Ribonucleoprotein Networks Analyzed by Mutational Profiling
रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन नेटवर्क एनलाइज्ड बाय म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग (आरएनपी-एमएपी) न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन पर आरएनए-प्रोटीन नेटवर्क और प्रोटीन बाइंडिंग साइटों की जांच करने की एक रणनीति है। आरएनपी संयोजन और कार्य के बारे में जानकारी जैविक तंत्र की बेहतर समझ की सुविधा प्रदान कर सकती है। आर. एन. पी.-एम. ए. पी. आर. एन. ए.-बद्ध प्रोटीनों को स्थिर करने के लिए एन. एच. एस.-डायज़िरिन (एस. डी. ए.) का उपयोग करता है, जो एक विषम-द्वि-कार्यात्मक क्रॉसलिंकर है। एक बार आर. एन. ए.-प्रोटीन क्रॉस लिंक बनने के बाद, एम. ए. पी. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को प्रोटीन-बाउंड आर. एन. ए. को उलटने के साथ-साथ आर. एन. ए.-प्रोटीन क्रॉस लिंक के स्थान पर उत्परिवर्तन शुरू करने के लिए आयोजित किया जाता है। सी. डी. एन. ए. के अनुक्रमण परिणाम प्रोटीन-आर. एन. ए. अंतःक्रिया नेटवर्क और प्रोटीन बाइंडिंग साइट दोनों के बारे में जानकारी प्रकट करते हैं। रणनीति घटक आर. एन. ए.-एम. ए. पी. में तीन प्रमुख घटक शामिल हैंः रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आर. एन. पी.): आर. एन. ए. और आर. एन. ए.-बाध्यकारी प्रोटीन (आर. बी. पी.) एन. एच. एस.-डायज़िरिन (एस. डी. ए.) से बने परिसरः एक कोशिका पारगम्य क्रॉसलिंकिंग अभिकर्मक। एस. डी. ए. में दो प्रतिक्रियाशील समूह होते हैं-एक डायज़िरिन और एक सुकिनिमिडाइल एस्टर। सुकिनिमिडाइल एस्टर और एमाइन समूहों के बीच प्रतिक्रिया (जैसे। लाइसिन साइड चेन) के परिणामस्वरूप पेप्टाइड बॉन्ड (या एमाइड बॉन्ड) होते हैं। जब 365 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ यूवी प्रकाश के संपर्क में आता है, तो न्यूक्लियोटाइड राइबोसेस और क्षारों की ओर एक मध्यवर्ती व्यापक रूप से प्रतिक्रियाशील बनता है। नतीजतन, एस. डी. ए. लिंकर द्वारा प्रोटीन आर. एन. ए. के साथ क्रॉस-लिंक्ड होते हैं। म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग (एम. ए. पी.): प्रोटीन-आर. एन. ए. बाइंडिंग साइटों पर संशोधित अवशेषों को शामिल करने के लिए आराम से निष्ठा के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट का उपयोग करने वाली एक विधि। कार्यप्रवाह दीर्घ-तरंगदैर्घ्य यू. वी. और एस. डी. ए. अभिकर्मकों की आपूर्ति पहले जीवित कोशिकाओं को आर. एन. ए. के साथ प्रोटीन अवशेषों को जोड़ने के लिए लाइसिन (या आर्जिनिन) अवशेषों और सक्सिनिमिडाइल एस्टर के एमाइन समूहों के बीच एमाइड बंधन बनाकर की जाती है। इसके बाद, क्रॉस-लिंक्ड आरएनपी वाली कोशिकाओं को लाइस्ड किया जाता है और आरएनए-बाउंड प्रोटीन को पेप्टाइड एडक्ट्स में पचाया जाता है। एमएपी रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को फिर पेप्टाइड एडक्ट-प्रेरित उत्परिवर्तन के माध्यम से प्रोटीन-आरएनए बाइंडिंग साइटों को लेबल करने के लिए किया जाता है। उत्परिवर्तन-युक्त सी. डी. एन. ए. उत्पाद का अनुक्रम उत्परिवर्तन स्थलों (या आर. एन. पी.-एम. ए. पी. स्थलों) को प्रकट करेगा और आर. एन. पी.-एम. ए. पी. स्थलों के बीच सहसंबंध 3-न्यूक्लियोटाइड खिड़कियों का उपयोग करके कम्प्यूटेशनल रूप से निर्धारित किए जाते हैं। विश्लेषण आर. एन. पी.-एम. ए. पी. स्थल पहचान आर. एन. पी.-एम. ए. पी. स्थलों को प्रोटीन बद्ध न्यूक्लियोटाइड्स के रूप में परिभाषित किया गया है। एस. डी. ए. और यू. वी. उपचारित और यू. वी. केवल उपचारित नमूना अनुक्रम पढ़ने को संरेखित किया जाता है और उत्परिवर्तन को शेपमैपर2 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गिना जाता है। एक न्यूक्लियोटाइड के लिए एस. डी. ए. या आर. एन. पी.-एम. ए. पी. प्रतिक्रिया क्रासलिंक्ड (एस. डी. ए. और यू. वी. उपचारित) उत्परिवर्तन आवृत्ति और गैर-क्रासलिंक्ड (केवल यू. वी.) उत्परिवर्तन आवृत्ति का अनुपात है। विभेदक उत्परिवर्तन संकेतों का उपयोग करते हुए, आरएनपी-एमएपी स्थलों की पहचान सार्वभौमिक सामान्यीकरण कारकों और ज्ञात संरचना के रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन के विश्लेषण से प्राप्त प्रत्येक आरएनए न्यूक्लियोटाइड (यू, ए, सी और जी) पर सीमा के आधार पर की जाती है। एक न्यूक्लियोटाइड को आरएनपी-एमएपी साइट के रूप में पहचाना जाता है यदि यह तीन फिल्टरों को पार करता हैः एसडीए + यूवी-उपचारित नमूने में उत्परिवर्तन घटनाओं की संख्या यूवी-उपचारित नमूने की तुलना में कम से कम 50 अधिक है। साइट प्रतिक्रियाशीलताओं को न्यूक्लियोटाइड-निर्भर सीमा () से अधिक होना चाहिए जिन्हें अनुभवजन्य रूप से इस प्रकार परिभाषित किया गया हैः जहां न्यूक्लियोटाइड यू, ए, सी, या जी एक> 10 ए समूह में न्यूक्लियोटाइड के 90 प्रतिशत प्रतिक्रियाशीलता मूल्यों द्वारा परिभाषित पृष्ठभूमि सीमा है जो सभी न्यूक्लियोटाइडों के लिए सभी प्रतिक्रियाशीलताओं का मध्यक है जो सभी न्यूक्लियोटाइडों के लिए प्रतिक्रियाशीलता का मानक विचलन है गणना की गई जेड-कारक शून्य से अधिक है गणना की गई जेड-कारक को इस प्रकार परिभाषित किया गया है, जहां एसडीए और यूवी के साथ इलाज किए गए न्यूक्लियोटाइड की उत्परिवर्तन दर है और केवल यूवी के साथ इलाज किए गए न्यूक्लियोटाइड की उत्परिवर्तन दर है, जहां उपचार (एसडीए + यूवी या यूवी केवल) प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन नेटवर्क है। आर. एन. पी.-एम. ए. पी. सहसंबंध आर. एन. पी.-एम. ए. पी. स्थलों से स्वतंत्र आर. एन. ए. के लिए प्रोटीन बंधन का एक पूरक उपाय प्रदान करते हैं। रिंगमैपर के नाम से जाने जाने वाले जी-परीक्षण ढांचे का उपयोग करके उनकी पहचान की जाती है। आर. एन. पी.-एम. ए. पी. सहसंबंधों के लिए कम से कम दो परस्पर संबंध बनाने के लिए एक एकल आर. एन. ए. अणु की आवश्यकता होती है और यह तीन परिदृश्यों में से किसी एक से उत्पन्न होता हैः एक एकल प्रोटीन एक आर. एन. ए. के दो स्थानों से जुड़ता है दो प्रोटीन जो एक आर. एन. ए. पर दो स्थानों पर परस्पर क्रिया करते हैं और जुड़ते हैं दो प्रोटीन एक समन्वित संयोजन प्रक्रिया द्वारा एक आर. एन. ए. पर दो स्थानों पर जमा किए जाते हैं आर. एन. पी.-एम. ए. पी. सहसंबंधों का उपयोग करते हुए, प्रोटीन-आर. एन. ए. परस्पर क्रिया स्थलों का एक नेटवर्क पाया जाता है और फिर कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है। संबंधित विधियाँ क्रॉस-लिंकिंग इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (सी. एल. आई. पी.) सी. एल. आई. पी. यू. वी. क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रेसिपिटेशन को मिलाकर आर. एन. ए. के साथ प्रोटीन अंतःक्रियाओं का विश्लेषण करता है। सी. एल. आई. पी.-आधारित तकनीकें जीनोम-वाइड पैमाने पर रुचि के आर. एन. ए. बाइंडिंग प्रोटीन बाइंडिंग साइटों को मैप करने में सक्षम हैं। सी. एल. आई. पी. आधारित कई विधियां हैं जिनमें शामिल हैंः एच. आई. टी. एस.-सी. एल. आई. पी. (क्रॉसलिंकिंग इम्यूनोप्रेसिपिटेशन या सी. एल. आई. पी.-एस. ई. क्यू. द्वारा पृथक आर. एन. ए. की उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण) पी. ए. आर.-सी. एल. आई. पी. (फोटोएक्टिवेटेबल रिबोन्यूक्लियोसाइड-वर्धित क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रेसिपिटेशन) आई. सी. एल. आई. पी. (इंडिविजुअल न्यूक्लियोटाइड-रिज़ॉल्यूशन क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रेसिपिटेशन) ई. सी. एल. आई. पी. (वर्धित क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के बाद उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण) एस. सी. एल. आई. पी. (सिंपल क्रॉस-लिंकिंग और इम्यूनोप्रेसिपिटेशन) मास स्पेक्ट्रोमेट्री मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एम. एस.) या मात्रा लेबलिंग एमएस विधियों में स्थिर आइसोटोप लेबल का अंतर उपयोग या नमूनों और नियंत्रणों में प्रोटीन की रासायनिक टैगिंग शामिल है। इसका उपयोग लेबल किए गए पेप्टाइड्स के अनुपात के माध्यम से संवर्धन अंक और वास्तविक बाध्यकारी भागीदार प्राप्त करने के लिए किया जाता है। लेबल-मुक्त एमएस विधियाँ नमूनों और नियंत्रणों में प्रोटीन की पहचान करने में सक्षम हैं। गैर-विशिष्ट प्रोटीन के लिए सच्चे बाध्यकारी भागीदारों को अलग करने के लिए, गैर-मात्रात्मक एमएस से वर्णक्रमीय गणना डेटा के साथ उपयोग किए जाने वाले विश्लेषणात्मक उपकरणों का उपयोग एक सच्चे आर. बी. पी.-आर. एन. ए. अंतःक्रिया की संभावना को स्कोर करने के लिए किया जाता है लाभ और सीमाएँ आर. एन. पी.-एम. ए. पी. बाध्यकारी साइट घनत्व और अंतःक्रियाशील प्रोटीन के पिछले ज्ञान से स्वतंत्र अंतःक्रिया के माध्यम से कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण आर. एन. ए.-प्रोटीन बाध्यकारी नेटवर्क को प्रकट करने में मदद कर सकता है। विश्लेषण की निष्पक्ष प्रकृति के कारण, आरएनपी-एमएपी प्रजातियों के बीच संरक्षित आरएनए-प्रोटीन अंतःक्रियाओं का पता लगाने में सक्षम है। आरएनपी-एमएपी बड़े गैर-कोडिंग आरएनए या यहां तक कि वायरल आरएनए में कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण तत्वों के लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करने में भी सक्षम है। सीमाएँ एक स्वतंत्र तकनीक के रूप में, आरएनपी-एमएपी का उपयोग प्रोटीन-आरएनए बंधन तंत्र या प्रोटीन पहचान निर्धारित करने के लिए नहीं किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, आरएनपी-एमएपी का उपयोग अन्य तकनीकों जैसे सीएलआईपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ किया जाना चाहिए। आर. एन. पी.-एम. ए. पी. को विश्लेषण के लिए अत्यधिक उच्च अध्ययन-गहराई की आवश्यकता होती है। आरएनपी-एमएपी साइटों की पहचान करने के लिए, 1000x अनुक्रमण कवरेज की आवश्यकता होती है, जबकि आरएनपी-एमएपी सहसंबंध साइटों को 10,000x अनुक्रमण कवरेज की आवश्यकता होती है। दूर के (> 500 न्यूक्लियोटाइड्स) आरएनपी-एमएपी स्थलों के बीच आरएनपी-एमएपी सहसंबंधों को चिह्नित करने की क्षमता पर गंभीर सीमाएँ हैं। यह एम. ए. पी. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया (500-600 न्यूक्लियोटाइड्स) और अनुक्रमण उपकरण क्लस्टरिंग (<1,000 न्यूक्लियोटाइड्स) की सीमाओं के कारण है। संदर्भ आनुवंशिकी तकनीक आरएनए