Deterministic Barcoding in Tissue for Spatial Omics Sequencing
स्थानिक ओमिक्स अनुक्रमण (डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू.) के लिए ऊतक में निर्धारक बारकोडिंग को 2020 में येल विश्वविद्यालय में रोंग फैन और उनके सहयोगियों द्वारा ऊतक के नमूने के भीतर स्थानिक जीन अभिव्यक्ति विषमता का अध्ययन करने के लिए एक बहु-ओमिक्स दृष्टिकोण बनाने के लिए विकसित किया गया था। इस विधि का उपयोग ताजा या जमे हुए फॉर्मेल्डिहाइड-स्थिर ऊतक नमूनों में एकल-कोशिका संकल्प पर सह-मानचित्रण एम. आर. एन. ए. और प्रोटीन स्तरों के लिए किया जा सकता है। डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. नेक्स्ट जेनरेशन सीक्वेंसिंग (एन. जी. एस.) और माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करता है। यह विधि ऊतक के नमूने के एक साथ स्थानिक प्रतिलेखन और प्रोटिओमिक विश्लेषण की अनुमति देती है। डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. प्रति पिक्सेल पता लगाने योग्य जीन की संख्या बढ़ाकर, सेलुलर रिज़ॉल्यूशन में वृद्धि करके और कार्यान्वयन में आसानी करके उच्च-परिभाषा स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स (एच. डी. एस. टी.) और स्लाइड-एस. ई. क्यू. जैसे पिछले स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स अनुप्रयोगों में सुधार करता है। बहुकोशिकीय प्रणालियों में अनुप्रयोग प्रत्येक व्यक्तिगत कोशिका का कार्य उनके स्थानिक स्थान और परिवेश से प्रभावित होता है। इस प्रकार, एक स्थानिक संदर्भ में एक ऊतक में एम. आर. एन. ए. और प्रोटीन दोनों स्तरों को प्रोफाइल करने के लिए डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. के कार्यान्वयन से कई जैविक प्रक्रियाओं की बेहतर समझ हो सकती है। डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. का उपयोग कई अलग-अलग क्षेत्रों जैसे ऑन्कोलॉजी, विकासात्मक जीव विज्ञान और पैथोलॉजी में किया जा सकता है। विकासात्मक जीवविज्ञान में उपयोग से इस बात की बेहतर समझ हो सकती है कि ऑर्गेनोजेनेसिस कैसे होता है, और ऑन्कोलॉजी में यह ट्यूमरजेनेसिस और प्रगति में विषमता की भूमिका के बारे में अधिक जानकारी प्रदान कर सकता है। कार्यप्रणाली डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. एक सटीक नियंत्रित पैटर्न में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड बारकोड देने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रणाली का उपयोग करता है। यह प्रणाली ए1बी1, ए1बी2 आदि लेबल वाले खंड में अद्वितीय बारकोड के ग्रिड का उत्पादन करने के लिए लंबवत रूप से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड बारकोड (ए1-ए50 और बी1-बी50) के दो सेटों को लागू करती है। उपकरण तैयार करने के लिए डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. को बारकोड देने के लिए विशेष रूप से तैयार किए गए माइक्रोफ्लुइडिक्स उपकरण की आवश्यकता होती है। माइक्रोफ्लुइडिक्स माइक्रोन पैमाने पर तरल पदार्थों के सटीक हेरफेर को सक्षम बनाता है। डी. बी. आई. टी. एस. ई. क्यू. उपकरण सिलिकॉन वेफर मोल्ड में पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पी. डी. एम. एस.) कास्ट का उपयोग करके तैयार किया जाता है। यह उपकरण उपयोगकर्ता को बिना किसी विशेष उपकरण के मैक्रो स्केल पर उपयुक्त चैनलों में तरल अभिकर्मकों को जमा करने की अनुमति देता है। इन अभिकर्मकों को तब निर्वात द्वारा ऊतक खंड की सतह पर 10,25 या 50 माइक्रोन चौड़े चैनलों के माध्यम से खींचा जाता है। डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. उपकरण के अन्य घटक दो पी. डी. एम. एस. जलाशय और ऊतक में उपकरण फ्लश को पकड़ने के लिए एक्रिलिक क्लैंप प्रणाली हैं। ऊतक की तैयारी और एंटीबॉडी स्टेनिंग डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. का एक लाभ ऊतक फिक्सिंग के रूप में जानी जाने वाली प्रक्रिया में फॉर्मेल्डिहाइड के साथ संरक्षित ऊतक स्लाइड पर इसका उपयोग करने की क्षमता है, जो अन्य स्थानिक ऑमिक्स पद्धतियों के साथ असंगत है। ऊतकों को जमाया जाता है, स्थिर किया जाता है और बहुत पतले टुकड़ों में विभाजित किया जाता है जो कांच की स्लाइडों पर लगाए जाते हैं। यदि नमूने में प्रोटीन के बारे में जानकारी वांछित है, तो ऊतक को पहले एंटीबॉडी-व्युत्पन्न डीएनए टैग (एडीटी) के साथ दाग दिया जाता है। एडीटी एक विशिष्ट बारकोड अनुक्रम और एक पॉली-ए पूंछ अनुक्रम वाले एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड से संयुग्मित एंटीबॉडी से बने होते हैं। पॉली-ए पूंछ को बारकोड ए पर पॉली-टी अनुक्रम द्वारा पहचाना जाएगा, जिससे इसे एक स्थानिक स्थान से जोड़ा जा सकेगा। बारकोडिंग एंटीबॉडी स्टेनिंग (यदि वांछित हो) के बाद, पहले माइक्रोफ्लुइडिक्स चिप का उपयोग करके ऊतक के नमूने पर 50 बारकोड का पहला सेट लगाया जाता है। प्रत्येक 'ए' प्राइमर में एक अद्वितीय बारकोड अनुक्रम, एक बंधन लिंकर और एक पॉली टी अनुक्रम होता है। पॉली-टी अनुक्रम ऊतक के नमूने में एम. आर. एन. ए. और पहले लागू किए गए ए. डी. टी. पर पॉली-ए पूंछ से जुड़ता है। इसके बाद रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन बारकोड और एम. आर. एन. ए. या एंटीबॉडी टैग अनुक्रम वाला पहला सी. डी. एन. ए. स्ट्रैंड उत्पन्न करता है। चिप बी को फिर उसी ऊतक स्लाइड पर लगाया जाता है। चिप बी पहले के लंबवत बारकोड का दूसरा सेट वितरित करेगा, जिससे एक ग्रिड पैटर्न बनेगा। प्रत्येक 'बी' ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड में एक अद्वितीय बारकोड अनुक्रम, एक पी. सी. आर. हैंडल, एक बंधन लिंकर और सी. डी. एन. ए. शुद्धिकरण के लिए बायोटिन होता है। बंधन संयोजक अनुक्रमों का उपयोग बारकोड ए और बी को एक एकल डीएनए स्ट्रैंड में एक साथ जोड़ने के लिए किया जाता है। अंत में, एक लिसिस चरण ऊतक से सी. डी. एन. ए. को एक पूल किए गए नमूने में निकालता है जिसमें सभी बारकोडेड स्ट्रैंड होते हैं। पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण चरण 3 में उत्पादित सीडीएनए लाइसेट को स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है जो बारकोड बी पर बायोटिन को पहचानते हैं। पूरक सी. डी. एन. ए. स्ट्रैंड को फिर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा संश्लेषित किया जाता है, इसके बाद पी. सी. आर. प्रवर्धन और पुस्तकालय का अंतिम शुद्धिकरण होता है। इसके बाद पुस्तकालय को अगली पीढ़ी (इल्यूमिना) अनुक्रमण का उपयोग करके अनुक्रमित किया जाता है। डेटा विश्लेषण बारकोड से प्राप्त स्थानिक जानकारी के सटीक संबंध को सक्षम करने के लिए प्रत्येक बारकोडिंग चरण से पहले, दौरान और बाद में ऊतक स्लाइड की छवि बनाई जाती है। प्रत्येक एम. आर. एन. ए. अनुक्रम के साथ बारकोड को जोड़ना ऊतक का एक स्थानिक प्रतिलेखन मानचित्र प्रदान करता है। हालांकि यह एक एकल-कोशिका पद्धति नहीं है, 10 यू. एम. चैनल प्रति वर्ग केवल 1 से 2 कोशिकाओं को पकड़ते हैं, जिससे लगभग एक-एकल-कोशिका संकल्प उत्पन्न होता है। एडीटी अनुक्रम स्थानिक प्रोटिओमिक जानकारी को पकड़ते हैं जिसकी तुलना ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा से की जा सकती है। विशिष्ट कोशिका आबादी की पहचान दो तरीकों से की जा सकती है। सबसे पहले, प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए पिछले एकल-कोशिका आर. एन. ए.-से. क्यू. (एस. सी. आर. एन. ए.-से. क्यू.) प्रोफाइल के साथ प्रतिलेखन का मिलान करके। दूसरा, स्थानिक विभेदक अभिव्यक्ति (स्पेटियलडीई) का उपयोग करना, एक पैटर्न पहचानने वाला सॉफ्टवेयर जो एस. सी. आर. एन. ए.-एस. ई. क्यू. डेटा के बिना ऊतक प्रकारों को अलग कर सकता है। लाभ और सीमाएँ डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. एम. आर. एन. ए. और प्रोटीन के सह-मानचित्रण की अनुमति देकर अन्य स्थानिक-ओमिक्स तकनीकों पर एक लाभ प्रदान करता है। यह विश्लेषण के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटिओमिक डेटा दोनों प्रदान करता है। तकनीक को आसानी से लागू किया जा सकता है और शोधकर्ता की जरूरतों और रुचि के प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग एच एंड ई और प्रतिरक्षी ऊतक के नमूनों के साथ-साथ फॉर्मेल्डिहाइड-स्थिर ऊतक के नमूनों पर सफलतापूर्वक किया जा सकता है। बारकोडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले चैनलों को 10 माइक्रोन, 25 माइक्रोन और 50 माइक्रोन से संकल्प आवश्यकताओं के लिए समायोजित करने के लिए बदला जा सकता है। सीमाएँ डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. के विभेदन में एकल कोशिका विभेदन नहीं है, लेकिन यह एकल कोशिका विभेदन के करीब है। पिक्सेल आकार की सैद्धांतिक सीमा ~ 5 माइक्रोन है, जो एकल कोशिका अवलोकन के एकल या अंश के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त छोटा है लेकिन इसे लागू नहीं किया गया है। वर्तमान चैनल विन्यास के साथ एक ऊतक पर मानचित्रण क्षेत्र के लिए एक आकार सीमा है, 10 माइक्रोन चैनलों का उपयोग करके यह ऊतक के केवल 1 मिमी × 1 मिमी क्षेत्र को मानचित्रित करने की अनुमति देता है। इस सीमा को दूर करने के लिए अतिरिक्त बारकोडिंग चैनलों को कवर किए गए क्षेत्र को बढ़ाने के लिए जोड़ा जा सकता है। सारांश ऊतक कोशिकाओं की विषम आबादी से बने होते हैं। यह समझना कि ये कोशिकाएं एक साथ कैसे काम करती हैं और ऊतक में प्रत्येक कोशिका प्रकार की भूमिका कैंसर अनुसंधान और विकासात्मक जीव विज्ञान जैसे क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है। जबकि एकल कोशिका ऑमिक्स प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने इन जटिल वातावरण को समझने के हमारे प्रयास में सुधार किया है, स्थानिक जानकारी की उल्लेखनीय रूप से कमी रही है। स्थानिक ऑमिक्स के आगमन से इसमें सुधार हुआ है। डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. स्थिर या ताजा ऊतक वर्गों से स्थानिक प्रतिलेखन और प्रोटिओमिक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक सुलभ विधि प्रदान करता है। 10, 25 या 50 माइक्रोन रिज़ॉल्यूशन के साथ, डी. बी. आई. टी.-एस. ई. क्यू. लगभग एकल कोशिका रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है और अत्यधिक विशिष्ट इमेजिंग उपकरण की आवश्यकता के बिना स्थानिक ऑमिक्स डेटा प्रदान करता है। संदर्भ ओमिक्स डीएनए बारकोडिंग