Q-FISH
क्वांटिटेटिव फ्लोरोसेंट इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (क्यू-फिश) पारंपरिक फिश पद्धति पर आधारित एक साइटोजेनेटिक तकनीक है। क्यू-फिश में, तकनीक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गुणसूत्र डी. एन. ए. में लक्ष्य अनुक्रमों की मात्रा निर्धारित करने के लिए पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (पी. एन. ए.) ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स नामक लेबल (सी. आई. 3 या एफ. आई. टी. सी.) सिंथेटिक डी. एन. ए. नकल का उपयोग करती है। क्यू-फिश का उपयोग आमतौर पर टेलोमियर की लंबाई का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जो कशेरुकी जीवों में गुणसूत्रों के दूरस्थ छोर पर स्थित दोहराए जाने वाले हेक्सामेरिक अनुक्रम (टी. टी. ए. जी. जी.) होते हैं। डी. एन. ए.-क्षति प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ जीनोम अस्थिरता को रोकने के लिए गुणसूत्र के सिरों पर टेलोमेरेस आवश्यक हैं। आज तक, टेलोमियर अनुसंधान के क्षेत्र में क्यू-फिश विधि का उपयोग किया जा रहा है। पी. एन. ए. और मछली इस तथ्य के कारण कि पी. एन. ए. बैकबोन में कोई आवेशित फॉस्फेट समूह नहीं होते हैं, पी. एन. ए. और डी. एन. ए. के बीच बंधन डी. एन. ए./डी. एन. ए. या डी. एन. ए./आर. एन. ए. डुप्लेक्स की तुलना में अधिक मजबूत होता है। क्यू-फिश पी. एन. ए. की इस अनूठी विशेषता का उपयोग करता है जहां कम आयनिक ताकत पर, पी. एन. ए. पूरक एकल-फंसे हुए डी. एन. ए. अनुक्रमों को प्रभावित कर सकते हैं जबकि एकल-फंसे हुए डी. एन. ए. नहीं कर सकते हैं। उन स्थितियों का उपयोग करके जो केवल लेबल (सी. सी. सी. टी. ए. ए.) 3 पी. एन. ए. को (टी. टी. ए. जी. जी.) एन लक्ष्य अनुक्रमों में संकरण की अनुमति देते हैं, क्यू-फिश पी. एन. ए. के संकरण को टेलोमेरिक अनुक्रमों में निर्धारित करने में सक्षम है। संवर्धित कोशिकाओं के लिए सामान्य विधि/प्रोटोकॉल मेटाफ़ेज़-गिरफ्तार कोशिकाओं को तैयार करें संवर्धित कोशिकाओं की कटाई से कई घंटे पहले, कोलसेमिड को संवर्धन माध्यम में जोड़ा जाता है। कोलेस्मिड माइटोटिक कोशिकाओं में सूक्ष्म नलिकाओं को बाधित करके मेटाफ़ेज़ अवस्था में कोशिकाओं को रोकने का कार्य करता है। कोशिकाओं को फिर ट्रिप्सिनीकृत किया जाता है और एक हाइपोटोनिक बफर में फिर से निलंबित किया जाता है। यह एकत्रित कोशिकाओं को फूलेगा और गुणसूत्रों को फैलाएगा। कोशिकाओं को ठीक करें हाइपोटोनिक घोल को फिर अपकर्षण द्वारा हटा दिया जाता है और एक मेथनॉल/ग्लेशियल एसिटिक एसिड फिक्सेटिव में फिर से निलंबित कर दिया जाता है। स्लाइड तैयार करें कोशिका निलंबन की कुछ बूंदों को सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर रखें और रात भर हवा को सूखने दें। अगले दिन, स्लाइड को कई मिनटों के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पी. बी. एस.) में डुबो दें। स्लाइडों को फॉर्मेल्डिहाइड में ठीक करें स्लाइडों को 4 प्रतिशत फॉर्मेल्डिहाइड घोल में स्थानांतरित करें और कई मिनटों के लिए ठीक करें। पी. बी. एस. से स्लाइडों को कई बार धोएँ। पेप्सिन स्लाइडों के साथ उपचारित स्लाइडों को फिर पेप्सिन घोल में स्थानांतरित किया जाता है। पेप्सिन एक प्रोटीज है और प्रोटीन को पेप्टाइड्स में पचाने का काम करता है। हाइब्रिडाइज पी. एन. ए. प्रोब (सी. आई. 3 या एफ. आई. टी. सी. लेबल पी. एन. ए.) हाइब्रिडाइजेशन मिश्रण की एक छोटी मात्रा को एक कवरस्लिप पर रखा जाता है और फिर धीरे-धीरे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखा जाता है जिसमें स्थिर कोशिकाएं होती हैं। गर्मी विकृती डीएनए स्लाइड को फिर एक पहले से गर्म ओवन में रखा जाता है जहां कोशिका में गुणसूत्र डीएनए को कई मिनटों के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकृत किया जाता है। स्लाइड को फिर कमरे के तापमान पर कई घंटों के लिए छोड़ दिया जाता है ताकि पी. एन. ए. को पूरक डी. एन. ए. में संकरण की अनुमति मिल सके। अनबाउंड पी. एन. ए. को हटाने के लिए वॉश स्लाइड और काउंटरस्टेन डी. एन. ए. (डी. ए. पी. आई. या पी. आई.) स्लाइड को फिर अनबाउंड पी. एन. ए. को हटाने के लिए विभिन्न वॉश समाधानों में सावधानीपूर्वक धोया जाता है। माइक्रोस्कोप माउंटिंग मीडियम को फिर कोशिकाओं पर रखा जाता है। इस माध्यम में आम तौर पर डी. ए. पी. आई. (एक डी. एन. ए. काउंटरस्टेन) और पी. एन. ए. प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने और फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए एक एंटीफेड समाधान होता है। प्रयोगात्मक नमूनों की छवि बनाने से पहले, कैमरे और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की उचित व्यवस्था सुनिश्चित करने के लिए फ्लोरोसेंट संदर्भ मोतियों की छवि बनाई जाती है। इसके अलावा, इन संदर्भ मोतियों को प्रत्येक अधिग्रहण सत्र से पहले चित्रित किया जाएगा। यह सुनिश्चित करेगा कि नमूनों के बीच अंतर दीपक या कैमरे में त्रुटियों के कारण नहीं है। एक मेटाफ़ेज़ सेल को मैन्युअल रूप से चुना जाता है और कैमरे के लिए केंद्रित किया जाता है। दो प्रकार की छवियाँ ली जाती हैंः दागदार गुणसूत्रों की उनकी मेटाफ़ेज़ अवस्था में तस्वीरें और टेलोमेरेस की फ्लोरोसेंट छवियाँ। फिर दोनों छवियों को एक संयुक्त छवि उत्पन्न करने के लिए अधिरोपित किया जा सकता है। इस छवि को तब कार्योटाइप या निर्दिष्ट नामकरण किया जा सकता है। इसके अलावा, पी-आर्म्स बनाम क्यू-आर्म्स में टेलोमियर की लंबाई के अंतर-गुणसूत्र वितरण को मापा जा सकता है। विभिन्न प्रयोगों के आंकड़ों का उपयोग प्रतिदीप्ति की तीव्रता को सामान्य करने के लिए किया जा सकता है, जबकि ज्ञात संख्या में टेलोमेरिक पुनरावृत्तियों वाले प्लास्मिड का उपयोग टेलोमेरे प्रतिदीप्ति और टेलोमेरे की लंबाई को संबंधित करने में मदद करने के लिए मानकों के रूप में किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट संदर्भ मोतियों के अलावा, बहन क्रोमैटिड्स से संकेत शक्ति बराबर होनी चाहिए और इसलिए डेटा की सटीकता का आकलन करने के लिए एक अन्य नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है। अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि छवियाँ संतृप्त न हों। यदि प्रतिदीप्ति की तीव्रता संतृप्ति तक पहुँच जाती है, तो टेलोमियर की लंबाई को कम करके आंका जाता है। क्यू-फिश छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर फ्लिंटबॉक्स नेटवर्क से मुफ्त में उपलब्ध है। टेलोमेरे की लंबाई के वितरण और इसे विभिन्न बीमारियों से जोड़ने के बारे में जानकारी की मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुप्रयोगों और महत्व क्यू-फिश का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। इस संदर्भ में, क्यू-फिश विशेष रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह गंभीर रूप से छोटे टेलोमेरेस का पता लगाने और उनकी मात्रा निर्धारित करने में सक्षम है। यह दिखाया गया है कि यह औसत टेलोमियर लंबाई के बजाय इन गंभीर रूप से छोटे टेलोमियर की आवृत्ति है, जो टेलोमियर शिथिलता में महत्वपूर्ण है। जबकि क्यू-फिश टेलोमियर की लंबाई के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करता है, इसकी प्रासंगिकता को क्यू-फिश को अन्य मछली से संबंधित तकनीकों, जैसे फ्लो-फिश के साथ जोड़कर बढ़ाया जा सकता है। फ्लो-फिश में, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग क्यू-फिश में केवल मुट्ठी भर कोशिकाओं के बजाय कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में प्रतिदीप्ति तीव्रता (और इस प्रकार टेलोमियर की लंबाई) को मापने के लिए किया जाता है। इसके विपरीत, क्यू-फिश के विपरीत, फ्लो-फिश एक अलग कोशिका के भीतर एक विशेष गुणसूत्र में टेलोमियर की लंबाई निर्धारित करने में असमर्थ है। हालांकि, हालांकि क्यू-फिश को आम तौर पर कम-थ्रूपुट माना जाता है और जनसंख्या अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं माना जाता है, समूहों ने उच्च-थ्रूपुट (एचटी) क्यू-फिश प्रोटोकॉल विकसित किए हैं जो 96 वेल प्लेटों में इंटरफ़ेज़ नाभिक पर क्यू-फिश करने के लिए स्वचालित मशीनरी का उपयोग करते हैं। इसी तरह, मल्टीप्लेक्स-फिश और सेनएम-फिश जैसी अन्य विधियां विकसित की गई हैं जिनका उपयोग क्यू-फिश के साथ भी किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स-फिश विभिन्न रंगों में 24 गुणसूत्रों की कल्पना करने और अंतर-या अंतर-गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था की पहचान करने के लिए विभिन्न प्रकार की जांच का उपयोग करता है। सेंट्रोमियर-विशिष्ट बहु-रंगीन मछली (सी. एन. एम.-फिश) मल्टीप्लेक्स-फिश से बहु-रंगीन जांच के साथ-साथ सेंट्रोमियर विशिष्ट लेबल वाले जांच का उपयोग सेंट्रोमियर क्षेत्रों की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए करती है। सेंट्रोमियर असामान्यताओं या गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था और टेलोमियर की लंबाई के बीच संबंध का उच्च नैदानिक प्रभाव हो सकता है, क्योंकि सभी प्रसव से पहले या बाद के निदान और ट्यूमर के विकास में महत्वपूर्ण दिखाई देते हैं। ये प्रयोग टेलोमेरेस की भूमिका और टेलोमेरे की लंबाई के महत्व के बारे में अधिक ज्ञान प्रदान कर सकते हैं। क्यू-फिश का एक अन्य अनुप्रयोग टेलोमेरिक संलयन का पता लगाना है, जहां गुणसूत्रों के सिरों को टेलोमेरे में एक साथ जोड़ा गया है, जिन्हें कभी-कभी इंटरस्टिशियल (गुणसूत्र के भीतर) टेलोमेरिक अनुक्रम (आईटीएस) कहा जाता है। टेलोमेरिक संलयन का अध्ययन कभी-कभी विकास के मार्ग को दिखा सकता है। उदाहरण के लिए, एक मानव गुणसूत्र में एक आई. टी. एस. होता है जिसे चिंपांज़ी में दो गुणसूत्रों के बराबर माना जाता है जो एक साथ जुड़े हुए हैं। विभिन्न प्रजातियों में टेलोमेरे की लंबाई के विनियमन का अवलोकन करने से कार्योटाइप के विकास और मानव बीमारियों के लिए प्रासंगिकता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी भी मिलती है। एक अन्य उदाहरण में, नॉन-होमोलॉगस एंड जॉइनिंग (एन. एच. ई. जे.) प्रोटीन डबल-स्ट्रैंडेड डी. एन. ए. टूटने की मरम्मत करता है और कार्य करने के लिए के. यू. 70/के. यू. 80 हेटेरोडाइमर पर निर्भर करता है। इन प्रोटीनों को बाधित करने से टेलोमेरिक छोटा हो जाता है, जिसे मछली के साथ टेलोमेरे की लंबाई को मापकर देखा जा सकता है। उदाहरण के लिए, केयू 80 जीन की कमी वाले चूहों में, टेलोमेरे की लंबाई को क्यूफिश द्वारा मापा जाता है और इन्हें काफी छोटा देखा जाता है। क्यू-फिश का उपयोग आमतौर पर कैंसर अनुसंधान में कैंसर और गैर-कैंसर कोशिकाओं के बीच टेलोमियर की लंबाई में अंतर को मापने के लिए किया जाता है। टेलोमेरे का छोटा होना जीनोमिक अस्थिरता का कारण बनता है और प्राकृतिक रूप से बढ़ती उम्र के साथ होता है, दोनों कारक जो कैंसर के संभावित कारणों से संबंधित हैं। क्यू-फिश के लाभ अन्य मछली तकनीकों की तुलना में क्यू-फिश का सबसे बड़ा लाभ तकनीक की मात्रात्मक क्षमता है। डी. एन. ए. जांच का उपयोग करने वाले पारंपरिक फिश की तुलना में, मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करना मुश्किल है क्योंकि संकरण जांच पूरक जीनोमिक डी. एन. ए. तारों के पुनर्जनन के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं। इसलिए, पी. एन. ए. का उपयोग करके और बहुत सख्त परिस्थितियों में उनका संकरण करके, यह इस समस्या को दूर करने की अनुमति देता है। इसी तरह, क्योंकि कोई पी. एन. ए. जांच की उपस्थिति में गुणसूत्र डी. एन. ए. को विकृत करने में सक्षम है, यह मछली प्रक्रिया को सरल बनाता है। इसके अलावा, विधि अधिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती है, जिससे उपयोगकर्ता को एक विशेष कोशिका में प्रत्येक व्यक्तिगत गुणसूत्र (पी या क्यू आर्म) की टेलोमियर लंबाई की जांच करने की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, दक्षिणी धब्बों के विपरीत, जिन्हें धब्बों के लिए 105 से अधिक कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, क्यू-फिश में 30 से कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। क्यू-फिश की कमियां इसके फायदों के बावजूद, क्यू-फिश काफी श्रम-गहन है और आम तौर पर उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है। तकनीक अच्छी तरह से तैयार मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं पर निर्भर करती है और यह महत्वपूर्ण है कि परिमाणीकरण सटीक होने के लिए उपकरण और नमूनों को सही ढंग से समायोजित/सामान्यीकृत किया जाए। इसके अलावा, जबकि केवल एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, एक बार में मेटाफ़ेज़ में पर्याप्त संख्या प्राप्त करना मुश्किल होता है। इसके अलावा, खराब गुणसूत्र आकृति विज्ञान तैयारी के दौरान उच्च तापमान के अत्यधिक संपर्क के परिणामस्वरूप हो सकता है। इसी तरह, यदि कोई विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग कर रहा है, तो क्यू-फिश में कई चरणों (जैसे कि कोलसेमिड उपचार की लंबाई) के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में एक आम समस्या फोटोब्लीचिंग है, जहां प्रकाश के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप फ्लोरोफोर अपनी गतिविधि खो देता है। इससे प्रतिदीप्ति तीव्रता का गलत मापन हो सकता है। फोटोब्लीचिंग, प्रकाश स्रोत स्थिरता और प्रणाली परिवर्तनशीलता सभी त्रुटि के स्रोत हैं लेकिन यदि उपयोगकर्ता नमूनों के बीच अधिग्रहण समय को कम करने और उचित नियंत्रणों को शामिल करने में सक्षम है तो इसे कम किया जा सकता है। शास्त्रीय तकनीक क्यू-फिश और पी. एन. ए. के विकास से पहले, टेलोमेरे की लंबाई को मापने के लिए शास्त्रीय तकनीक दक्षिणी धब्बों का उपयोग था। इस विधि में, जीनोमिक डी. एन. ए. को प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके पचाया जाता है और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जाता है। फिर डी. एन. ए. को एक झिल्ली पर स्थानांतरित किया जाता है और रेडियोधर्मी या फ्लोरोसेंट टेलोमेरिक डी. एन. ए. जांच का उपयोग करके संकरित किया जाता है। हालांकि, यह विधि केवल एक कोशिका आबादी में औसत टेलोमियर की लंबाई का मूल्यांकन करने में सक्षम है और जीनोम में अंतरालीय टेलोमेरिक अनुक्रमों की उपस्थिति गलत माप प्राप्त कर सकती है। क्यू-फिश फ्लो-फिश के परिवर्तन क्यू-फिश के समान, फ्लो-फिश क्यू-फिश का एक अनुकूलन है जो फ्लो साइटोमेट्री के साथ पी. एन. ए. के उपयोग को जोड़ता है। इस विधि में, फ्लो-फिश मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों के बजाय इंटरफ़ेज़ कोशिकाओं का उपयोग करता है और निलंबन में पी. एन. ए. जांच को संकरित करता है। संकरण के बाद, अपेक्षाकृत कम समय में फ्लो साइटोमीटर पर हजारों कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि, फ्लो-फिश प्रत्येक कोशिका के लिए केवल एक औसत टेलोमेरिक लंबाई प्रदान करता है जबकि क्यू-फिश एक व्यक्तिगत गुणसूत्र की टेलोमियर लंबाई का विश्लेषण करने में सक्षम है। पी. एन. ए.-फिश यद्यपि क्यू-फिश की मात्रात्मक क्षमता का उपयोग आमतौर पर टेलोमियर अनुसंधान में किया जाता है, अन्य क्षेत्र जिनमें केवल गुणात्मक डेटा की आवश्यकता होती है, उन्होंने अनुसंधान और नैदानिक दोनों उद्देश्यों के लिए फिश के साथ पी. एन. ए. के उपयोग को अपनाया है। चिकित्सालय के भीतर तेजी से संक्रामक रोगों की पहचान और निदान के लिए पी. एन. ए.-फिश परख विकसित किए गए हैं। पॉजिटिव ब्लड कल्चर के पारंपरिक ग्राम स्टेनिंग के साथ, पी. एन. ए. का उपयोग बैक्टीरिया या खमीर के विभिन्न उपभेदों की पहचान करने के लिए प्रजाति-विशिष्ट आर. आर. एन. ए. (राइबोसोमल आर. एन. ए.) को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। चूँकि परीक्षण अपेक्षाकृत जल्दी किया जा सकता है, इसलिए परीक्षण को उन अस्पतालों में उपयोग करने पर विचार किया जा रहा है जहाँ अस्पताल से प्राप्त संक्रमण हो सकते हैं। सी. ओ.-फिश (गुणसूत्र अभिविन्यास-फिश) पी. एन. ए. और फिश का उपयोग करने वाले एक अन्य अनुकूलन को सी. ओ.-फिश (गुणसूत्र अभिविन्यास-फिश) के रूप में जाना जाता है जो पी. एन. ए. के साथ गुणसूत्रों की लेबलिंग के लिए एक विशिष्ट तरीके से अनुमति देता है। इस विधि में डी. एन. ए. के नए प्रतिकृति वाले तारों (बी. आर. डी. यू. निगमन के उपयोग के माध्यम से) को चुनिंदा रूप से हटाना शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप केवल एकल फंसे हुए लक्ष्य डी. एन. ए. होते हैं। विभिन्न रंगीन एकदिशीय पी. एन. ए. जांचों का उपयोग करके, बहन क्रोमैटिड्स को विशिष्ट रूप से लेबल करना संभव हो जाता है। संदर्भ साइटोजेनेटिक्स