Ribose-seq
राइबोज़-सेक एक मानचित्रण तकनीक है जिसका उपयोग आनुवंशिकी अनुसंधान में जीनोमिक डी. एन. ए. में एम्बेडेड राइबोन्यूक्लियोटाइड्स, विशेष रूप से राइबोन्यूक्लियोसाइड मोनोफॉस्फेट (आर. एन. एम. पी.) की पूरी रूपरेखा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। अंतःस्थापित रिबोन्यूक्लियोटाइड को कोशिकाओं में डी. एन. ए. में सबसे आम परिवर्तन माना जाता है, और जीनोमिक डी. एन. ए. में उनकी उपस्थिति जीनोम स्थिरता को प्रभावित कर सकती है। जैसा कि हाल के अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि चूहे के डीएनए में रिबोन्यूक्लियोटाइड रोग विकृति को प्रभावित कर सकते हैं, जीनोमिक डीएनए में रिबोन्यूक्लियोटाइड का समावेश चिकित्सा आनुवंशिकी अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बन गया है। राइबोज़-सेक वैज्ञानिकों को यूकेरियोटिक या प्रोकैरियोटिक डीएनए में शामिल किए गए राइबोन्यूक्लियोटाइड्स के सटीक स्थान और प्रकार को निर्धारित करने की अनुमति देता है। तकनीक रिबोन्यूक्लियोटाइड्स के 2 'छोर में पाए जाने वाले अतिरिक्त हाइड्रॉक्सिल समूहों (ओ. एच.) की उपस्थिति का फायदा उठाती है, जो डी. एन. ए. को विकृत और अस्थिर कर सकते हैं। तकनीक को जॉर्जिया इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी के शोधकर्ताओं के एक समूह के सहयोग से विकसित किया गया था, जिसमें फ्रांसेस्का स्टोरिसी और क्यूंग डुक कोह (अब कैलिफोर्निया सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय में) और कोलोराडो विश्वविद्यालय के एन्सचुट्ज़ मेडिकल स्कूल में जे हेसेलबर्थ शामिल हैं। न्यूक्लिक एसिड आवश्यक मैक्रोमोलेक्यूल हैं जो सभी जीवन रूपों में आनुवंशिक जानकारी ले जाते हैं। इन बायोपॉलिमरों में न्यूक्लियोटाइड मोनोमर्स होते हैं, जो कार्बनिक अणु होते हैं जिनमें एक फॉस्फेट समूह, एक नाइट्रोजन युक्त आधार और एक पाँच-कार्बन चीनी (रिबोन्यूक्लियोटाइड में राइबोज और डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड में डीऑक्सीराइबोज) होती है। जबकि रिबोन्यूक्लियोटाइड आमतौर पर रिबोन्यूक्लिक एसिड (आर. एन. ए.) में स्थित होते हैं, वे डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डी. एन. ए.) में भी पाए जा सकते हैं। डी. एन. ए. में एम्बेडेड रिबोन्यूक्लियोसाइड मोनोफॉस्फेट (आर. एन. एम. पी.) की पहली खोज 1973 में लॉरेंस ग्रॉसमैन, रॉबर्ट वॉटसन और जेरोम विनोग्राड द्वारा चूहे और मानव कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रियल डी. एन. ए. में हुई थी। 2006 में, स्किज़ोसेकेरोमाइसेस पोम्बे ("विखंडन खमीर") के परमाणु डीएनए में आरएनएमपी की उपस्थिति की पुष्टि की गई थी, और तब से अन्य प्रजातियों में अन्वेषण जारी है। डी. एन. ए. में रिबोन्यूक्लियोटाइड्स का समावेश कई अध्ययनों ने उन तंत्रों की पहचान की है जिनके द्वारा रिबोन्यूक्लियोटाइड्स को डी. एन. ए. में जोड़ा जा सकता है, हटाया जा सकता है या उत्पन्न किया जा सकता है। मुख्य रूप से, डी. एन. ए. संश्लेषण प्रक्रिया के दौरान डी. एन. ए. में रिबोन्यूक्लियोटाइड शामिल किए जाते हैं। डी. एन. ए. प्रतिकृति शुरू करने के लिए, छोटे आर. एन. ए. प्राइमरों को पूरक डी. एन. ए. पर संश्लेषित किया जाता है ताकि प्राथमिक प्रतिकृति एंजाइमों, डी. एन. ए. पोलीमरेज़ की बाद की बंधन और प्रतिकृति कार्रवाई की अनुमति दी जा सके। आमतौर पर, इन प्राइमरों को फिर न्यूक्लियस एंजाइम, आर. एन. एस. एच. या फ्लैप स्ट्रक्चर-स्पेसिफिक एंडोन्यूक्लीज़ 1 (एफ. ई. एन. 1) द्वारा हटा दिया जाता है। इस प्रकार, क्षणिक आर. एन. एम. पी. की काफी मात्रा होती है जो आर. एन. ए. प्राइमर के रूप में डी. एन. ए. में मौजूद होती है और फिर बाद में हटा दी जाती है। डी. एन. ए. प्रतिकृति शुरू होने के बाद, आर. एन. एम. पी. को डी. एन. ए. पोलीमरेज़ द्वारा डी. एन. ए. में पूरी तरह से शामिल किया जा सकता है और यह प्रति 1,000 डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड में 1 से अधिक रिबोन्यूक्लियोटाइड के साथ डी. एन. ए. में रिबोन्यूक्लियोटाइड निगमन के प्रमुख तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है। एम्बेडेड आर. एन. एम. पी. को अक्सर रिबोन्यूक्लियोटाइड छेदन मरम्मत (आर. ई. आर.) तंत्र द्वारा हटाने के लिए लक्षित किया जाता है। हालाँकि, यदि आर. ई. आर. ठीक से काम नहीं कर रहा है, तो यह डी. एन. ए. में अंतर्निहित आर. एन. एम. पी. का एक अधिक स्थायी स्रोत बन सकता है। एक अन्य तंत्र जिसके द्वारा आर. एन. एम. पी. डी. एन. ए. में उत्पन्न हो सकते हैं, ऑक्सीडेटिव तनाव के माध्यम से होता है, जो डी. एन. ए. में डीऑक्सीराइबोज इकाई को राइबोज में बदल देता है। जबकि आर. ई. आर. मार्ग डी. एन. ए. से आर. एन. एम. पी. को हटाने के लिए सबसे कुशल प्रक्रिया है, राइबोन्यूक्लियोटाइड्स को 3 '-5' एक्सोन्यूक्लियस गतिविधि के माध्यम से भी हटाया जा सकता है जो डी. एन. ए. प्रतिकृति के दौरान डी. एन. ए. पोलीमरेज़ की प्रूफरीडिंग गतिविधियों द्वारा आयोजित किया जाता है। आर. एन. एम. पी. हटाने की अतिरिक्त विधियों में ऐसे चीरे शामिल हैं जो आइसोमरेज़ एंजाइम, टोपोआइसोमेरेज़ I द्वारा मध्यस्थता करते हैं। डी. एन. ए. में रिबोन्यूक्लियोटाइड्स के परिणाम यदि उन्हें हटाया और प्रतिस्थापित नहीं किया जाता है, तो डी. एन. ए. में रिबोन्यूक्लियोटाइड्स का कोशिकीय प्रक्रियाओं पर संरचनात्मक, रासायनिक और कार्यात्मक प्रभाव पड़ सकता है। जैसा कि पहली बार टी. एन. द्वारा मान्यता प्राप्त है। 1993 में जैसिहरी और अन्य, रिबोन्यूक्लियोटाइड्स की उपस्थिति डीएनए के पेचदार आकार को बी रूप से ए रूप में बदल सकती है। यह, कई अन्य रासायनिक परिणामों के अलावा, डी. एन. ए. के साथ प्रोटीन के बंधन को प्रभावित कर सकता है और क्रोमैटिन गतिशीलता, डी. एन. ए. प्रतिकृति, प्रतिलेखन, मरम्मत और अर्धसूत्रीविच्छेदन जैसी प्रक्रियाओं के लिए निहितार्थ हो सकता है। इसके अतिरिक्त, कुछ डी. एन. ए. पोलीमरेज़ डी. एन. ए. प्रतिकृति के दौरान एम्बेडेड आर. एन. एम. पी. को बायपास करने में असमर्थ होते हैं, जो आर. एन. एम. पी. के लंबे तार वाले स्थलों पर और बढ़ जाता है। यह प्रतिकृति तनाव का कारण बन सकता है जो संभावित रूप से प्रतिलेखन, गुणसूत्र पृथक्करण और भविष्य की प्रतिकृति में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, आर. ई. आर. प्रक्रिया में कुछ उपोत्पाद या विफलताएं भी संभावित रूप से डी. एन. ए. टूटने, पुनर्व्यवस्था और जीनोम अस्थिरता का कारण बन सकती हैं। रिबोन्यूक्लियोटाइड मानचित्रण 2015 तक, आर. एन. एम. पी. को डी. एन. ए. में शामिल करने के लिए कुछ तंत्र, परिणाम और अनुमानित दरें तेजी से स्पष्ट हो रही थीं। हालांकि, जीनोम में आरएनएमपी के स्थान की पहचान करने के लिए एक तकनीक की अभी भी कमी थी। अगली पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की बढ़ती पहुंच ने बड़े पैमाने पर जीनोमिक डीएनए में आरएनएमपी की अधिक सटीक पहचान के लक्ष्य की दिशा में प्रगति की सुविधा प्रदान की। 2015 में, क्यूंग डुक कोह, सत्य बालाचंदर, जे आर हेसेलबर्ट और फ्रांसेस्का स्टोरिसी ने डीएनए में आरएनएमपी की व्यवस्थित प्रोफाइलिंग के लिए एक नई विकसित तकनीक राइबोज़-सेक प्रस्तुत की। उन्होंने माइटोकॉन्ड्रियल और न्यूक्लियर डीएनए में आरएनएमपी की जीनोम-वाइड पहचान, आवृत्ति और स्थानीयकरण का दस्तावेजीकरण करने के लिए सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया जीनोम में राइबोज-सेक का उपयोग किया। इन निष्कर्षों ने अंततः जीनोम में आरएनएमपी निगमन के पैटर्न में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की। राइबोज़-सेक के समानांतर, डी. एन. ए. में अंतर्निहित आर. एन. एम. पी. के स्थलों को पकड़ने के लिए तीन अन्य तकनीकों का विकास किया गया थाः एमरीबो-सेक, हाईडेन-सेक और पु-सेक। राइबोज-सेक प्रक्रिया उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण की तैयारी में राइबोन्यूक्लियोटाइड्स को पकड़ने और टैग करने के लिए कई अनूठी विशेषताओं का उपयोग करती है। आर. एन. एम. पी. स्थलों को सीधे लक्षित करने के लिए, लेखकों ने एक क्षारीय उपचार प्रक्रिया का उपयोग किया जो आर. एन. एम. पी. स्थलों पर डी. एन. ए. को विकृत और विभाजित करता है। इन स्थलों पर दरार के लिए विशिष्टता रिबोन्यूक्लियोटाइड्स पर मौजूद अतिरिक्त हाइड्रॉक्सिल समूह के कारण इस क्षेत्र में अणु की सापेक्ष संवेदनशीलता से प्रेरित है। इन छोटे टुकड़ों की स्थिरता और संवर्धन की अनुमति देने के लिए और पी. सी. आर. प्रवर्धन से पहले टी5 एक्सोन्यूक्लीज़ पाचन से सुरक्षा के लिए, एकल फंसे हुए डी. एन. ए. टुकड़े-जिसमें रुचि के आर. एन. एम. पी. और एक अद्वितीय आणविक पहचान संख्या होती है-एकल फंसे हुए डी. एन. ए. (एस. एस. डी. एन. ए.) वृत्त बनाने के लिए स्व-बाध्य होते हैं। आर. एन. एम. पी. और डी. एन. ए. अंत के बंधन को सुविधाजनक बनाने के लिए, कोह एट अल। 2 '-फॉस्फेट (आर. एन. एम. पी. पक्ष) को 5'-फॉस्फेट (डी. एन. ए. पक्ष) से बांधने की अनुमति देने के लिए अरबीडोप्सिस थालियाना टी. आर. एन. ए. लाइगेज (ए. टी. आर. एन. एल.) की विशिष्ट बंधन क्रिया का उपयोग करें। अंत में, इस तकनीक से उत्पन्न पूरे पुस्तकालय की उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण सभी कैप्चर्ड एम्बेडेड आरएनएमपी के जीनोमिक निर्देशांक की पहचान करता है। 2019 में, स्टोरिसी प्रयोगशाला ने राइबोज़-सेक के लिए एक अद्यतन और आगे अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया। संशोधनों में छोटे आणविक बारकोड एडाप्टर, छोटे टुकड़े, परिवर्तित पीसीआर सेटिंग्स और जेल से काटने और शुद्ध करने के लिए समायोजित आकार श्रेणियों का उपयोग करना शामिल था। कुल मिलाकर, यह सुझाव दिया गया था कि बेहतर प्रोटोकॉल बड़े जीनोम में अनुप्रयोगों के लिए विधि की दक्षता में काफी वृद्धि कर सकता है। विधियाँ तैयारी जीनोमिक डी. एन. ए. निष्कर्षण रुचि की कोशिकाओं से जीनोमिक डी. एन. ए. निकालने के लिए, कोशिकाओं को पहले यांत्रिक या रासायनिक विधियों का उपयोग करके अलग किया जाना चाहिए। यह प्रत्येक कोशिका के नाभिक से डी. एन. ए. छोड़ता है, जिससे इसे शुद्ध और मात्रात्मक किया जा सकता है। राइबोज-सेक प्रोटोकॉल के लिए कुल 10यूजी डीएनए की आवश्यकता होती है। राइबोज-सेक् एडाप्टर की तैयारी राइबोज-सेक् एडाप्टर एक डी. टी. (डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड थाइमाइन) से बना होता है जिसके बाद एक एनीलिंग अनुक्रम, दो प्राइमर अनुक्रम और एक अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यू. एम. आई.) होता है। राइबोज-सेक् एडाप्टर तैयार करने के लिए, तीन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (ऑलिगोस) को एक घोल में मिलाया जाता है और 95-100 °C तक गर्म किया जाता है। इस तापमान पर, ओलिगो अनुक्रम एक-दूसरे से टकराते हैं, जिससे राइबोज़-सेक् एडाप्टरों का निलंबन होता है। फिर विलयित डबल-स्ट्रैंडेड राइबोज़-सेक एडाप्टर की मात्रा निर्धारित की जाती है। राइबोज-सेक के लिए 10 यू. एम. की सांद्रता की आवश्यकता होती है। जीनोमिक डी. एन. ए. जीनोमिक डी. एन. ए. के राइबोज़-सेक विखंडन को ब्लंट-एंडेड रिस्ट्रिक्शन एंजाइम डाइजेशन का उपयोग करके विखंडित किया जाता है। पाचन के बाद, विखंडित डी. एन. ए. को शुद्ध और मात्रात्मक किया जाता है। आर. एन. एम. पी. ग्रहण दर को अधिकतम करने के लिए आर. एन. एम. पी. ग्रहण तकनीकों (आर. ई. एस. सी. ओ. टी.) के लिए प्रतिबंध एंजाइम सेट और संयोजन अनुकूलन उपकरण विकसित किए गए थे। परिणामी घोल में 500-से 3,000-बी. पी. जीनोमिक टुकड़ों की आबादी होती है जिसका औसत आकार ~ 1.5 के. बी. होता है। बाद के डी. ए.-टेलिंग और एडेप्टर बंधन के लिए विखंडित जीनोमिक डी. एन. ए. के 10 यू. जी. की आवश्यकता होती है। डी. ए.-टेलिंग और एडाप्टर बंधन डी. ए. अणु प्रत्येक टुकड़े की पूंछ से बंधे होते हैं, जिससे राइबोज-सेक एडाप्टर के डी. टी. को बाद के चरण में इसके अनुरूप डी. ए. टेल को बांधने की अनुमति मिलती है। इस प्रक्रिया के बाद, डी. ए.-पूंछ वाले डी. एन. ए. को शुद्ध किया जाता है और पानी से अलग किया जाता है। राइबोज़-सेक् एडाप्टर, जिसमें इसका यादृच्छिक 8-आधार अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यू. एम. आई.) और एकल डी. टी. ओवरहैंग होता है, फिर रात भर घोल को 15 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करके लक्ष्य टुकड़े के डी. ए. छोर पर लगा दिया जाता है। फिर नमूने को शुद्ध किया जाता है और क्षार उपचार के लिए तैयार किया जाता है। क्षार उपचार क्षार उपचार के दौरान, दोहरे फंसे हुए डी. एन. ए. (डी. एस. डी. एन. ए.) को डी. एस. डी. एन. ए. को विकृत करने और एम्बेडेड रिबोन्यूक्लियोटाइड साइटों पर डी. एन. ए. को तोड़ने के लिए सोडियम हाइड्रॉक्साइड, एक मजबूत आधार के साथ उपचारित किया जाता है। यह दो छोरों के साथ एकल-फंसे हुए डी. एन. ए. (एस. एस. डी. एन. ए.) टुकड़े उत्पन्न करता हैः एक 2′, 3′-चक्रीय फॉस्फेट छोर और एक विपरीत 5′-हाइड्रॉक्सिल छोर। इसके बाद क्षारीय घोल को निष्क्रिय कर दिया जाता है और एस. एस. डी. एन. ए. को शुद्ध किया जाता है। सेल्फ-लाइगेशन (सर्कुलराइजेशन) इसके बाद, एस. एस. डी. एन. ए. युक्त घोल को अरेबिडोप्सिस थालियाना टी. आर. एन. ए. लाइगेज (ए. टी. आर. एन. एल. 24) के साथ इंक्यूबेट किया जाता है। ए. टी. आर. एन. एल. आर. एन. ए. के 2 ', 3'-चक्रीय फॉस्फेट छोरों को 2 '-फॉस्फेट में परिवर्तित करके ए. थालिनाना आर. आर. एन. ए. परिपक्वता में सहायता करता है और इन्हें आर. एन. ए. या डी. एन. ए. के 5'-फॉस्फेट छोरों में जोड़ता है। ए. टी. आर. एन. एल. को एस. एस. डी. एन. ए. विलयन से परिचित कराना एस. एस. डी. एन. ए. के स्व-बंधन को उत्प्रेरित करता है क्योंकि 2 ', 3' चक्रीय फॉस्फेट उसी एस. एस. डी. एन. ए. स्ट्रैंड के 5 'फॉस्फेट छोर तक जाता है। परिणामस्वरूप चक्रीय एस. एस. डी. एन. ए. संरचनाओं में लक्षित एम्बेडेड रिबोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम, एक यू. एम. आई. और ओलिगो अनुक्रम होते हैं जो बाकी गोलाकार एस. एस. डी. एन. ए. संरचना बनाते हैं। रैखिक एस. एस. डी. एन. ए. को हटाना स्व-बंधन द्वारा बनाई गई गोलाकार एस. एस. डी. एन. ए. संरचनाएं एंजाइम टी5 एक्सोन्यूक्लीज़ द्वारा क्षरण के लिए प्रतिरोधी हैं। हालांकि, अनियमित, रैखिक एसएसडीएनए नहीं है। इसलिए, टी5 एक्सोन्यूक्लीज़ के साथ उत्पादों और शेष डी. एन. ए. टुकड़ों का उपचार करने से चुनिंदा रूप से अनियमित, रैखिक एस. एस. डी. एन. ए. तारों का क्षरण होता है, जबकि स्व-सीमित एस. एस. डी. एन. ए. वृत्तों को अक्षुण्ण छोड़ दिया जाता है। इस तरह, अवांछित रैखिक एस. एस. डी. एन. ए. टुकड़े अवक्रमित हो जाते हैं और केवल सफलतापूर्वक-लीगेटेड एस. एस. डी. एन. ए. वृत्त रह जाते हैं। 2 'फॉस्फेट को हटाना इससे पहले कि पी. सी. आर. संभव हो, एस. एस. डी. एन. ए. वृत्तों के बंधन वाले जंक्शनों पर 2' फॉस्फेट समूहों को हटा दिया जाना चाहिए। इसे पूरा करने के लिए, गोलाकार एस. एस. डी. एन. ए. विलयन को 2 'फॉस्फोट्रांसफेरेज, टी. पी. टी. 1 के साथ उपचारित किया जाता है, जिससे बंधन जंक्शन पर शेष 2' फॉस्फेट को हटा दिया जाता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पी. सी. आर.) राइबोज़-सेक के बाद, पी. सी. आर. प्रवर्धन का उपयोग करके प्रत्येक एस. एस. डी. एन. ए. वृत्त पर प्रवर्धन किया जाता है। पी. सी. आर. के पहले दौर में, विलयन में अनुक्रमण प्राइमर पेश किए जाते हैं और एस. एस. डी. एन. ए. वृत्तों को प्रवर्धित किया जाता है। चयनित अनुक्रमण प्राइमर पसंद के लक्षित पुस्तकालय के साथ संगत होना चाहिए। विवरण के लिए आवेदन अनुभाग देखें। पी. सी. आर. के दूसरे दौर में, अधिक विशिष्ट अनुक्रमण प्राइमर पेश किए जाते हैं, और एस. एस. डी. एन. ए. वृत्तों को आगे बढ़ाया जाता है। पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पी. ए. जी. ई.) राइबोज-सेक पुस्तकालय की उपस्थिति की पुष्टि करने और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों की जांच करने के लिए किया जाता है। आकार चयन और जेल शुद्धिकरण जेल शुद्धिकरण का उपयोग अनुक्रमण से पहले राइबोज-सेक पुस्तकालय को शुद्ध करने के लिए किया जाता है। इस स्तर पर, टुकड़ों को लंबाई के आधार पर चुना जाता है ताकि उन टुकड़ों को समाप्त किया जा सके जो रुचि के लक्ष्य आकार की सीमा से बाहर हैं। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग रुचि के अनुक्रमों को पकड़ने और शुद्ध करने के बाद, नमूनों को अनुक्रमित किया जा सकता है और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है। विवरण के लिए आवेदन अनुभाग देखें। अनुप्रयोग राइबोज़-सेक को कई परिस्थितियों में और विभिन्न यूकेरियोटिक प्रजातियों की कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है (देखें-लाभ और सीमाएँ)। प्रारंभिक लक्षण वर्णन राइबोस-सेक का उपयोग पहली बार कोह एट अल द्वारा किया गया था। (2015) आर. एन. एस.-एच. 2-की कमी (आर. एन. एच. 201) उभरते खमीर के माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु डी. एन. ए. में आर. एन. एम. पी. के स्थान को चिह्नित करने के लिए। उन्होंने पाया कि आर. एन. एम. पी. परमाणु जीनोम में 0.449 आर. एन. एम. पी. प्रति किलोबेस (के. बी.) और माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम में 19.5 आर. एन. एम. पी. प्रति के. बी. पर मौजूद थे। इसके अतिरिक्त, कोह एट अल। (2015) डी. एन. ए. में आर. सी. और आर. जी. को शामिल करने के लिए मौजूद एक स्पष्ट पूर्वाग्रह की पहचान करने में सक्षम थे। उन्होंने पाया कि खमीर कोशिकाओं में, सभी आधारों की संबंधित अपेक्षित आवृत्तियों के सापेक्ष, आर. ए. और आर. यू. की तुलना में अधिक आवृत्तियों पर जीनोमिक डी. एन. ए. में आर. सी. और आर. जी. बनाए रखे जाते हैं। आधार प्रकार के बावजूद, आर. एन. एम. पी. अक्सर उन स्थलों पर मौजूद थे जो परमाणु और माइटोकॉन्ड्रियल डी. एन. ए. दोनों में डी. ए. के तुरंत नीचे की ओर थे। आरएनएमपी निगमन के लिए कई अतिरिक्त "हॉटस्पॉट" की पहचान भी विशिष्ट जीनोमिक विशेषताओं के संबंध में की गई थी (जैसे। विशेष जीन स्थलों, तारों, या गुणसूत्र क्षेत्रों में)। बहु-प्रजातियों की तुलना प्रारंभिक लक्षण वर्णन पर विस्तार, बालाचंदर और अन्य। (2020) ने अपने राइबोज़-सेक प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया और इसका उपयोग तीन खमीर प्रजातियों के कई उपभेदों के माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु डीएनए में आरएनएमपी को मैप करने के लिए एक जैव सूचना विज्ञान उपकरण (राइबोज़-मैप, https://github.com/agombolay/ribose-map पर उपलब्ध) के साथ कियाः सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया, सैक्रोमाइसेस पैराडॉक्सस और स्किज़ोसेक्रोमाइसेस पोम्बे। इनमें से प्रत्येक प्रजाति और उपभेदों से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) में, यह प्रदर्शित किया गया था कि आरएनएमपी का प्रकार जो किसी दिए गए जीनोमिक स्थिति में शामिल किया जाता है, डीएनएमपी द्वारा सबसे अधिक प्रभावित होता है जो तत्काल ऊपर की स्थिति (-1) पर स्थित होता है। कई जीनोमों में राइबोज़-सेक का उपयोग करके, बालाचंदर और अन्य। खमीर उपभेदों और प्रजातियों के बीच विभिन्न समानताओं और अंतरों को स्पष्ट करने में भी सक्षम थे। सभी उपभेदों के एम. टी. डी. एन. ए. में आर. एन. एम. पी. पैटर्न ने आर. यू. की कम आवृत्ति दिखाई; हालाँकि, एस. पैराडॉक्सस और एस. सेरेविसिया आर. सी. के लिए वरीयताओं का संकेत देते हैं जबकि एस. पोम्बे ने आर. जी. के लिए वरीयताओं का संकेत दिया। परमाणु डीएनए में, तीन खमीर प्रजातियाँ काफी हद तक समान थीं। इसके अतिरिक्त, आरएनएमपी को लघु-न्यूक्लियोटाइड पुनरावृत्ति अनुक्रमों में महत्वपूर्ण रूप से समृद्ध किया गया था। राइबोज़-सेक के इस अनुप्रयोग ने आरएनएमपी निगमन पैटर्न के लक्षण वर्णन और अनुक्रम संदर्भ के भीतर इस प्रक्रिया के संभावित चालकों की पहचान की अनुमति दी। खमीर जीनोम से परे एक गैर-यीस्ट प्रजाति में किए जाने वाले पहले रिबोन्यूक्लियोटाइड मानचित्रण अध्ययन में, क्लैमाइडोमोनास रीनहार्ड्टी, एक प्रकाश संश्लेषक एककोशिकीय हरे शैवाल के परमाणु, माइटोकॉन्ड्रियल और क्लोरोप्लास्ट जीनोम में आरएनएमपी का मानचित्रण करने के लिए राइबोज-मैप के संयोजन में राइबोज-सेक का उपयोग किया गया था। इस प्रजाति के माइटोकॉन्ड्रियल और क्लोरोप्लास्ट डीएनए में, आरएएस को अन्य आधारों पर अधिमानतः शामिल किया गया प्रतीत होता है, जबकि परमाणु डीएनए ने आरजी और आरसी निगमन के प्रति पूर्वाग्रह दिखाया। सभी सी. रीनहार्ड्टी ऑर्गेनेल्स में, आरयू लगातार सबसे कम प्रतिनिधित्व वाला आरएनएमपी था, जो यीस्ट माइटोकॉन्ड्रिया के निष्कर्षों के अनुरूप है। यीस्ट प्रोफाइल के समान, सी. रीनहार्ड्टी में आर. एन. एम. पी. का समावेश डी. एन. एम. पी. द्वारा तुरंत ऊपर की ओर (स्थिति-1) से सबसे अधिक प्रभावित होता है। इस सेटिंग में, राइबोज़-सेक के अनुप्रयोग ने पहली बार इस प्रजाति में आरएनएमपी निगमन वितरण और पैटर्न की पहचान करने की अनुमति दी। राइबोज-सेक के लाभ और सीमाएँ क्योंकि राइबोज-सेक विशेष रूप से डीएनए में एम्बेडेड राइबोन्यूक्लियोटाइड्स को लक्षित करता है, और आरएनए प्राइमर या ओकाज़ाकी टुकड़ों को नहीं पकड़ता है, यह अत्यधिक हस्तांतरणीय है और जीनोमिक डीएनए की एक विस्तृत विविधता में एम्बेडेड राइबोन्यूक्लियोटाइड्स को प्रभावी ढंग से लक्षित कर सकता है। इसलिए, राइबोज़-सेक मानकीकृत प्रक्रियाओं की आवश्यकता के बिना, छोटे जीनोमिक अणुओं या बड़े परमाणु जीनोम सहित विभिन्न प्रकार के जीनोम में आरएनएमपी मानचित्रण की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, राइबोज़-सेक की विशिष्टता उन स्थितियों में भी आर. एन. एम. पी. के मानचित्रण की अनुमति देती है जिनमें डी. एन. ए. पर्यावरणीय तनावों के संपर्क में आता है जो ब्रेक और/या अबासिक साइटों को उत्पन्न करके डी. एन. ए. को नुकसान पहुंचाते हैं। राइबोज़-सेक उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए एडेप्टरों में यू. एम. आई. का उपयोग करता है जो अनुक्रमण रीड्स का अनुमान लगाने की अनुमति देता है, और इस प्रकार आर. एन. एम. पी. हॉटस्पॉट का अधिक सटीक पता लगाने के लिए प्रदान करता है। राइबोज़-सेक खमीर कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है; तकनीक को संभावित रूप से किसी भी प्रजाति की किसी भी प्रकार की कोशिका पर लागू किया जा सकता है, जिससे यह अधिकांश जीवों में आर. एन. एम. पी. के स्थान और पैटर्न को स्पष्ट करने के लिए एक उपयोगी उपकरण बन जाता है। राइबोज़-सेक सामान्य प्रयोगशाला उपकरण और अभिकर्मकों का उपयोग करता है जो स्रोत के लिए काफी आसान हैं, जो इसे कई आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए एक सुलभ तकनीक बनाता है। राइबोज-सेक की सीमाएँ क्योंकि यह एकल आर. एन. एम. पी. को लक्षित करता है, राइबोज-सेक लंबे राइबोन्यूक्लियोटाइड मार्गों को नहीं पकड़ सकता है। इसलिए, राइबोज़-सेक आर. एन. ए. प्राइमर या ओकाज़ाकी टुकड़ों के मानचित्रण के लिए एक उपयुक्त तकनीक नहीं होगी, जो डी. एन. ए. प्रतिकृति या टूटने के दौरान बनाई जा सकती है। राइबोज़-सेक को जीनोमिक डी. एन. ए. से आर. एन. एम. पी. पुस्तकालयों को तैयार करने में लगभग 4 दिन लगते हैं। प्रोटोकॉल भी अपेक्षाकृत जटिल है, जिसके लिए कई चरणों की आवश्यकता होती है। पूरक विधियाँ राइबोज़-मैप राइबोज़-मैप बड़े, जटिल आरएनएमपी कच्चे अनुक्रमण डेटासेट के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए एक जैव-सूचनात्मक उपकरण है। राइबोज़-मैप राइबोज़-सेक, एमरिबोसेक, पु-सेक, अल्क-हाइड-सेक और आरएचआईआई-हाइड-सेक के साथ संगत है। (आर. एन. एम. पी. पकड़ने के लिए अन्य तकनीकें देखें)। आर. ई. एस. सी. ओ. टी. (रिस्ट्रिक्शन एंजाइम सेट एंड कॉम्बिनेशन ऑप्टिमाइजेशन टूल्स) आर. ई. एस. सी. ओ. टी. एक कम्प्यूटेशनल विधि है जो प्रतिबंध एंजाइमों के दिए गए विकल्प के लिए आर. एन. एम. पी.-कब्जा किए गए क्षेत्रों के जीनोमिक कवरेज की गणना करती है और फिर आर. ई. सेटों को अनुकूलित करती है और आर. एन. एम. पी. कब्जा दर को अधिकतम करने के लिए उच्चतम कवरेज के साथ आर. ई. सेट का चयन करती है। आर. एन. एम. पी. के लिए अन्य तकनीकें एमरीबोसेक को पकड़ती हैंः 5 'पक्ष से एम्बेडेड आर. एन. एम. पी. के ऊपर की ओर डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड को पकड़ने के लिए मानव आर. एन. एस. एच. 2 और टी. 4 क्विक लाइगेज का उपयोग करती हैं। आर. एच. आई. आई.-हाइडन-सेकः एस्चेरिचिया कोलाई आर. एन. ए. एस. एच. आई. आई. और टी. 4 आर. एन. ए. लाइगेज का उपयोग अपने 5 'पक्ष से एम्बेडेड आर. एन. एम. पी. को पकड़ने के लिए करता है। आरएचआईआई-हाइडएन-सेक आरएनएमपी और ओकाज़ाकी टुकड़ों के साथ समाप्त डीएनए अनुक्रम को भी पकड़ सकता है। पु-सेकः 3 'साइड से एम्बेडेड आरएनएमपी के डाउनस्ट्रीम डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड को पकड़ने के लिए क्षारीय स्थितियों और टी4 आरएनए लाइगेज का उपयोग करता है। ओकाज़ाकी के टुकड़ों को पकड़ सकते हैं। एल्क-हाइड-एन-सेकः 3 'साइड से एम्बेडेड आरएनएमपी के डाउनस्ट्रीम डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड को पकड़ने के लिए क्षारीय स्थितियों और टी4 आरएनए लाइगेज का उपयोग करता है। ओकाज़ाकी के टुकड़ों को भी पकड़ सकते हैं। आर. आई. एस. क्यू.-एस. ई. क्यू. (रिबोन्यूक्लियोटाइड स्कैनिंग क्वांटिफिकेशन सीक्वेंसिंग): आर. एन. एम. पी. के अपस्ट्रीम पड़ोसी डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड को पकड़ने के लिए पूर्ण मात्रा का उपयोग करता है। संदर्भ रिबोन्यूक्लीज़ आनुवंशिक मानचित्रण