिलता की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम बनाता है जिसे अंततः एक नमूने के भीतर कोशिका संरचना के परिमाणीकरण में वापस किया जा सकता है। फोटोएकॉस्टिक फ्लो साइटोमेट्री समान सिद्धांतों पर काम करती है, लेकिन सेलुलर पैटर्न को अलग करने के लिए एक फोटोएकॉस्टिक सिग्नल का उपयोग करती है। इसके अलावा, फ्लो साइटोमेट्री महान एक्स-विवो विश्लेषण प्रदान करता है, लेकिन इसके शुद्ध ऑप्टिकल स्रोत के कारण इसकी प्रवेश गहराई सीमित है जिससे इन-विवो विश्लेषण सीमित हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, फोटोएकॉस्टिक्स प्रवाह साइटोमेट्री पर एक लाभ प्रदान कर सकता है क्योंकि यह एक ऑप्टिकल के बजाय एक ध्वनिक संकेत प्राप्त करता है और अधिक गहराई तक प्रवेश कर सकता है जैसा कि संचालन सिद्धांतों और गणित में आगे चर्चा की गई है। फोटोएकॉस्टिक (पी. ए.) प्रभाव की खोज 1880 में अलेक्जेंडर बेल द्वारा की गई थी, यह तब होता है जब एक फोटॉन स्रोत को एक अल्ट्रासोनिक तरंग का उत्पादन करने वाले प्रकाशिक रूप से ग्रहणशील पदार्थ द्वारा अवशोषित किया जाता है। उत्पादित अल्ट्रासोनिक तरंग की ताकत अवशोषित फोटॉन की तीव्रता का एक कार्य है, और पदार्थ के जन्मजात गुणों को प्रकाशित किया जाता है। रुचि का प्रत्येक पदार्थ एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर फोटॉन को अवशोषित करता है, जिसके परिणामस्वरूप केवल कुछ पदार्थ ही दिए गए तरंग दैर्ध्य पर जन्मजात रूप से एक पी. ए. संकेत का उत्पादन करेंगे। उदाहरण के लिए, हीमोग्लोबिन और मेलेनिन दो सामान्य जैविक पदार्थ हैं जो 680 एनएम तरंग दैर्ध्य सीमा के आसपास लेजर स्पंदों के जवाब में मजबूत पीए संकेत उत्पन्न करते हैं। पी. ए. के लिए अवशोषण स्पेक्ट्रम दृश्य विद्युत चुम्बकीय स्पेक्ट्रम के भीतर स्थित है, जो पी. ए. इमेजिंग को प्रकृति में गैर-विकिरणकारी बनाता है। विशिष्ट अवशोषण स्पेक्ट्रम एक सीमा और पी. ए. इमेजिंग का दोहन दोनों हो सकता है (अनुप्रयोगों में अधिक देखें)। सिस्टम आमतौर पर एक एन. डी.: वाई. ए. जी. (नियोडियमियम-डोप्ड यट्रियम एल्यूमीनियम गार्नेट) या एल. ई. डी. लेजर सिस्टम का उपयोग करते हैं जो रुचि के जैविक ऊतक में प्रवेश करने के लिए स्पंदित होता है। ऊतक के संपर्क में आने वाली प्रत्येक नाड़ी के साथ, एक अल्ट्रासाउंड तरंग के रूप में एक पी. ए. संकेत उत्पन्न होता है। यह अल्ट्रासाउंड तरंग ऊतक के माध्यम से तब तक फैलती है जब तक कि यह एक ए-लाइन का उत्पादन करने के लिए एक अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर तक नहीं पहुंच जाती। प्रत्येक ए-लाइन का अधिकतम आयाम निकाला जाता है और इसका मान एक समय बनाम आयाम ग्राफ पर प्लॉट किया जाता है जो एक साइटोमेट्री ग्राफिक का उत्पादन करता है। संचालन सिद्धांत और गणित ऊष्मा उत्पादन फोटोआकौस्टिक प्रवाह साइटोमेट्री फोटोआकौस्टिक प्रभाव के सिद्धांत पर काम करता है, जिससे दृश्य स्पेक्ट्रम में एक लेजर तापमान में वृद्धि करता है और इस प्रकार एक तापीय विस्तार होता है। एक स्पंदनशील लेजर के लिए लेजर तीव्रता के संबंध में तापीय विस्तार समीकरण नीचे वर्णित है। जहाँ केंद्रित समीकरण का अवशोषण गुणांक है, लेजर की तीव्रता है, टी लेजर पल्स की आवृत्ति है, टी समय है। इसे यूलर के सूत्र द्वारा निर्धारित एक साइनसॉइडल फलन की घातीय अभिव्यक्ति के रूप में वर्णित किया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लेजर की प्रवेश गहराई प्रसार व्यवस्था द्वारा सीमित है, जो विकिरण किए जाने वाले जैविक लक्ष्य से पहले ऊतक के माध्यम से क्षीणन पर निर्भर है। फोटोएकॉस्टिक तरंग संबंध नीचे तब एक फोटोएकॉस्टिक संकेत के लिए गर्मी-दबाव संबंध स्थापित करता है। जहाँ ρ स्थानिक संबंध के साथ निर्धारित आंशिक विभेदक समीकरण है, रुचि के पदार्थ में ध्वनि की गति है, t समय है, समय और स्थान दोनों के एक कार्य के रूप में दबाव है, β तापीय विस्तार गुणांक है, विशिष्ट गर्मी क्षमता है, और ऊपर वर्णित गर्मी समीकरण का आंशिक अंतर है। समीकरण का बायां पक्ष दबाव तरंग समीकरण का वर्णन करता है जो एक अल्ट्रासोनिक दबाव तरंग समीकरण के प्रतिरूपण के लिए प्राप्त किया जाता है। समीकरण का दाहिना पक्ष तापीय उत्पादन और तापीय विस्तार के संबंध को निर्धारित करता है जिसके परिणामस्वरूप दबाव तरंग उत्पन्न होती है। जबकि वास्तविकता एक त्रि-आयामी तरंग उत्पन्न करती है जो ऊतक के माध्यम से फैलती है, पी. ए. एफ. सी. के उद्देश्यों के लिए, आवश्यक जानकारी केवल एक आयामी विश्लेषण से संबंधित है। नीचे एक स्पंदित लेजर के कारण एक आयामी समाधान प्रदर्शित किया गया है। जहाँ अवशोषण गुणांक है, तापीय विस्तार गुणांक है, विशिष्ट ऊष्मा है, F लेजर का प्रवाह है, किसी दिए गए पदार्थ में ध्वनि की गति है और लेजर पल्स से प्राप्त कुल ऊर्जा है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लेजर संपर्क की लंबी अवधि के लिए, तरंग समीकरण काफी हद तक लेजर तीव्रता का एक कार्य बन जाता है। पी. ए. संकेत के विश्लेषण के उद्देश्यों के लिए, लेजर पल्स को एक संकेत देने के लिए समय में कम होना चाहिए कि रुचि के लक्ष्यों को अलग करने के लिए इसका मूल्य विकिरणित पदार्थ के गुणों पर भिन्न होता है। उत्पादित दबाव तरंग में अंतर पी. ए. एफ. सी. में संकेत पृथक्करण का आधार है। संकेत का पता लगाना उत्पन्न दबाव तरंग एक अल्ट्रासाउंड तरंग के रूप में होती है। लहर सामग्री के माध्यम से फैलती है और एक अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर द्वारा पता लगाया जाता है। दबाव को पीजोइलेक्ट्रिक क्रिस्टल के माध्यम से महसूस किया जाता है जो दबाव को वोल्टेज परिवर्तन में बदल देता है, अर्थात। संकेत का आयाम किसी भी समय दबाव के मूल्य के समानुपाती होता है। इस वोल्टेज को समय के एक कार्य के रूप में प्लॉट किया गया है और इसके परिणामस्वरूप पहले वर्णित ए-लाइन का निर्माण होता है। अस्थायी डेटा अन्य प्रकार के फोटोएकॉस्टिक इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन पी. ए. एफ. सी. के उद्देश्यों के लिए, ए-लाइन के भीतर अधिकतम आयाम को डेटा बिंदु के रूप में निकाला जाता है। प्रत्येक लेजर पल्स के लिए इस अधिकतम आयाम मान को प्लॉट किया जाता है बनाम समय एक प्रवाह साइटोमेट्री संकेत अनुरेखण का उत्पादन करता है। प्रत्येक रेखा एक लेजर स्पंद का प्रतिनिधित्व करती है और इसका आयाम विकिरणित लक्ष्य को दर्शाता है। एक आयाम सीमा का चयन करके जो एक विशेष कोशिका प्रकार का प्रतिनिधि है, संकेतों को गिना जा सकता है और इस प्रकार दिए गए नमूने के भीतर कोशिका प्रकारों की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। चित्र 1 बहने वाली कोशिकाओं का एक एनीमेशन और इसके प्रतिनिधि पी. ए. एफ. सी. संकेत अनुरेखण दिखाता है। अनुप्रयोग बैक्टीरिया संयुक्त राज्य अमेरिका में सालाना 20 लाख से अधिक जीवाणु संक्रमण होते हैं। एंटीबायोटिक प्रतिरोध के बढ़ने के साथ इन संक्रमणों का उपचार तेजी से कठिन होता जा रहा है जिससे सही एंटीबायोटिक चयन हमेशा महत्वपूर्ण होता जा रहा है। इष्टतम प्रतिजैविक चयन हानिकारक बैक्टीरिया को निर्धारित करने की क्षमता पर निर्भर करता है। परंपरागत रूप से, जीवाणु विशिष्टता संवर्धन और पी. सी. आर. प्रौद्योगिकियों द्वारा निर्धारित की जाती है। इन तकनीकों में कम से कम 48 घंटे और कभी-कभी अधिक समय लगता है। प्रजातिकरण के लिए लंबी समय सीमा के कारण, प्रदाताओं को व्यापक-स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं का चयन करना चाहिए। पी. ए. एफ. सी. का उपयोग अधिक समय पर एंटीबायोटिक चयन के लिए रक्त में बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। पी. ए. एफ. सी. के साथ पता लगाने का पहला कदम बैक्टीरिया को चिह्नित करना है ताकि उनके पास पता लगाने के लिए पी. ए. संकेत हो। आमतौर पर, यह एक डाई से बना होता है और डाई को रुचि के बैक्टीरिया से जोड़ने की एक विधि होती है। हालांकि एंटीबॉडी का उपयोग अतीत में किया गया है, बैक्टीरियोफेज उत्पादन के लिए सस्ता और अधिक स्थिर साबित हुए हैं। कई अध्ययनों ने रुचि के बैक्टीरिया, विशेष रूप से एम. आर. एस. ए., ई. कोलाई और साल्मोनेला के लिए बैक्टीरियोफेज चयन की विशिष्टता दिखाई है। रंग अलग-अलग होते हैं, लेकिन सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले सोने के नैनोकण, इंडोसायनिन ग्रीन (आईसीजी) और लाल रंग 81 हैं। रंग अधिक संवेदनशील पहचान को सक्षम करने के लिए एक उन्नत संकेत का उत्पादन करते हैं। एक अध्ययन में पाई गई पहचान सीमा ने लगभग 1 जीवाणु कोशिका प्रति 0.6 माइक्रोन दिखाया। विषाक्तता के लिए जानवरों पर विशिष्ट रंगों का परीक्षण किया गया है और इसके परिणामस्वरूप कोई स्पष्ट क्षति नहीं हुई है। हालाँकि रक्त में बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए मानव अध्ययन का प्रयास किया जाना बाकी है, पी. ए. एफ. सी. बैक्टीरिया का पता लगाने के भविष्य के अनुप्रयोगों में भूमिका निभा सकता है। मलेरिया के कारण दुनिया भर में सालाना 40 लाख लोगों की मौत होती है। वर्तमान दवाओं के साथ, इन मौतों को रोकने के लिए जल्दी पता लगाना महत्वपूर्ण है। वर्तमान विधियों में रक्त फिल्म, सीरोलॉजी या पीसीआर पर सूक्ष्म पहचान शामिल है। प्रयोगशाला तकनीशियनों के पास अनुभव की कमी हो सकती है या कुछ सुविधाओं के लिए तकनीकें बहुत महंगी हो सकती हैं, जो अनिवार्य रूप से निदान से चूक जाती हैं। इसके अलावा वर्तमान विधियाँ आम तौर पर 50 प्रति माइक्रोलीटर से कम परजीवी पर मलेरिया का पता नहीं लगा सकती हैं और पता लगाने से पहले संक्रमण के बाद 3 से 4 दिनों की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, रोगी के परिणामों में सुधार के लिए एक अधिक स्वचालित और संवेदनशील पहचान विधि की आवश्यकता है। पी. ए. एफ. सी. ने वर्तमान विधियों की तुलना में पता लगाने की सीमा को बहुत कम साबित किया है। एक अध्ययन ने रक्त परिसंचरण के 0.16 एमएल में एक परजीवी की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया और इस प्रकार टीकाकरण के 1-2 दिन बाद इसका पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, अध्ययनों ने रक्त निष्कर्षण और इन-विट्रो विश्लेषण से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से चूक गए निदान की संभावना को दूर करने के लिए इन विवो डिटेक्शन की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है। पी. ए. एफ. सी. सरोगेट मार्कर हीमोज़ॉइन के माध्यम से मलेरिया का पता लगाता है, जो मेरोज़ोइट चरण में मलेरिया द्वारा उत्पादित एक टूटने वाला उत्पाद है। हेमोज़ॉइन एक महान फोटोएकॉस्टिक लक्ष्य है और 671 एनएम और 820 एनएम रेंज की तरंग दैर्ध्य पर दृढ़ता से प्रतिक्रिया करता है। हालांकि पृष्ठभूमि संकेत आर. बी. सी. के भीतर हीमोग्लोबिन द्वारा उत्पादित किए जाते हैं, हीमोज़ॉइन के साथ संक्रमित आर. बी. सी. (आई. आर. बी. सी.) इन तरंग दैर्ध्य पर हीमोग्लोबिन के ऊपर एक मजबूत संकेत उत्पन्न करते हैं। इन विट्रो विधियों में पता लगाने के लिए 1 सेमी/सेकंड (इन विट्रो) के प्रवाह के साथ 50 माइक्रोमीटर केशिका नलिकाओं का उपयोग किया जाता है। इसके विपरीत, मेनयेव और अन्य। विवो में मलेरिया का पता लगाने का प्रदर्शन किया। चूहों के सतही और गहरे जहाजों पर पता लगाया गया था। सतही जहाज उच्च संकेत-से-शोर अनुपात (एस. एन. आर.) प्रदान करते हैं, लेकिन मानव जहाजों की तुलना में कम हैं। चूहे की जुगुलर नसें और कैरोटिड धमनियां आकार में छोटी मानव वाहिकाओं के समान होती हैं जो रक्त स्पंदन और श्वसन भिन्नता के कारण उच्च कलाकृतियों का प्रदर्शन करती हैं, लेकिन इसके लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हालांकि पी. ए. एफ. सी. एक अधिक संवेदनशील पहचान सीमा प्रदान करता है, यह विधि कुछ सीमाओं के साथ आती है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है कि हीमोज़ॉइन का पता तब चलता है जब परजीवी मेरोज़ोइट अवस्था में होते हैं। यह ट्रोफोज़ोइट चरण में परजीवियों बनाम पता लगाने की समय सीमा को सीमित करता है, लेकिन फिर भी वर्तमान तरीकों की तुलना में पहले पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है। दूसरा, अब तक जिन पोत आकारों का परीक्षण किया गया है, वे केवल चूहों में हैं। मनुष्यों में गहरे पोत विश्लेषण से प्राप्त तथ्य पी. ए. एफ. सी. की संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं जिससे पता लगाने की सीमा वर्तमान में सुझाए गए से कम उपयोगी हो जाती है। हालाँकि चुनौती अभी भी मौजूद है, पी. ए. एफ. सी. मनुष्यों में मलेरिया के निदान में सुधार करने में भूमिका निभा सकता है। परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएँ (सी. टी. सी.) परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएँ या सी. टी. सी. ट्यूमर कोशिकाएँ हैं जो अपने प्राथमिक ट्यूमर से टूट गई हैं और रक्त में यात्रा करती हैं। ये सी. टी. सी. तब दूर के स्थानों पर बीज लगाते हैं जिसके परिणामस्वरूप मेटास्टेस होते हैं। मेटास्टेसिस 90 प्रतिशत कैंसर से संबंधित मौतों का कारण बनता है और इस तरह, मेट की रोकथाम के लिए सी. टी. सी. का पता लगाना महत्वपूर्ण है। अध्ययनों से पता चला है कि सी. टी. सी. का पहले पता लगाने से उपचार में सुधार होता है और इस प्रकार लंबे समय तक जीवित रहने में मदद मिलती है। (15) वर्तमान पहचान विधियों में आरटी-पीसीआर, फ्लो साइटोमेट्री, ऑप्टिकल सेंसिंग, कोशिका आकार निस्पंदन आदि शामिल हैं। ये विधियाँ निकाले गए रक्त (~ 5-10 mL) से नमूने के आकार के कारण सीमित हैं जिसके परिणामस्वरूप ~ 10 CTC/mL की CTC पहचान सीमा होती है। इन विधियों के परिणाम प्राप्त करने में घंटों से लेकर दिनों तक का समय लगता है जिसके परिणामस्वरूप उपचार शुरू करने में देरी हो सकती है। पी. ए. एफ. सी. भविष्य में सी. टी. सी. का पता लगाने में भूमिका निभा सकता है। रोगी से रक्त के निष्कर्षण के माध्यम से छोटी मात्रा के नमूने की सीमा को रोकने के लिए, पी. ए. एफ. सी. रक्त की बड़ी मात्रा की निगरानी के लिए एक इन विवो विधि का उपयोग करता है (यानी। पूरा वॉल्यूम)। अध्ययन ने एक माउस महाधमनी की निगरानी का प्रदर्शन किया, वे पता लगाने के 1 मिनट के भीतर पूरे माउस रक्त की मात्रा की कल्पना करने में सक्षम थे। मेलेनोमा जैसे सी. टी. सी. में एक आंतरिक क्रोमोफोर होता है और हीमोग्लोबिन की पृष्ठभूमि के ऊपर पता लगाने के लिए लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है। अन्य ट्यूमर कोशिकाओं (जैसे कैंसर स्क्वैमस कोशिकाओं) का पता लगाने के लिए आर. बी. सी. पर एक बड़ा पी. ए. संकेत उत्पन्न करने के लिए नैनोकणों के साथ टैग किया जा सकता है। इन विधियों के परिणामस्वरूप सीटीसी की पहचान सीमा में सुधार हुआ। डी ला ज़र्दा एट अल। कैंसर कोशिकाओं के टीकाकरण के केवल 4 दिनों के बाद सी. टी. सी. का पता चला। उनकी पहचान सीमा 1 सीटीसी/एमएल निर्धारित की गई थी, जो संवेदनशीलता में 10 गुना सुधार है। इसके अलावा, नैनो-कण लेबलिंग को गैर-विषाक्त पाया गया और सीटीसी को इष्टतम रूप से टैग करने में केवल 10 मिनट का समय लगा। इस सी. टी. सी. का पता लगाने का उपयोग मेटास्टैटिक स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है, लेकिन इसके चिकित्सीय निहितार्थ भी हैं। ट्यूमर विच्छेदन या हेरफेर के दौरान यह निर्धारित किया गया है कि ये हेरफेर सीटीसी जारी करते हैं। पी. ए. एफ. सी. का उपयोग इन सी. टी. सी. की रिहाई की निगरानी के लिए एक तरीके के रूप में किया जा सकता है, जिसके लिए फिर व्यवस्थित तरीके से उपचार की आवश्यकता हो सकती है। सी. टी. सी./नैनोपार्टिकल्स पर लेजर से गैर-रैखिक थर्मोइलास्टिक प्रभाव के कारण एक उच्च लेजर प्रवाह स्थानीय आर. बी. सी. को नुकसान पहुँचाए बिना सी. टी. सी. के टूटने का कारण बन सकता है। सी. टी. सी. में कमी के साथ, यह प्रणालीगत तरीकों से उपचार में सुधार कर सकता है या आवश्यकता को पूरी तरह से दूर कर सकता है। यद्यपि उपयोग के लिए एक बड़ी संभावना है, फिर भी सुधार के लिए क्षेत्र अभी भी हैं। सबसे पहले, पी. ए. एफ. सी. की गहराई सीमित है और इसका परीक्षण केवल मनुष्यों की सतही त्वचा में किया गया है जो फेफड़े या आंत्र जैसे अधिक केंद्रीय रूप से स्थित ट्यूमर के लिए कठिनाई पैदा कर सकता है। दूसरा, हालांकि प्रारंभिक माउस मॉडल ने नैनोपार्टिकल लेबलिंग के साथ प्रभावकारिता दिखाई है, इस इमेजिंग पद्धति की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए विशिष्ट कैंसर प्रकार की लेबलिंग और डाई दुष्प्रभावों का अधिक गहराई से अध्ययन करने की आवश्यकता है। संदर्भ बायोमेडिकल इंजीनियरिंग