VINE-seq
वाइन-सेक (अनुक्रम के लिए पोत अलगाव और नाभिक निष्कर्षण) एकल-नाभिक संकल्प पर मानव मस्तिष्क के सूक्ष्म वाहिकाओं की संवहनी और पेरिवास्कुलर कोशिकाओं को अलग करने और आणविक रूप से चिह्नित करने की एक विधि है। यह तकनीक विभिन्न ज्ञात प्रयोगशाला-आधारित रणनीतियों के संयोजन से प्राप्त की जाती है जिसमें मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों का एकल कोशिकाओं में यांत्रिक पृथक्करण, सूक्ष्म वाहिकाओं के नाभिक को अलग करने के लिए घनत्व प्रवणता अपकर्षण और निस्पंदन, कोशिकीय आबादी की प्रतिदीप्ति-सक्रिय कोशिका छँटाई (एफएसी) और बूंद-आधारित एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (ड्रॉप-एसएनआरएनए-एसईक्यू) शामिल हैं। कुल मिलाकर, यह मस्तिष्क के वास्कुलेचर में मौजूद विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का एक एकल-नाभिक ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल उत्पन्न करता है। एकल-नाभिक ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा के प्रसंस्करण और विश्लेषण के माध्यम से, मानव मस्तिष्क वास्कुलेचर के आणविक परिदृश्य का निर्माण करने के लिए कोशिका प्रकारों के भीतर और बीच की विषमता को अलग किया जा सकता है जो पहले नहीं किया गया था। पृष्ठभूमि मस्तिष्क स्वास्थ्य की एक केंद्रीय विशेषता जटिल वास्कुलेचर का रखरखाव है जो आवश्यक चयापचय, ऑक्सीजन, पोषक तत्वों और कचरे को मानव मस्तिष्क में और वहां से ले जाने के लिए कार्य करता है। वास्कुलेचर के व्यवधान से अल्जाइमर रोग और स्ट्रोक जैसे तंत्रिका संबंधी विकार हो सकते हैं। वास्कुलेचर कोशिका प्रकारों के एक विषम समूह का घर है, जिसमें एंडोथेलियल कोशिकाएं, पेरिसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स शामिल हैं, लेकिन ये इन तक ही सीमित नहीं हैं। हालाँकि पिछले कुछ वर्षों में वास्कुलेचर में कोशिकीय विविधता को समझने के कई प्रयास किए गए हैं, लेकिन पद्धतिगत और तकनीकी सीमाओं ने मस्तिष्क की जटिल इकाई को डिकोड करने की हमारी क्षमता में बाधा उत्पन्न की है। इसलिए, इस जटिल वातावरण में संवहनी और पेरिवास्कुलर कोशिकाओं के हमारे अपूर्ण लक्षण वर्णन के कारण तंत्रिका संबंधी विकारों के लिए हमारे उपचार विकल्प अपर्याप्त रहे हैं। एकल-कोशिका आर. एन. ए. अनुक्रमण (एस. सी. आर. एन. ए.-एस. ई. क्यू.) में हाल की प्रगति के माध्यम से, चूहों में मस्तिष्क वास्कुलेचर के आणविक एटलस को डिकोड किया गया है और मानव मस्तिष्क में पाए जाने वाले कोशिका प्रकारों के भीतर विषम प्रकृति को धीरे-धीरे उजागर किया गया है। इन उपलब्धियों के बावजूद, म्यूरीन मस्तिष्क वास्कुलेचर मानव मस्तिष्क वास्कुलेचर को पूरी तरह से पुनरावर्तित नहीं कर सकता है जिससे अनुवाद क्षमता की चिंता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, मानव मस्तिष्क के एस. सी. आर. एन. ए.-एस. ई. क्यू. पर ध्यान केंद्रित करने वाले कई पिछले अध्ययनों ने वास्कुलेचर में कोशिकीय विषमता को चिह्नित नहीं किया। वाइन-सेक नामक एक नई विधि की शुरुआत करके, एक शोध समूह ने मस्तिष्क के सूक्ष्म वाहिकाओं से अक्षत नाभिक को अलग करने की एक विधि प्राप्त की। इसे पूरा करने के लिए, उन्हें नाभिक को नुकसान पहुंचाए बिना सूक्ष्म वाहिकाओं को घेरने वाले बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) को हटाने की चुनौती से पार पाना था। हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था से जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों पर वाइन-सेक का उपयोग करके, उन्होंने एकल-नाभिक संकल्प पर मानव मस्तिष्क वास्कुलेचर में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का पहला लक्षण वर्णन प्रदान किया। कार्यप्रणाली वाइन-सेक मानव मस्तिष्क के वास्कुलेचर को विस्तार से बताने के लिए एक नई विधि है। यह मस्तिष्क के भीतर संवहनी और पेरिवास्कुलर कोशिका प्रकारों के एटलस की रचना करने के लिए एकल-न्यूक्लियोटाइड ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के साथ प्रयोगशाला विधियों के संयोजन का उपयोग करता है। निम्नलिखित चरण वाइन-सेक प्रोटोकॉल के आधार का विवरण देते हैंः प्रोटोकॉल के प्रारंभिक भाग में स्प्लेनोसाइट अलगाव और नमूने की सफाई से अनुकूलित कार्यप्रणाली शामिल है। वाइन-सेक के लिए, मानव मस्तिष्क के ऊतक को शुरू में पोस्टमॉर्टम के बाद निकाला जाता है। शोधकर्ताओं ने हिप्पोकैम्पस और ऊपरी फ्रंटल कॉर्टेक्स से मस्तिष्क के ऊतक निकाले। ऊतक के नमूनों को पूरी तरह से मिश्रित होने तक सजाया जाता है और कोई दिखाई देने वाला ऊतक नहीं रहता है। एच. बी. एस. एस. में नमूनों को 32 प्रतिशत डेक्सट्रान घोल के साथ मिलाया जाता है। घनीभूत वास्कुलेचर युक्त एक गोली के साथ सेलुलर परतों को अलग करने के लिए 20 मिनट के लिए 4,400 ग्राम पर अपकर्षण किया जाता है। पेलेट को परेशान किए बिना माइलिन और पैरेन्काइमल कोशिकाओं की शेष परतों को एस्पिरेटेड किया जाता है। छर्रों को डेक्सट्रान घोल में फिर से निलंबित किया जाता है। कोशिकीय मलबे से छर्रों को और कीटाणुरहित करने के लिए पी. बी. एस. के साथ धोने की एक श्रृंखला का प्रदर्शन किया जाता है। सूक्ष्म पात्रों को उजागर किया जाता है और शेष सेलुलर मलबे को हटा दिया जाता है। माउस स्प्लेनोसाइट्स को निकालने के लिए डिज़ाइन की गई एक विधि को अनुकूलित किया गया और शेष संवहनी कोशिकाओं से नाभिक को अलग करने में मदद करने के लिए प्रदर्शन किया गया। 10 मिनट के लिए 500 ग्राम पर अपकर्षण नाभिक से संवहनी कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जाता है और लाइसिस बफर, आर. एन. ए. एस. अवरोधक और ई. डी. टी. ए. मुक्त प्रोटीज अवरोधक के घोल में फिर से निलंबित किया जाता है। फिर नाभिक को कांच के डौंसर का उपयोग करके सजाया जाता है। सेन्ट्रीफ्यूगेशन के माध्यम से नमूनों को एक बार फिर पेलेट किया जाता है। शेष कोशिकीय मलबे और उपोत्पादों को सुक्रोज ग्रेडिएंट वॉश और फ्लोरोसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफ. ए. सी. एस.) का उपयोग करके समाप्त किया जाता है। छर्रों को उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने में मदद करने के लिए शुद्ध किया जाता है। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग शेष नाभिक के लिए किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग संवहनी नाभिक के भौतिक और रासायनिक गुणों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रवाह साइटोमेट्री के प्रयोगशाला रन अपेक्षित मूल्यों से 3.4 गुना अधिक अनुमानित हैं। जवाब में, शोधकर्ताओं ने प्रति नमूने लगभग 10,000 नाभिक प्राप्त करने के लिए अधिक नाभिकों को अलग और क्रमबद्ध किया। प्रवाह छँटाई के बाद, बूंद-आधारित एस. एन. आर. एन. ए.-एस. ई. क्यू. पुस्तकालयों को निष्पादित करने के लिए प्रति नमूने 10,000 नाभिक की आवश्यकता होती है। अनुक्रमण के लिए बूंद-आधारित एस. एन. आर. एन. ए.-एस. ई. क्यू. पुस्तकालय तैयार किए जाते हैं। पी. सी. आर. के 15 चक्रों के बाद पर्याप्त सी. डी. एन. ए. प्राप्त होता है। शोधकर्ताओं ने नोवासेक 6000 पर एस4 लेन पर संवहनी नाभिक को सफलतापूर्वक अनुक्रमित किया। अनुप्रयोग मस्तिष्क मानचित्रण अपने प्रयोग और प्रतिलेखन विश्लेषण के माध्यम से, वाइन-सेक के लेखकों और रचनाकारों ने पाया कि विधियों की श्रृंखला स्वस्थ मानव मस्तिष्क ऊतक में धमनी संगठन में मौजूद संवहनी एंडोथेलियल और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की प्रतिलेखन अभिव्यक्ति को स्पष्ट करने में सक्षम थी। इसके अतिरिक्त, वाइन-सेक मैट्रिक्स पेरिसाइट्स और ट्रांसपोर्ट पेरिसाइट्स नामक पेरिसाइट्स की दो नई उप-आबादी को पकड़ने में सक्षम था जो क्रमशः ईसीएम मॉड्यूलेशन और ट्रांसमेम्ब्रेन परिवहन में शामिल हो सकते हैं। अल्जाइमर रोग वाइन-सेक का उपयोग करके, ये शोधकर्ता अल्जाइमर रोग (एडी) में मानव मस्तिष्क वास्कुलेचर के आणविक आधार को उजागर करने में मदद करने में सक्षम थे। उन्होंने दिखाया कि एडी से जुड़े जीन संवहनी कोशिका प्रकारों में अत्यधिक व्यक्त किए गए थे और सामान्य मस्तिष्क के नमूनों की तुलना में एडी मस्तिष्क के नमूनों में एंडोथेलियल कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और पेरिवास्कुलर फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं की प्रचुरता में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन या हानि होती है। आगे के अनुप्रयोगों वाइन-सेक को मूल रूप से मानव मस्तिष्क के वास्कुलेचर को मैप करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, क्योंकि वर्तमान में कोई आणविक मानचित्र मौजूद नहीं है। जब से 2021 में वाइन-सेक की शुरुआत करने वाले पेपर का प्री-प्रिंट उपलब्ध था, तब से आणविक मानचित्र को मस्तिष्क वास्कुलेचर के बारे में हमारे ज्ञान के विस्तार में इसके योगदान के लिए मान्यता दी गई है जो मस्तिष्क रोगों के अधिक गहन अध्ययन और संभावित रूप से मस्तिष्क में दवा वितरण की चुनौती पर काबू पाने की अनुमति देगा। वाइन-सेक द्वारा उत्पन्न डेटा के कुछ अनुप्रयोगों ने एडी, डिमेंशिया, इस्केमिक स्ट्रोक और मस्तिष्क पर गंभीर कोविड-19 के प्रभावों के रोगजनन में हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने में योगदान दिया है। लाभ और नुकसान पिछले एकल-नाभिकीय अलगाव तकनीकों की तुलना में अधिक प्रमस्तिष्क नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय नाभिकीय