Cycloheximide chase
साइक्लोहेक्सिमाइड चेज़ परख एक प्रयोगात्मक तकनीक है जिसका उपयोग आणविक और कोशिकीय जीव विज्ञान में स्थिर अवस्था प्रोटीन स्थिरता को मापने के लिए किया जाता है। साइक्लोहेक्सिमाइड एक ऐसी दवा है जो यूकेरियोटिक प्रोटीन अनुवाद में विस्तार चरण को रोकती है, जिससे प्रोटीन संश्लेषण को रोका जा सकता है। संवर्धित कोशिकाओं में साइक्लोहेक्सिमाइड को जोड़ने के बाद कई समय बिंदुओं पर प्रोटीन लिसिस को समय के साथ प्रोटीन क्षरण का निरीक्षण करने के लिए आयोजित किया जाता है और इसका उपयोग प्रोटीन के अर्ध-जीवन को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इन परीक्षणों के बाद अक्सर प्रोटीन की प्रचुरता का आकलन करने के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग की जाती है और इमेजजे जैसे मात्रात्मक उपकरणों का उपयोग करके इसका विश्लेषण किया जा सकता है। कार्यान्वयन साइक्लोहेक्सिमाइड चेज़ परख विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं जैसे कि खमीर और स्तनधारी कोशिका रेखाओं का उपयोग करके आयोजित किए गए हैं। विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिका प्रणाली के आधार पर, परख अनुप्रयोग और समय पाठ्यक्रम में भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, रुचि के प्रोटीन सब्सट्रेट को व्यक्त करने वाली खमीर कोशिकाओं को आमतौर पर 90 मिनट तक चलने वाले साइक्लोहेक्सिमाइड पीछा करने की आवश्यकता होती है ताकि प्रोटीन का कारोबार हो सके। इसके विपरीत, स्तनधारी कोशिका रेखाओं में व्यक्त होने वाले प्रोटीन स्थिर अवस्था में अधिक स्थिर होते हैं और उन्हें 3 से 8 घंटे तक पीछा करने की आवश्यकता हो सकती है। प्रोटीन की जटिलता के आधार पर और क्या यह मॉडल प्रणाली के लिए अत्यधिक अभिव्यक्त या अंतर्जात है, पीछा करने की आवश्यक लंबाई भिन्न हो सकती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरे पीछा के दौरान प्रोटीन संश्लेषण बाधित हो, साइक्लोहेक्सिमाइड को अक्सर हर कुछ घंटों में नमूने में डाला जाता है। खमीर में, साइक्लोहेक्सिमाइड पीछा करने के साथ समय के साथ प्रोटीन स्थिरता का आकलन करने के लिए अक्सर विलोपन उपभेदों का उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, खमीर उपभेदों में महत्वपूर्ण क्षरण तंत्र की कमी होती है जैसे कि चैपरोन, ई3 लिगाज़ और वैक्यूलर प्रोटीन का उपयोग अक्सर रुचि के प्रोटीन सब्सट्रेट के लिए क्षरण के तंत्र को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। दवा उपचार (जैसे एमजी132) का उपयोग क्षरण के चरणों को रोकने के लिए भी किया जाता है, इसके बाद यह देखने के लिए कि रुचि के प्रोटीन की स्थिरता कैसे प्रभावित होती है, साइक्लोहेक्सिमाइड का पीछा किया जाता है। ये प्रयोग स्तनधारी कोशिकाओं में खमीर हटाने वाले उपभेदों के स्थान पर संगत नॉकडाउन प्रक्रियाओं के कार्यान्वयन के साथ किए जा सकते हैं। साइक्लोहेक्सिमाइड का पीछा करना यह आकलन करने के लिए भी मूल्यवान है कि विभिन्न उत्परिवर्तन प्रोटीन की स्थिरता को कैसे प्रभावित करते हैं। प्रोटीन स्थिरता के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण अवशेषों को निर्धारित करने के लिए खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में प्रयोग किए गए हैं और कैसे रोग से जुड़े उत्परिवर्तन कोशिका के भीतर प्रोटीन के आधे जीवन को प्रभावित कर सकते हैं। यह जानकारी प्रोटीन फोल्डिंग की जटिलताओं को समझने के लिए मूल्यवान है और कैसे उत्परिवर्तन उन बीमारियों के रोगजनन में योगदान करते हैं जिनसे वे जुड़े हुए हैं। लाभ प्रोटीन स्थिरता का आकलन करने वाली अन्य विधियों के विपरीत साइक्लोहेक्सिमाइड चेज़ परख का उपयोग करने के कई लाभ हैं। साइक्लोहेक्सिमाइड चेज़ का उपयोग विभिन्न प्रकार की मॉडल प्रणालियों के साथ किया जा सकता है और इसे लगभग किसी भी प्रोटीन सब्सट्रेट का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। साइक्लोहेक्सिमाइड अन्य दवाओं की तुलना में अपेक्षाकृत सस्ता यौगिक है और यह कम समय के लिए कम खुराक में उपयोग करने पर प्रभावी होता है। पल्स चेज़ परख साइक्लोहेक्सिमाइड चेज़ परख के लिए एक वैकल्पिक विधि है और इसमें नए अनुवादित प्रोटीन की रेडियोधर्मी लेबलिंग शामिल है जिसके बाद एक समान "पीछा" अवधि होती है। जबकि यह विधि सूचनात्मक है और नवजात प्रोटीन की प्रचुरता को देखने का लाभ प्रदान करती है, इसके लिए आवश्यक रेडियोधर्मी सामग्री कम शेल्फ-लाइफ के साथ महंगी है और साइक्लोहेक्सिमाइड की तुलना में उपयोग करने के लिए अधिक सावधानी की मांग करती है। नुकसान साइक्लोहेक्सिमाइड चेज़ परख आयोजित करने के कुछ नुकसानों में साइक्लोहेक्सिमाइड की विषाक्त प्रकृति शामिल है। जब लंबे समय तक उच्च सांद्रता पर उपयोग किया जाता है, तो साइक्लोहेक्सिमाइड कोशिका के भीतर डीएनए को नुकसान पहुंचाएगा और महत्वपूर्ण कोशिकीय कार्य को बाधित करेगा। इस कारण से, साइक्लोहेक्सिमाइड का पीछा आमतौर पर 12 घंटे से अधिक समय तक नहीं चलता है। यदि विशेष रूप से स्थिर प्रोटीन के कारोबार का अध्ययन किया जा रहा है तो यह एक सीमा प्रस्तुत करता है। इसके अतिरिक्त, साइक्लोहेक्सिमाइड पीछा केवल नए अनुवादित प्रोटीन स्तरों जैसे कि पल्स चेज़ के विपरीत स्थिर स्थिति प्रोटीन स्तरों को देखने की क्षमता प्रदान करता है। इसलिए, केवल प्रोटीन क्षरण देखा जा सकता है न कि प्रोटीन परिपक्वता। संदर्भ प्रयोग आणविक जीवविज्ञान कोशिका जीवविज्ञान प्रोटीन