Super-resolution microscopy
सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी में तकनीकों की एक श्रृंखला है जो ऐसी छवियों को विवर्तन सीमा द्वारा लगाए गए रिज़ॉल्यूशन से अधिक रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देती है, जो प्रकाश के विवर्तन के कारण होती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीक निकट-क्षेत्र (फोटॉन-टनलिंग माइक्रोस्कोपी के साथ-साथ वे जो पेंड्री सुपरलेन्स और निकट क्षेत्र स्कैनिंग ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं) या दूर-क्षेत्र पर निर्भर करती हैं। उन तकनीकों में से जो उत्तरार्द्ध पर निर्भर करती हैं, वे हैं जो विवर्तन-सीमा से परे केवल मामूली रूप से (लगभग दो के कारक तक) संकल्प में सुधार करती हैं, जैसे कि बंद पिनहोल के साथ कॉन्फ़ोकल माइक्रोस्कोपी या संगणकीय तरीकों जैसे कि डीकॉन्वोल्यूशन या डिटेक्टर-आधारित पिक्सेल पुनर्वितरण (जैसे। पुनः स्कैन सूक्ष्मदर्शी, पिक्सेल पुनर्निर्धारण), 4पीआई सूक्ष्मदर्शी, और सिम और एसएमआई जैसी संरचित-प्रदीपन सूक्ष्मदर्शी प्रौद्योगिकियां। सुदूर क्षेत्र में सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए विधियों के दो प्रमुख समूह हैं जो एक बहुत बड़े कारक द्वारा रिज़ॉल्यूशन में सुधार कर सकते हैंः निर्धारक सुपर-रिज़ॉल्यूशनः जैविक माइक्रोस्कोपी, फ्लोरोफोर्स में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले उत्सर्जक, उत्तेजना के लिए एक अरैखिक प्रतिक्रिया दिखाते हैं, जिसका उपयोग रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। इस तरह के तरीकों में एस. टी. ई. डी., जी. एस. डी., आर. ई. एस. ओ. एल. एफ. टी. और एस. एस. आई. एम शामिल हैं। स्टोकेस्टिक सुपर-रिज़ॉल्यूशनः कई आणविक प्रकाश स्रोतों की रासायनिक जटिलता उन्हें एक जटिल अस्थायी व्यवहार देती है, जिसका उपयोग कई आस-पास के फ्लोरोफोर को अलग-अलग समय पर प्रकाश उत्सर्जित करने के लिए किया जा सकता है और इस तरह समय पर हल किया जा सकता है। इन विधियों में सुपर-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल फ्लक्चुएशन इमेजिंग (एस. ओ. एफ. आई.) और सभी एकल-अणु स्थानीयकरण विधियां (एस. एम. एल. एम.) शामिल हैं, जैसे कि एस. पी. डी. एम., एस. पी. डी. एम. फाइमोड, पी. ए. एल. एम., एफ. पी. ए. एल. एम., एस. टी. ओ. आर. एम. और डी. एस. टी. ओ. आर. एम। 8 अक्टूबर 2014 को रसायन विज्ञान में नोबेल पुरस्कार डब्ल्यू. ई. एरिक बेटजिग को प्रदान किया गया था। मोएर्नर और स्टीफन हेल "सुपर-रिज़ॉल्व्ड फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी के विकास" के लिए, जो "नैनोडाइमेंशन में ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी" लाता है। बायोमेडिकल अनुसंधान समुदाय द्वारा सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के विभिन्न तरीकों को तेजी से अपनाया जा रहा है, और ये तकनीकें आणविक स्तर पर जैविक कार्य को समझने के लिए अपरिहार्य उपकरण बन रही हैं। 1978 तक, अब्बे सीमा को तोड़ने के लिए पहले सैद्धांतिक विचारों को विकसित किया गया था, जिसमें 4पीआई सूक्ष्मदर्शी का उपयोग एक कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के रूप में करने का आह्वान किया गया था, जहां प्रकाश सभी तरफ से एक सामान्य फोकस पर केंद्रित होता है जिसका उपयोग 'बिंदु-दर-बिंदु' उत्तेजना द्वारा वस्तु को स्कैन करने के लिए किया जाता है। हालाँकि 1978 के प्रकाशन ने एक अनुचित भौतिक निष्कर्ष निकाला था (अर्थात। प्रकाश का एक बिंदु जैसा स्थान) और ठोस कोण के दूसरे पक्ष को जोड़ने के वास्तविक लाभ के रूप में अक्षीय संकल्प वृद्धि से पूरी तरह चूक गया था। निम्नलिखित में से कुछ जानकारी एक रसायन विज्ञान ब्लॉग की उप-विवर्तन सूक्ष्मदर्शी तकनीकों की समीक्षा से (अनुमति के साथ) एकत्र की गई थी। 1986 में, उत्तेजित उत्सर्जन पर आधारित एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप को ओखोनिन द्वारा पेटेंट कराया गया था। सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकें फोटॉन टनलिंग माइक्रोस्कोपी (पी. टी. एम.) स्थानीय वृद्धि/ए. एन. एस. ओ. एम./ऑप्टिकल नैनो-एंटीनास नियर-फील्ड ऑप्टिकल रैंडम मैपिंग (एन. ओ. आर. एम.) माइक्रोस्कोपी नियर-फील्ड ऑप्टिकल रैंडम मैपिंग (एन. ओ. आर. एम.) माइक्रोस्कोपी एक विसर्जन तरल में नैनोकणों की ब्राउनियन गति के अवलोकन के माध्यम से दूर-क्षेत्र माइक्रोस्कोप द्वारा ऑप्टिकल नियर-फील्ड अधिग्रहण की एक विधि है। एन. ओ. आर. एम. यादृच्छिक रूप से गतिशील नैनोकणों द्वारा वस्तु सतह स्कैनिंग का उपयोग करता है। सूक्ष्मदर्शी के माध्यम से, नैनोकण सममित गोल धब्बों की तरह दिखते हैं। धब्बे की चौड़ाई बिंदु प्रसार फलन (~ 250 एनएम) के बराबर है और इसे सूक्ष्मदर्शी संकल्प द्वारा परिभाषित किया जाता है। दिए गए कण के पार्श्व निर्देशांक का मूल्यांकन सूक्ष्मदर्शी के संकल्प की तुलना में बहुत अधिक सटीकता के साथ किया जा सकता है। कई फ्रेमों से जानकारी एकत्र करके सूक्ष्मदर्शी के दृश्य के पूरे क्षेत्र में निकट क्षेत्र तीव्रता वितरण का मानचित्रण किया जा सकता है। एन. एस. ओ. एम. और ए. एन. एस. ओ. एम. की तुलना में इस विधि में नोक की स्थिति के लिए किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है और इसमें देखने का एक बड़ा क्षेत्र और फोकस की गहराई होती है। बड़ी संख्या में स्कैनिंग "सेंसर" के कारण कोई भी कम समय में छवि अधिग्रहण प्राप्त कर सकता है। 4पीआई ए 4पीआई सूक्ष्मदर्शी एक बेहतर अक्षीय संकल्प के साथ एक लेजर-स्कैनिंग प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी है। 500-700 nm के विशिष्ट मान को 100-150 nm तक बढ़ाया जा सकता है, जो मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में 5-7 गुना कम आयतन के साथ लगभग गोलाकार फोकल स्पॉट से मेल खाता है। संकल्प में सुधार दो विरोधी वस्तुनिष्ठ लेंसों का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जो दोनों एक ही ज्यामितीय स्थान पर केंद्रित होते हैं। इसके अलावा, दो वस्तुनिष्ठ लेंसों में से प्रत्येक के माध्यम से ऑप्टिकल पथ की लंबाई में अंतर को सावधानीपूर्वक कम किया जाता है। इससे, दोनों उद्देश्यों के सामान्य केंद्र क्षेत्र में रहने वाले अणुओं को दोनों तरफ से सुसंगत रूप से प्रकाशित किया जा सकता है, और परावर्तित या उत्सर्जित प्रकाश को सुसंगत रूप से एकत्र किया जा सकता है, अर्थात। डिटेक्टर पर उत्सर्जित प्रकाश का सुसंगत सुपरपोजिशन संभव है। रोशनी और पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले ठोस कोण को बढ़ाया जाता है और आदर्श मामले तक पहुँच जाता है, जहाँ नमूने को प्रकाशित किया जाता है और सभी तरफ से एक साथ पता लगाया जाता है। अब तक, 4पीआई सूक्ष्मदर्शी में सबसे अच्छी गुणवत्ता स्थिर कोशिकाओं में एस. टी. ई. डी. सूक्ष्मदर्शी और जीवित कोशिकाओं में परिवर्तनशील प्रोटीन के साथ आर. ई. एस. ओ. एल. एफ. टी. सूक्ष्मदर्शी के संयोजन में प्राप्त की गई है। स्ट्रक्चर्ड इल्यूमिनेशन माइक्रोस्कोपी (सिम) स्ट्रक्चर्ड इल्यूमिनेशन माइक्रोस्कोपी (सिम) अवलोकन योग्य क्षेत्र के बाहर आवृत्ति स्थान से जानकारी एकत्र करके स्थानिक संकल्प को बढ़ाती है। यह प्रक्रिया पारस्परिक स्थान में की जाती हैः एक एस. आई. छवि के फूरियर परिवर्तन (एफ. टी.) में पारस्परिक स्थान के विभिन्न क्षेत्रों से अधिरोपित अतिरिक्त जानकारी होती है; कई फ्रेमों के साथ जहां रोशनी को कुछ चरण द्वारा स्थानांतरित किया जाता है, एफ. टी. छवि को कम्प्यूटेशनल रूप से अलग करना और पुनर्निर्माण करना संभव है, जिसमें बहुत अधिक रिज़ॉल्यूशन जानकारी होती है। रिवर्स एफ. टी. पुनर्निर्मित छवि को एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि में लौटाता है। सिम माइक्रोस्कोपी संभावित रूप से कुछ चिकित्सा निदान के लिए एक उपकरण के रूप में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की जगह ले सकती है। इनमें गुर्दे के विकार, गुर्दे के कैंसर और रक्त रोगों का निदान शामिल है। हालांकि "संरचित रोशनी सूक्ष्मदर्शी" शब्द बाद के वर्षों में दूसरों द्वारा गढ़ा गया था, गुएरा (1995) ने पहली बार परिणाम प्रकाशित किए जिसमें 50 एनएम पिच ग्रेटिंग द्वारा पैटर्न किए गए प्रकाश ने पिच 50 एनएम के दूसरे ग्रेटिंग को प्रकाशित किया, जिसमें ग्रेटिंग को आवर्धन प्राप्त करने के लिए आवश्यक कोणीय मात्रा द्वारा एक दूसरे के संबंध में घुमाया गया था। यद्यपि प्रज्ज्वलित तरंगदैर्ध्य 650 एनएम था, 50 एनएम ग्रेटिंग को आसानी से हल किया गया था। इसने 232 एनएम की अबे रिज़ॉल्यूशन सीमा की तुलना में लगभग 5 गुना सुधार दिखाया जो संख्यात्मक छिद्र और तरंग दैर्ध्य के लिए प्राप्त सबसे छोटा होना चाहिए था। इस काम के आगे के विकास में, गुएरा ने दिखाया कि अति-हल पार्श्व स्थलाकृति अवक्रमित क्षेत्र को चरण-परिवर्तन द्वारा प्राप्त की जाती है। कई अमेरिकी पेटेंट गुएर्रा को व्यक्तिगत रूप से, या सहयोगियों के साथ जारी किए गए थे, और पोलरॉइड कॉर्पोरेशन को सौंपे गए थे। ऑप्टिकल डेटा भंडारण और सूक्ष्मदर्शी में इस सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक के उपयोग के लिए डायर एनर्जी सिस्टम्स, कैलिमेट्रिक्स इंक. और नैनोप्टेक कॉर्प द्वारा इस तकनीक के लिए लाइसेंस प्राप्त किए गए थे। स्थानिक रूप से मॉड्यूलेटेड रोशनी (एस. एम. आई.) संरचित रोशनी के एक कार्यान्वयन को स्थानिक रूप से मॉड्यूलेटेड रोशनी (एस. एम. आई.) के रूप में जाना जाता है। मानक संरचित रोशनी की तरह, एस. एम. आई. तकनीक सूक्ष्मदर्शी के बिंदु प्रसार कार्य (पी. एस. एफ.) को उपयुक्त तरीके से संशोधित करती है। हालाँकि, इस मामले में, "ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन स्वयं उन्नत नहीं है"; इसके बजाय संरचित रोशनी का उपयोग फ्लोरोसेंट वस्तुओं की दूरी माप की सटीकता को अधिकतम करने के लिए किया जाता है, ताकि "कुछ दसियों नैनोमीटर के आणविक आयामों पर आकार माप को सक्षम किया जा सके।" वर्टिको एस. एम. आई. सूक्ष्मदर्शी अक्ष के साथ एक या दो विरोधी हस्तक्षेप करने वाले लेजर किरणों का उपयोग करके संरचित रोशनी प्राप्त करता है। छवि बनाई जा रही वस्तु को फिर तरंग क्षेत्र के माध्यम से उच्च-परिशुद्धता वाले चरणों में स्थानांतरित किया जाता है, या तरंग क्षेत्र को चरण परिवर्तन द्वारा वस्तु के सापेक्ष स्थानांतरित किया जाता है। इसके परिणामस्वरूप अक्षीय आकार और दूरी संकल्प में सुधार होता है। एस. एम. आई. को अन्य सुपर रिज़ॉल्यूशन प्रौद्योगिकियों के साथ जोड़ा जा सकता है, उदाहरण के लिए 3डी लाइमन या एल. एस. आई.-टी. आई. आर. एफ. के साथ पार्श्व रूप से संरचित रोशनी के साथ कुल आंतरिक प्रतिबिंब इंटरफेरोमीटर के रूप में (यह अंतिम उपकरण और तकनीक अनिवार्य रूप से एक चरण-स्थानांतरित फोटॉन टनलिंग माइक्रोस्कोप है, जो चरण-स्थानांतरित इवानेसेंट क्षेत्र (गुएरा, 1996) के साथ कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रकाश माइक्रोस्कोप को नियोजित करता है। यह एस. एम. आई. तकनीक पहले से बेजोड़ ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन के साथ मानव नेत्र ऊतक के वर्गों में ऑटोफ्लोरोफोर वितरण की प्रकाश-ऑप्टिकल छवियों को प्राप्त करने की अनुमति देती है। तीन अलग-अलग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (488,568 और 647 एनएम) का उपयोग ऑटोफ्लोरेसेंस संकेत के बारे में वर्णक्रमीय जानकारी एकत्र करने में सक्षम बनाता है। इसका उपयोग मैकुलर डिजनरेशन से प्रभावित मानव नेत्र ऊतक की जांच करने के लिए किया गया है। निर्धारक कार्यात्मक तकनीक रिवर्सिबल सैचुरेबल ऑप्टिकल फ्लोरोसेंस ट्रांजिशन (आरईएसओएलएफटी) माइक्रोस्कोपी बहुत उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी है जो उन नमूनों में विवरण की छवि ले सकती है जिन्हें पारंपरिक या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ चित्रित नहीं किया जा सकता है। आर. ई. एस. ओ. एल. एफ. टी. के भीतर एस. टी. ई. डी. सूक्ष्मदर्शी और जी. एस. डी. सूक्ष्मदर्शी के सिद्धांतों को सामान्यीकृत किया जाता है। इसके अलावा, आरईएसओएलएफटी या एसएसआईएम के अलावा अन्य अवधारणाओं के साथ तकनीकें हैं। उदाहरण के लिए, नाइट्रोजन-रिक्तता केंद्र के ऑप्टिकल और गेट गुण का उपयोग करके प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, या थर्मल विकिरण के उत्तेजित उत्सर्जन (एस. ई. टी. आर.) द्वारा अति-रिज़ॉल्यूशन, जो ब्लैक-बॉडी विकिरण की आंतरिक अति-रैखिकताओं का उपयोग करता है और सूक्ष्मदर्शी से परे अति-रिज़ॉल्यूशन की अवधारणा का विस्तार करता है। स्टिमुलेटेड एमिशन डिप्लीशन (एस. टी. ई. डी.) स्टिमुलेटेड एमिशन डिप्लीशन माइक्रोस्कोपी (एस. टी. ई. डी.) में दो लेजर पल्स का उपयोग किया जाता है, फ्लोरोफोर्स की उनकी फ्लोरोसेंट स्थिति में उत्तेजना के लिए उत्तेजना पल्स और उत्तेजित उत्सर्जन के माध्यम से फ्लोरोफोर्स के डी-उत्तेजना के लिए एस. टी. ई. पल्स। व्यवहार में, उत्तेजना लेजर पल्स को पहले लागू किया जाता है जिसके बाद जल्द ही एक एस. टी. ई. डी. पल्स आती है (निरंतर तरंग लेजर का उपयोग करके बिना पल्स के एस. टी. ई. डी. का भी उपयोग किया जाता है)। इसके अलावा, एस. टी. ई. डी. पल्स को इस तरह से संशोधित किया जाता है ताकि इसमें एक शून्य-तीव्रता वाला स्थान हो जो उत्तेजना केंद्र स्थान के साथ मेल खाता हो। एस. टी. ई. डी. किरण की तीव्रता पर उत्तेजित उत्सर्जन दर की गैर-रैखिक निर्भरता के कारण, फोकल उत्तेजना स्थान के आसपास के सभी फ्लोरोफोर अपनी बंद स्थिति (फ्लोरोफोर की जमीनी स्थिति) में होंगे। इस केंद्र स्थान को स्कैन करके, छवि को पुनः प्राप्त किया जाता है। समीकरण () के अनुसार, उत्तेजना केंद्र स्थान के बिंदु प्रसार फलन (पी. एस. एफ.) की आधी अधिकतम (एफ. डब्ल्यू. एच. एम.) पर पूर्ण चौड़ाई को सैद्धांतिक रूप से एस. टी. ई. डी. पल्स की तीव्रता को बढ़ाकर एक मनमाना चौड़ाई तक संपीड़ित किया जा सकता है। () जहाँ  मुंद्रा पार्श्व संकल्प है,  मुंद्रा सीमित पी. एस. एफ. का एफ. डब्ल्यू. एच. एम है, आईमैक्स एस. टी. ई. डी. लेजर की चरम तीव्रता है, और संतृप्त उत्सर्जन ह्रास प्राप्त करने के लिए आवश्यक सीमा तीव्रता है। एस. टी. ई. डी. का मुख्य नुकसान, जिसने इसके व्यापक उपयोग को रोक दिया है, यह है कि मशीनरी जटिल है। एक ओर, छवि अधिग्रहण की गति देखने के बड़े क्षेत्रों के लिए अपेक्षाकृत धीमी है क्योंकि एक छवि को पुनः प्राप्त करने के लिए नमूने को स्कैन करने की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, यह देखने के छोटे क्षेत्रों के लिए बहुत तेज हो सकता हैः प्रति सेकंड 80 फ्रेम तक की रिकॉर्डिंग दिखाई गई है। एस. टी. ई. डी. से जुड़े एक बड़े आई. एस. मूल्य के कारण, एक उच्च-तीव्रता उत्तेजना नाड़ी की आवश्यकता होती है, जो नमूने को नुकसान पहुंचा सकती है। ग्राउंड स्टेट डिप्लीशन (जी. एस. डी.) ग्राउंड स्टेट डिप्लीशन माइक्रोस्कोपी (जी. एस. डी. माइक्रोस्कोपी) एक फ्लोरोफोर की ट्रिपल अवस्था का उपयोग ऑफ-स्टेट के रूप में और सिंगलेट अवस्था का उपयोग ऑन-स्टेट के रूप में करती है, जिससे एक उत्तेजना लेजर का उपयोग एकल अवस्था अणु की परिधि में फ्लोरोफोर को ट्रिपल अवस्था में ले जाने के लिए किया जाता है। यह काफी हद तक एस. टी. ई. डी. की तरह है, जहां ऑफ-स्टेट फ्लोरोफोर्स की ग्राउंड स्टेट है, यही कारण है कि समीकरण () इस मामले में भी लागू होता है। मान एस. टी. ई. डी. की तुलना में छोटा है, जिससे बहुत कम लेजर तीव्रता पर सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग संभव हो जाती है। एस. टी. ई. डी. की तुलना में, हालांकि, जी. एस. डी. में उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर आम तौर पर कम फोटोस्टेबल होते हैं; और ट्रिपल अवस्था की संतृप्ति का एहसास करना कठिन हो सकता है। सैचुरेटेड स्ट्रक्चर्ड इल्यूमिनेशन माइक्रोस्कोपी (एसएसआईएम) सैचुरेटेड स्ट्रक्चर्ड-इल्यूमिनेशन माइक्रोस्कोपी (एसएसआईएम) उत्तेजना लेजर की तीव्रता पर फ्लोरोफोर्स की उत्सर्जन दर की अरैखिक निर्भरता का फायदा उठाती है। फ्लोरोसेंट अवस्था में फ्लोरोफोर को संतृप्त करने के लिए आवश्यकता के करीब चरम तीव्रता के साथ एक साइनसॉइडल रोशनी पैटर्न लागू करके, कोई मोइरे फ्रिंज को पुनः प्राप्त करता है। किनारों में उच्च क्रम की स्थानिक जानकारी होती है जिसे कम्प्यूटेशनल तकनीकों द्वारा निकाला जा सकता है। एक बार जानकारी निकालने के बाद, एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि प्राप्त की जाती है। एस. एस. आई. एम. के लिए रोशनी के पैटर्न को कई बार बदलने की आवश्यकता होती है, जिससे तकनीक के अस्थायी संकल्प को प्रभावी ढंग से सीमित किया जा सकता है। इसके अलावा संतृप्त स्थितियों के कारण बहुत ही फोटोस्टेबल फ्लोरोफोर की आवश्यकता होती है, जो नमूने पर विकिरण क्षति पहुंचाते हैं और संभावित अनुप्रयोगों को प्रतिबंधित करते हैं जिनके लिए एसएसआईएम का उपयोग किया जा सकता है। इस सूक्ष्मदर्शी के उदाहरण खंड स्ट्रक्चर्ड इल्यूमिनेशन माइक्रोस्कोपी (सिम) के तहत दिखाए गए हैंः 3डी-सिम सूक्ष्मदर्शी के साथ दर्ज कोशिका नाभिक और माइटोटिक चरणों की छवियां। यादृच्छिक कार्यात्मक तकनीक स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी एकल-अणु स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी (एस. एम. एल. एम.) उन सभी सूक्ष्म तकनीकों का सारांश है जो उत्सर्जकों को अलग करके और उनकी छवियों को बिंदु प्रसार कार्य (पी. एस. एफ.) के साथ फिट करके अति-रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करती हैं। आम तौर पर, बिंदु प्रसार फलन (~ 250 एनएम) की चौड़ाई संकल्प को सीमित करती है। हालांकि, एक पृथक उत्सर्जक को देखते हुए, कोई भी समीकरण () के अनुसार इसकी तीव्रता से सीमित सटीकता के साथ इसका स्थान निर्धारित करने में सक्षम है। () जहाँ स्थानीयकरण परिशुद्धता αloc है, α, पी. एस. एफ. का एफ. डब्ल्यू. एच. एम. (पूर्ण चौड़ाई अधिकतम आधे पर) है और एन एकत्रित फोटॉनों की संख्या है। यह फिटिंग प्रक्रिया केवल अलग-अलग उत्सर्जकों के लिए विश्वसनीय रूप से की जा सकती है (डीकॉन्वोल्यूशन देखें), और दिलचस्प जैविक नमूनों को उत्सर्जकों के साथ इतना सघन रूप से लेबल किया जाता है कि जब सभी उत्सर्जक एक ही समय में सक्रिय होते हैं तो फिटिंग असंभव होती है। एस. एम. एल. एम. तकनीक एक ही समय में उत्सर्जकों के केवल एक विरल उपसमुच्चय को सक्रिय करके, इन कुछ उत्सर्जकों को बहुत सटीक रूप से स्थानीयकृत करके, उन्हें निष्क्रिय करके और दूसरे उपसमुच्चय को सक्रिय करके इस दुविधा को हल करती है। पृष्ठभूमि और कैमरा पिक्सेलेशन को ध्यान में रखते हुए, और एक विशिष्ट सूक्ष्मदर्शी के बिंदु प्रसार कार्य (ऐरी डिस्क) के लिए गॉसियन सन्निकटन का उपयोग करते हुए, सैद्धांतिक संकल्प थॉम्पसन एट अल द्वारा प्रस्तावित किया गया है। और मॉर्टेंसन एट अल द्वारा ठीक-ठाक। : जहाँ * σ एक ही अणु के केंद्र स्थानों का गौसी मानक विचलन है यदि कई बार मापा जाता है (जैसे। एक वीडियो के फ्रेम)। (इकाई m) * σPSF बिंदु प्रसार फलन का गौसी मानक विचलन है, जिसका FWHM अर्न्स्ट एबे समीकरण d = λ/(2 N. A.) का अनुसरण करता है। (इकाई m) * a प्रत्येक छवि पिक्सेल का आकार है। (इकाई एम) * एन. एस. आई. जी. ब्याज के सभी पिक्सेल पर कुल पी. एस. एफ. की फोटॉन गिनती है। (यूनिटलेस) * एन. बी. जी. औसत पृष्ठभूमि फोटॉन की गिनती प्रति पिक्सेल (काली गिनती पहले ही हटा दी गई है), जो समय के साथ प्रत्येक पिक्सेल के पॉइसन वितरण पृष्ठभूमि शोर के गौसियन मानक विचलन का वर्ग या केवल पृष्ठभूमि शोर के साथ सभी पिक्सेल का मानक विचलन होने का अनुमान है, σbg2। σbg2 जितना बड़ा होगा, अनुमान उतना ही बेहतर होगा (जैसे। σbg2> 10 के लिए अच्छा, σbg2> 1000 के लिए उत्कृष्ट)। (इकाईहीन) * संकल्प एफ. डब्ल्यू. एच. एम. ~ 2.355 गौसी मानक विचलन का गुना है। आम तौर पर, स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी फ्लोरोफोर्स के साथ की जाती है। उपयुक्त फ्लोरोफोर (जैसे। एस. टी. ओ. आर. एम. के लिए) अधिकांश समय के लिए एक गैर-फ्लोरोसेंट अंधेरे अवस्था में रहते हैं और आमतौर पर कम तीव्रता के एक उत्तेजना लेजर के साथ स्थिर रूप से सक्रिय होते हैं। एक रीडआउट लेजर प्रतिदीप्ति को उत्तेजित करता है और ब्लीच या फोटोस्विच फ़्लोरोफ़ोर को एक अंधेरी स्थिति में वापस ले जाता है, आमतौर पर 10-100 एमएस के भीतर। नैनोस्केल स्थलाकृति (पी. ए. आई. एन. टी.) में इमेजिंग के लिए अंकों के संचय में, फ्लोरोफोर बंधन से पहले गैर-फ्लोरोसेंट और बाद में फ्लोरोसेंट होते हैं। फ्लोरोसेंट चरण के दौरान उत्सर्जित फोटॉनों को एक कैमरे के साथ एकत्र किया जाता है और फ्लोरोफोर (जिसे पीएसएफ द्वारा विकृत किया जाता है) की परिणामी छवि को बहुत उच्च सटीकता के साथ फिट किया जा सकता है, यहां तक कि कुछ एंगस्ट्रॉम्स के क्रम पर भी। प्रक्रिया को कई हजार बार दोहराने से यह सुनिश्चित होता है कि सभी फ्लोरोफोर उज्ज्वल अवस्था से गुजर सकते हैं और दर्ज किए जाते हैं। एक कंप्यूटर तब एक अति-हल छवि का पुनर्निर्माण करता है। इन विधियों के लिए उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर के वांछनीय लक्षण, संकल्प को अधिकतम करने के लिए, यह हैं कि वे उज्ज्वल होने चाहिए। अर्थात्, उनके पास उच्च विलुप्त होने का गुणांक और उच्च मात्रा में उपज होनी चाहिए। उनके पास एक उच्च कंट्रास्ट अनुपात भी होना चाहिए (प्रकाश अवस्था में उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या और अंधेरे अवस्था में उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या के बीच का अनुपात)। इसके अलावा, न्यक्विस्ट मानदंड के अनुसार, एक सघन लेबल वाला नमूना वांछनीय है। स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी विधियों की भीड़ ज्यादातर उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोफोर के प्रकार में भिन्न होती है। स्पेक्ट्रल प्रिसिजन डिस्टेंस माइक्रोस्कोपी (एस. पी. डी. एम.) प्रकाश का एक एकल, छोटा स्रोत आमतौर पर एक सूक्ष्मदर्शी के संकल्प की तुलना में बहुत बेहतर स्थित हो सकता हैः हालाँकि प्रकाश एक धुंधला स्थान उत्पन्न करेगा, कंप्यूटर एल्गोरिदम का उपयोग धुंधले स्थान के केंद्र की सटीक गणना करने के लिए किया जा सकता है, सूक्ष्मदर्शी के बिंदु प्रसार कार्य, डिटेक्टर के शोर गुणों आदि को ध्यान में रखते हुए। हालाँकि, यह दृष्टिकोण तब काम नहीं करता है जब एक दूसरे के बहुत अधिक स्रोत होते हैंः स्रोत तब सभी एक साथ धुंधले हो जाते हैं। स्पेक्ट्रल प्रिसिशन डिस्टेंस माइक्रोस्कोपी (एस. पी. डी. एम.) प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में स्थानीयकरण तकनीकों का एक परिवार है जो एक समय में केवल कुछ स्रोतों को मापकर कई स्रोत होने की समस्या को दूर करता है, ताकि प्रत्येक स्रोत को दूसरों से "ऑप्टिकल रूप से अलग" किया जा सके (यानी, माइक्रोस्कोप के रिज़ॉल्यूशन से अधिक से अलग, आमतौर पर ~ 200-250 एन. एम.), यदि परीक्षण के तहत कणों में अलग-अलग वर्णक्रमीय हस्ताक्षर होते हैं, ताकि उपयुक्त प्रकाश स्रोतों और फिल्टर का उपयोग करके एक समय में केवल कुछ अणुओं से प्रकाश को देखना संभव हो। यह पारंपरिक ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन की तुलना में कई गुना बेहतर एक प्रभावी ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करता है जिसे प्रभावी बिंदु छवि फ़ंक्शन के मुख्य अधिकतम की आधी चौड़ाई द्वारा दर्शाया जाता है। एस. पी. डी. एम. का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकने वाले संरचनात्मक संकल्प को विभिन्न वर्णक्रमीय विशेषताओं ("टोपोलॉजिकल रिज़ॉल्यूशन") के दो पंक्टिफॉर्म कणों के बीच सबसे छोटी मापने योग्य दूरी के संदर्भ में व्यक्त किया जा सकता है। मॉडलिंग ने दिखाया है कि स्थानीयकरण, कण घनत्व, आदि की सटीकता के संबंध में उपयुक्त परिस्थितियों में, "टोपोलॉजिकल रिज़ॉल्यूशन" एक "स्पेस फ्रीक्वेंसी" से मेल खाता है, जो शास्त्रीय परिभाषा के संदर्भ में, एक बहुत बेहतर ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन के बराबर है। अणुओं को फ्लोरोसेंट जीवनकाल और अन्य तकनीकों के आधार पर और भी अधिक सूक्ष्म तरीकों से अलग किया जा सकता है। एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग जीनोम अनुसंधान (जीनोम के कार्यात्मक संगठन का अध्ययन) में है। उपयोग का एक अन्य महत्वपूर्ण क्षेत्र झिल्ली की संरचना में अनुसंधान है। यदि कुछ फोटो-फिजिकल स्थितियाँ मौजूद हों तो जी. एफ. पी., एलेक्सा डाई और फ्लोरासिन अणुओं जैसे कई मानक फ्लोरोसेंट रंगों के लिए एस. पी. डी. एम. फाइमोड स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी संभव है। इस तथाकथित भौतिक रूप से परिवर्तनीय फ्लोरोफोर्स (एस. पी. डी. एम. फाइमोड) प्रौद्योगिकी के साथ, अन्य स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी प्रौद्योगिकियों के विपरीत नैनोइमेजिंग के लिए उपयुक्त तीव्रता का एक एकल लेजर तरंग दैर्ध्य पर्याप्त है, जिन्हें विशेष फोटो-स्विचेबल/फोटो-सक्रिय करने योग्य प्रतिदीप्ति अणुओं का उपयोग करने पर दो लेजर तरंग दैर्ध्य की आवश्यकता होती है। एस. पी. डी. एम. फाइमोड के उपयोग का एक और उदाहरण तंबाकू मोज़ेक वायरस (टी. एम. वी.) कणों का विश्लेषण या वायरस-कोशिका अंतःक्रिया का अध्ययन है। सिंगलेट-ट्रिपलेट अवस्था संक्रमणों के आधार पर एस. पी. डी. एम. फाइमोड के लिए यह महत्वपूर्ण है कि यह प्रक्रिया जारी है और इस प्रभाव की ओर ले जाती है कि एक एकल अणु पहले एक बहुत लंबे समय तक रहने वाले प्रतिवर्ती काले अवस्था (कई सेकंड तक के अर्ध-जीवन के साथ) में आता है, जिससे यह एक बहुत लंबे समय तक रहने वाले, तथाकथित अपरिवर्तनीय काले अवस्था में लौटने से पहले कई मिलीसेकंड के लिए कई फोटॉन उत्सर्जित करने वाली एक प्रतिदीप्ति अवस्था में लौटता है। एस. पी. डी. एम. फाइमोड माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट अणुओं का उपयोग करती है जो एक ही वर्णक्रमीय प्रकाश आवृत्ति का उत्सर्जन करते हैं लेकिन चमकती विशेषताओं के आधार पर अलग-अलग वर्णक्रमीय हस्ताक्षर के साथ। एक ही कोशिका की दो हजार छवियों को मिलाकर, लेजर ऑप्टिकल परिशुद्धता माप का उपयोग करके, काफी बेहतर ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन के साथ स्थानीयकरण छवियों को रिकॉर्ड करना संभव है। एस. पी. डी. एम. फाइमोड तकनीक के साथ पहले से ही सफलतापूर्वक उपयोग किए जाने वाले मानक फ्लोरोसेंट रंग हैं जी. एफ. पी., आर. एफ. पी., वाई. एफ. पी., एलेक्सा 488, एलेक्सा 568, एलेक्सा 647, सी. आई. 2, सी. आई. 3, एटो 488 और फ्लोरसीन। 3डी (कोल्ड) में क्रायोजेनिक ऑप्टिकल स्थानीयकरण 3डी (कोल्ड) में क्रायोजेनिक ऑप्टिकल स्थानीयकरण एक ऐसी विधि है जो एंगस्ट्रॉम-स्केल रिज़ॉल्यूशन के साथ एकल छोटे से मध्यम आकार के जैव अणु के भीतर कई फ्लोरोसेंट साइटों को स्थानीयकृत करने की अनुमति देती है। इस दृष्टिकोण में स्थानीयकरण की सटीकता को बढ़ाया जाता है क्योंकि कम तापमान पर धीमी प्रकाश रसायन विज्ञान से अधिक संख्या में फोटॉन निकलते हैं जिन्हें फोटोब्लीचिंग से पहले प्रत्येक फ्लोरोफोर से उत्सर्जित किया जा सकता है। नतीजतन, क्रायोजेनिक स्टोकेस्टिक लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी एक छोटे से प्रोटीन से जुड़े कई फ्लोरोफोर की 3डी स्थितियों को हल करने के लिए आवश्यक उप-आणविक संकल्प को प्राप्त करती है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से ज्ञात एल्गोरिदम को नियोजित करके, फ्लोरोफोर के 2डी अनुमानों को 3डी विन्यास में पुनर्निर्मित किया जाता है। सी. ओ. एल. डी. लेबल के आकार के आधार पर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी को अपनी मौलिक सीमा तक लाता है। मूल्यवान पूरक जानकारी और विशिष्टता प्रदान करने के लिए विधि को अन्य संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीकों-जैसे एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ भी जोड़ा जा सकता है। बाइंडिंग-एक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (बी. ए. एल. एम.) बाइंडिंग-एक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (बी. ए. एल. एम.) एकल-अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एस. एम. एल. एम.) के लिए एक सामान्य अवधारणा हैः डी. एन. ए. और एक डाई के गुणों को संशोधित करने के आधार पर डी. एन. ए.-बाइंडिंग रंगों की सुपर-रिज़ॉल्व्ड इमेजिंग। रासायनिक वातावरण के सावधानीपूर्वक समायोजन से-जिससे स्थानीय, प्रतिवर्ती डी. एन. ए. पिघलता है और प्रतिदीप्ति संकेत पर संकरण नियंत्रण होता है-डी. एन. ए.-बाध्यकारी डाई अणुओं को पेश किया जा सकता है। इंटरकेलेटिंग और माइनर-ग्रूव बाइंडिंग डीएनए रंगों का उपयोग एक समय में केवल कुछ डीएनए-बाइंडिंग डाई संकेतों को पंजीकृत करने और ऑप्टिकल रूप से अलग करने के लिए किया जा सकता है। डी. एन. ए. संरचना में उतार-चढ़ाव-सहायता प्राप्त बी. ए. एल. एम. (एफ. बी. ए. एल. एम.) का उपयोग लगभग 50 एन. एम. के अनुमानित संरचनात्मक संकल्प के साथ परमाणु वास्तुकला में नैनोस्केल अंतर के लिए किया गया है। डीएनए संरचना में उतार-चढ़ाव के आधार पर बाइंडिंग-एक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग क्रोमैटिन नैनोस्ट्रक्चर। हाल ही में, एक अमाइलॉइड से जुड़ने पर एन. आई. ए. डी.-4 की प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज में महत्वपूर्ण वृद्धि का उपयोग अमाइलॉइड फाइब्रिल और ऑलिगोमर्स की बी. ए. एल. एम. इमेजिंग के लिए किया गया था। एस. टी. ओ. आर. एम., पी. ए. एल. एम., और एफ. पी. ए. एल. एम. स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी (एस. टी. ओ. आर. एम.), फोटो एक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पी. ए. एल. एम.), और फ्लोरोसेंस फोटो-एक्टिवेशन लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (एफ. पी. ए. एल. एम.) सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकें हैं जो उच्च रिज़ॉल्यूशन वाली छवियां बनाने के लिए फोटोविचेबल फ्लोरोफोर्स के अनुक्रमिक सक्रियण और समय-हल स्थानीयकरण का उपयोग करती हैं। इमेजिंग के दौरान, किसी भी समय फ्लोरोसेंट अवस्था में केवल फ्लोरोफोर का एक ऑप्टिकल रूप से हल करने योग्य सबसेट सक्रिय होता है, जैसे कि प्रत्येक फ्लोरोफोर की स्थिति को किसी विशेष फ्लोरोफोर की एकल-अणु छवियों की केंद्रक स्थिति का पता लगाकर उच्च सटीकता के साथ निर्धारित किया जा सकता है। फ्लोरोफोर्स के एक उपसमुच्चय को बाद में निष्क्रिय कर दिया जाता है, और दूसरे उपसमुच्चय को सक्रिय और चित्रित किया जाता है। इस प्रक्रिया के पुनरावृत्ति से कई फ्लोरोफोर को स्थानीयकृत किया जा सकता है और छवि डेटा से एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवि का निर्माण किया जा सकता है। इन तीनों विधियों को कम समय में स्वतंत्र रूप से प्रकाशित किया गया था, और उनके सिद्धांत समान हैं। STORM को मूल रूप से न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन से जुड़े Cy5 और Cy3 रंगों का उपयोग करके वर्णित किया गया था, जबकि PALM और FPALM को फोटोस्विचेबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके वर्णित किया गया था। सिद्धांत रूप में किसी भी फोटोस्विचेबल फ्लोरोफोर का उपयोग किया जा सकता है, और STORM को विभिन्न प्रकार की जांच और लेबलिंग रणनीतियों के साथ प्रदर्शित किया गया है। एकल फ्लोरोफोर, जैसे कि Cy5, के स्टोकेस्टिक फोटोस्विचिंग का उपयोग करके, STORM को एकल लाल लेजर उत्तेजना स्रोत के साथ किया जा सकता है। लाल लेजर दोनों एक एडक्ट के गठन द्वारा Cy5 फ्लोरोफोर को एक अंधेरी स्थिति में बदल देता है और बाद में अणु को फ्लोरोसेंट स्थिति में वापस कर देता है। STORM के साथ कई अन्य रंगों का भी उपयोग किया गया है। एकल फ्लोरोफोर्स के अलावा, एक सक्रियक फ्लोरोफोर (जैसे एलेक्सा 405, Cy2, या Cy3) और एक फोटोस्विच करने योग्य रिपोर्टर डाई (जैसे Cy5, एलेक्सा 647, Cy5.5, या Cy7) से युक्त डाई-जोड़े का उपयोग STORM के साथ किया जा सकता है। इस योजना में, सक्रियक फ्लोरोफोर, जब अपने अधिकतम अवशोषण के पास उत्तेजित होता है, तो प्रकाश-मंत्रणीय रंग को प्रतिदीप्ति अवस्था में फिर से सक्रिय करने का कार्य करता है। बहु-रंगीन इमेजिंग को डाई-जोड़ों को अलग करने के लिए अलग-अलग सक्रियण तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके किया गया है, जो सक्रियक फ्लोरोफोर के उपयोग पर निर्भर करता है, या सक्रियक फ्लोरोफोर के साथ या उसके बिना वर्णक्रमीय रूप से अलग फोटोस्विचेबल फ्लोरोफोर का उपयोग करता है। फोटोस्विचेबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन का भी उपयोग किया जा सकता है। फोटोस्विचेबल प्रोब के साथ जैविक संरचनाओं की अत्यधिक विशिष्ट लेबलिंग एंटीबॉडी स्टेनिंग, प्रोटीन के प्रत्यक्ष संयुग्मन और आनुवंशिक एन्कोडिंग के साथ हासिल की गई है। एस. टी. ओ. आर. एम. को ऑप्टिकल दृष्टिवैषम्य का उपयोग करके त्रि-आयामी इमेजिंग तक भी विस्तारित किया गया है, जिसमें बिंदु प्रसार फलन का अण्डाकार आकार कई माइक्रोमीटर मोटे नमूनों के लिए एक्स, वाई और जेड स्थितियों को कूटबद्ध करता है, और जीवित कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया है। आज तक, इस तकनीक द्वारा प्राप्त स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पार्श्व आयामों में ~ 20 nm और अक्षीय आयाम में ~ 50 nm है; और अस्थायी रिज़ॉल्यूशन 0.1-0.33s जितना तेज़ है। नैनोस्केल स्थलाकृति (पी. ए. आई. एन. टी.) में इमेजिंग के लिए अंकों का संचय नैनोस्केल स्थलाकृति (पी. ए. आई. एन. टी.) में इमेजिंग के लिए अंकों का संचय एक एकल-अणु स्थानीयकरण विधि है जो आणविक अवशोषण/अवशोषण और फोटोब्लीचिंग/डिसॉर्प्शन द्वारा यादृच्छिक एकल-अणु प्रतिदीप्ति प्राप्त करती है। उपयोग की जाने वाली पहली डाई नील लाल थी जो जलीय घोल में गैर-फ्लोरोसेंट होती है, लेकिन जब हाइड्रोफोबिक वातावरण, जैसे कि माइसेल्स या जीवित कोशिका दीवारों में डाली जाती है तो फ्लोरोसेंट होती है। इस प्रकार, रंग की सांद्रता को नैनोमोलर स्तर पर कम रखा जाता है, ताकि अणु की अवशोषण दर विवर्तन-सीमित क्षेत्र में मिलीसेकंड क्षेत्र में हो। एक स्थिर लक्ष्य के लिए एकल-रंग अणुओं (जांच) के यादृच्छिक बंधन को एक विशिष्ट विस्तृत क्षेत्र प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत स्थानिक और अस्थायी रूप से हल किया जा सकता है। प्रत्येक डाई को क्षेत्र को एक अंधेरी स्थिति में वापस लाने के लिए फोटोब्लीच किया जाता है, ताकि अगली डाई को बांधा जा सके और देखा जा सके। अन्य यादृच्छिक विधियों की तुलना में इस विधि का लाभ यह है कि यह निश्चित लक्ष्य की अति-हल की गई छवि प्राप्त करने के अलावा, समाधान में, लक्ष्य के लिए फैलते हुए जांच अणुओं के गतिशील बंधन गतिविज्ञान को माप सकता है। 3डी सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक का संयोजन (जैसे। डबल-हेलिक्स पॉइंट स्प्रेड फ़ंक्शन मोएर्नर के समूह में विकसित होता है), फोटो-सक्रिय रंग, शक्ति-निर्भर सक्रिय अंतराल, और नैनोस्केल स्थलाकृति में इमेजिंग के लिए अंक संचय, एसपीआरएआईपीएआईएनटी (एसपीआरएआई = पॉवर-निर्भर सक्रिय अंतराल द्वारा सुपर रिज़ॉल्यूशन) लाइव-सेल दीवारों को सुपर-रिज़ॉल्व कर सकता है। पेंट डाई अधिशोषण/अवशोषण और फोटोब्लीचिंग/डिसोर्प्शन दरों के बीच संतुलन बनाए रखते हुए काम करता है। इस संतुलन का अनुमान सांख्यिकीय सिद्धांतों से लगाया जा सकता है। गैस या तरल घोल में एक सतह या इंटरफेस पर एक पतला घोल के अधिशोषण या अवशोषण दर की गणना फिक के प्रसार के नियमों का उपयोग करके की जा सकती है। फोटोब्लीचिंग/डिसॉर्प्शन दर को दिए गए समाधान की स्थिति और रोशनी शक्ति घनत्व के लिए मापा जा सकता है। डी. एन. ए.-पी. ए. आई. एन. टी. को नियमित रंगों का उपयोग करने के लिए आगे बढ़ाया गया है, जहां एक निश्चित डी. एन. ए. ओरिगामी के लिए एक डाई-लेबल वाले डी. एन. ए. जांच के गतिशील बंधन और अनबाइंडिंग का उपयोग यादृच्छिक एकल-अणु इमेजिंग प्राप्त करने के लिए किया जाता है। डी. एन. ए.-पी. ए. आई. एन. टी. अब पर्यावरण-संवेदनशील रंगों तक ही सीमित नहीं है और लक्ष्य तक जांच के अवशोषण और अवशोषण गतिविज्ञान दोनों को माप सकता है। विधि गतिशील रंगों के कैमरा धुंधला प्रभाव का उपयोग करती है। जब एक नियमित डाई घोल में फैलती है, तो एक विशिष्ट सी. सी. डी. कैमरे पर इसकी छवि इसकी अपेक्षाकृत तेज गति और अपेक्षाकृत लंबे कैमरा एक्सपोजर समय के कारण धुंधली हो जाती है, जो प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि में योगदान देती है। हालांकि, जब यह एक निश्चित लक्ष्य से जुड़ता है, तो डाई चलना बंद कर देता है और पॉइंट स्प्रेड फंक्शन में स्पष्ट इनपुट प्राप्त किया जा सकता है। इस विधि के लिए शब्द एम. बी. पी. ए. आई. एन. टी. (गति अस्पष्टता के लिए "एम. बी".) है। जब इमेजिंग के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (टी. आई. आर. एफ.) का उपयोग किया जाता है, तो उत्तेजना की गहराई सब्सट्रेट से ~ 100 एन. एम. तक सीमित होती है, जो सब्सट्रेट के पास धुंधले रंगों और थोक घोल में पृष्ठभूमि से प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि को और कम कर देती है। बहुत चमकीले रंगों का उपयोग एम. बी. पी. ए. आई. एन. टी. के लिए किया जा सकता है जो अपेक्षाकृत हल्के प्रकाश उत्तेजना तीव्रता के तहत ~ 20 एन. एम. के विशिष्ट एकल-फ्रेम स्थानिक संकल्प और ~ 20 एम. एस. के एकल-अणु गतिज लौकिक संकल्प देता है, जो एकल प्रोटीन के आणविक पृथक्करण का अध्ययन करने में उपयोगी है। डेटा अधिग्रहण के दौरान फूरियर तल में रखे गए एक घूर्णन चरण मास्क का उपयोग करके और विकृत बिंदु प्रसार कार्य को हल करने के लिए अस्थायी संकल्प में और सुधार (20 गुना) किया गया है जिसमें अस्थायी जानकारी होती है। इस विधि को सुपर टेम्पोरल-रिज़ॉल्व्ड माइक्रोस्कोपी (एसटीआरईएम) नाम दिया गया था। लेबल-मुक्त स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी एस. पी. डी. एम. का उपयोग करके लगभग 50 एन. एम. की सीमा में सेलुलर संरचनाओं का ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जा सकता है, यहां तक कि लेबल-मुक्त कोशिकाओं में भी। दो अलग-अलग लेजर तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके, एस. पी. डी. एम. सेलुलर वस्तुओं को प्रकट करता है जो पारंपरिक प्रतिदीप्ति विस्तृत-क्षेत्र इमेजिंग स्थितियों के तहत पता लगाने योग्य नहीं हैं, इसके अलावा ऑटोफ्लोरोसेंट संरचनाओं के पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन में सुधार करते हैं। एक नियंत्रण के रूप में, स्थानीयकरण छवि में खोजी गई वस्तुओं की स्थिति उज्ज्वल-क्षेत्र छवि से मेल खाती है। लेबल-मुक्त सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को एक अत्यधिक समान प्लाजमोनिक मेटासर्फेस पर सतह-वर्धित रमन प्रकीर्णन संकेत के उतार-चढ़ाव का उपयोग करके भी प्रदर्शित किया गया है। डायरेक्ट स्टोकेस्टिकल ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी (डीएसटीओआरएम) डीएसटीओआरएम एकल फ्लोरोफोर के फोटोस्विचिंग का उपयोग करता है। डी. एस. टी. ओ. आर. एम. में, फ्लोरोफोर एक कम करने और ऑक्सीकरण बफरिंग प्रणाली (आर. ओ. एक्स. एस.) में अंतर्निहित होते हैं और प्रतिदीप्ति उत्तेजित होती है। कभी-कभी, यादृच्छिक रूप से, फ्लोरोफोर एक ट्रिपल या किसी अन्य अंधेरे अवस्था में प्रवेश करेगा जो बफर की ऑक्सीकरण स्थिति के प्रति संवेदनशील है, जिससे उन्हें फ्लोरोस किया जा सकता है, ताकि एकल अणु की स्थिति को दर्ज किया जा सके। डी. एस. टी. ओ. आर. एम. विधि का विकास लगभग एक ही समय में 3 स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में हुआ और इसे "प्रतिवर्ती फोटोब्लीचिंग माइक्रोस्कोपी" (आर. पी. एम.), "ग्राउंड स्टेट डिप्लीशन माइक्रोस्कोपी के बाद व्यक्तिगत अणु वापसी" (जी. एस. डी. आई. एम.) के साथ-साथ अब आम तौर पर स्वीकृत उपनाम डी. एस. टी. ओ. आर. एम. भी कहा जाता था। स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी के लिए सॉफ्टवेयर सॉफ्टवेयर पर बहुत अधिक निर्भर करता है जो कुछ ही मिनटों में सक्रिय फ्लोरोफोर की लाखों छवियों के लिए बिंदु प्रसार कार्य (पीएसएफ) को सटीक रूप से फिट कर सकता है। चूँकि प्राकृतिक विज्ञान में उपयोग की जाने वाली शास्त्रीय विश्लेषण विधियाँ और सॉफ्टवेयर सुइट इन समस्याओं को कम्प्यूटेशनल रूप से हल करने में बहुत धीमी हैं, इसलिए अक्सर मिनटों में मापा जाने वाले डेटा को संसाधित करने के लिए गणना के घंटों लगते हैं, विशेष सॉफ्टवेयर प्रोग्राम विकसित किए गए हैं। इनमें से कई स्थानीयकरण सॉफ्टवेयर पैकेज ओपन-सोर्स हैं; वे एस. एम. एल. एम. सॉफ्टवेयर बेंचमार्क में सूचीबद्ध हैं। एक बार अणु की स्थिति निर्धारित हो जाने के बाद, स्थानों को प्रदर्शित करने की आवश्यकता होती है और प्रदर्शन के लिए कई एल्गोरिदम विकसित किए गए हैं। सुपर-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल फ्लक्चुएशन इमेजिंग (एस. ओ. एफ. आई.) पिक्सेल के अस्थायी ऑटोकोरिलेशन की सीधे गणना करके एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एस. एम. एल. एम.) में निहित पी. एस. एफ. फिटिंग की आवश्यकता को दरकिनार करना संभव है। इस तकनीक को सुपर-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल फ्लक्चुएशन इमेजिंग (एस. ओ. एफ. आई.) कहा जाता है और एस. एम. एल. एम. की तुलना में अधिक सटीक दिखाया गया है जब समवर्ती रूप से सक्रिय फ्लोरोफोर का घनत्व बहुत अधिक होता है। सर्वव्यापी स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी (ओ. एल. एम.) सर्वव्यापी स्थानीयकरण सूक्ष्मदर्शी (ओ. एल. एम.) एकल अणु सूक्ष्मदर्शी (एस. एम. एल. एम.) तकनीकों का एक विस्तार है जो एक असंगत प्रकाश स्रोत (जैसे पारा-चाप दीपक) और एक पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस सूक्ष्मदर्शी सेटअप के साथ उच्च घनत्व वाले एकल अणु इमेजिंग की अनुमति देता है। गहरे नीले उत्तेजना का एक छोटा विस्फोट (405 एनएम, लेजर के बजाय एक 350-380 एनएम के साथ) परीक्षण नमूनों पर 90 एनएम के रिज़ॉल्यूशन के लिए अणुओं के लंबे समय तक पुनः सक्रिय होने में सक्षम बनाता है। अंत में, सहसंबंधी एस. टी. ई. डी. और एस. एम. एल. एम. इमेजिंग को एक ही जैविक नमूने पर एक साधारण इमेजिंग माध्यम का उपयोग करके किया जा सकता है, जो आगे बढ़े हुए संकल्प के लिए एक आधार प्रदान कर सकता है। ये निष्कर्ष सुपर रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का लोकतंत्रीकरण कर सकते हैं और किसी भी वैज्ञानिक को सीमित बजट के साथ भी उच्च घनत्व वाली एकल-अणु छवियां बनाने में मदद कर सकते हैं। अनुक्रमिक इमेजिंग (आर. ई. एस. आई.) द्वारा संकल्प वृद्धि अनुक्रमिक इमेजिंग (आर. ई. एस. आई.) द्वारा संकल्प वृद्धि डी. एन. ए.-पी. ए. आई. एन. टी. का एक विस्तार है जो सैद्धांतिक रूप से असीमित संकल्प प्राप्त कर सकता है। किसी लक्षित प्रजाति की पहचान करने के लिए एक लेबल प्रकार का उपयोग करने के बजाय, एक ही लक्ष्य की प्रतियों को ऑर्थोगोनल डीएनए अनुक्रमों के साथ लेबल किया जाता है। क्रमिक रूप से (अर्थात। अलग) इमेजिंग, स्थानीयकरण बादल जो पारंपरिक एस. एम. एल. एम. में ओवरलैप होंगे, उन्हें (1) हल किया जा सकता है और (2) एक एकल "सुपर" स्थानीयकरण में जोड़ा जा सकता है, जिसकी सटीकता स्थानीयकरण की अंतर्निहित संख्या के साथ मापी जाती है। जैसे-जैसे डी. एन. ए.-पी. ए. आई. एन. टी. में प्राप्त करने योग्य स्थानीयकरणों की संख्या असीमित है, वैसे-वैसे आर. ई. एस. आई. का सैद्धांतिक संकल्प भी असीमित है। अंतर्निहित इमेजिंग राउंड से आरईएसआई स्थानीयकरणों को ओवरले करने से एक समग्र, अत्यधिक संकल्पित छवि बनती है। वर्टिको एस. एम. आई. माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 3डी लाइट माइक्रोस्कोपिकल नैनोसाइजिंग (एल. आई. एम. ओ. एन.) माइक्रोस्कोपी लाइट माइक्रोस्कोपिकल नैनोसाइजिंग माइक्रोस्कोपी (एल. आई. एम. ओ. एन.) छवियों का संयोजन एस. एम. आई. और एस. पी. डी. एम. के संयोजन से संभव होता है, जिससे पहले एस. एम. आई. और फिर एस. पी. डी. एम. प्रक्रिया लागू की जाती है। एस. एम. आई. प्रक्रिया सूक्ष्मदर्शी अक्ष की दिशा में कणों के केंद्र और उनके प्रसार को निर्धारित करती है। जबकि कणों/अणुओं के केंद्र को 1 से 2 एनएम की सटीकता के साथ निर्धारित किया जा सकता है, इस बिंदु के आसपास के प्रसार को लगभग 30-40 एनएम के अक्षीय व्यास तक निर्धारित किया जा सकता है। इसके बाद, अलग-अलग कण/अणु की पार्श्व स्थिति को एस. पी. डी. एम. का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है, जिससे कुछ नैनोमीटर की सटीकता प्राप्त होती है। 3डी दोहरे रंग मोड में एक जैविक अनुप्रयोग के रूप में, हर2/न्यूर और हर3 समूहों की स्थानिक व्यवस्था हासिल की गई थी। प्रोटीन समूहों की तीनों दिशाओं में स्थिति को लगभग 25 एनएम की सटीकता के साथ निर्धारित किया जा सकता है। एकीकृत सहसंबंधी प्रकाश और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी के साथ एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन सूक्ष्मदर्शी का संयोजन प्रतिदीप्ति मार्करों द्वारा प्रदान की गई लेबलिंग के साथ प्रासंगिक जानकारी के दृश्य को सक्षम बनाता है। यह काली पृष्ठभूमि की समस्या को दूर करता है जो शोधकर्ता के पास केवल एक हल्के सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते समय बची होती है। एक एकीकृत प्रणाली में, नमूने को दोनों सूक्ष्मदर्शी द्वारा एक साथ मापा जाता है। न्यूरल नेटवर्क का उपयोग करके तकनीकों को बढ़ाना हाल ही में, आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस कंप्यूटिंग में प्रगति के कारण, डीप-लर्निंग न्यूरल नेटवर्क (जी. ए. एन.) का उपयोग ऑप्टिकल-माइक्रोस्कोप फोटोग्राफिक छवियों के सुपर-रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए किया गया है, 40x से 100x तक, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ 20x से 1500x तक, एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ तुलनीय, एक न्यूरल लेंस के माध्यम से, और पॉज़िट्रॉन-उत्सर्जन टोमोग्राफी और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ। मल्टीफोकल प्लेन माइक्रोस्कोपी (एम. यू. एम.) स्टिमुलेटेड एमिशन डिप्लीशन माइक्रोस्कोप (एस. टी. ई. डी.) फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पी. ए. एल. एम.) डीकॉन्वोल्यूशन फोटोएक्टिवेटेबल प्रोब्स कोरिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग वीडियो सुपर रिज़ॉल्यूशन संदर्भ आगे पढ़ने के लिए माइक्रोस्कोपी जर्मन आविष्कार सेल इमेजिंग प्रयोगशाला उपकरण ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंस तकनीक