Interference reflection microscopy
इंटरफेरेंस रिफ्लेक्शन माइक्रोस्कोपी (आई. आर. एम.), जिसे संदर्भ के आधार पर रिफ्लेक्शन इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (आर. आई. सी. एम.) या रिफ्लेक्शन कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (आर. सी. एम.) भी कहा जाता है, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो कांच की सतह पर किसी वस्तु की छवि बनाने के लिए हस्तक्षेप प्रभावों का लाभ उठाती है। संकेत की तीव्रता कांच की सतह से वस्तु की निकटता का एक माप है। इस तकनीक का उपयोग (फ्लोरोसेंट) लेबल के उपयोग के बिना कोशिका झिल्ली में घटनाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जैसा कि टी. आई. आर. एफ. माइक्रोस्कोपी के मामले में होता है। इतिहास और नाम 1964 में, एडम एस. जी. कर्टिस ने भ्रूण चिक हार्ट फाइब्रोब्लास्ट का अध्ययन करने के लिए कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में इसका उपयोग करते हुए इंटरफेरेंस रिफ्लेक्शन माइक्रोस्कोपी (आई. आर. एम.) शब्द गढ़ा। उन्होंने आसंजन स्थलों और फाइब्रोब्लास्ट की दूरी को देखने के लिए आई. आर. एम. का उपयोग किया, यह देखते हुए कि कांच के साथ संपर्क ज्यादातर कोशिका परिधि और सूडोपोडिया तक सीमित था। 1975 में, जोहान सेबेस्टियन प्लोएम ने आई. आर. एम. (एक पुस्तक अध्याय में प्रकाशित) में सुधार की शुरुआत की, जिसे उन्होंने रिफ्लेक्शन कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (आर. सी. एम.) कहा। सुधार ऑप्टिकल प्रणाली में आवारा प्रकाश को और कम करने के लिए एक तथाकथित एंटी-फ्लेक्स उद्देश्य और पार ध्रुवीकरण का उपयोग करना है। आज, इस योजना को मुख्य रूप से रिफ्लेक्शन इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (आर. आई. सी. एम.) के रूप में जाना जाता है, जिसका नाम 1979 में बरेटर-हैन और कोनराड बेक द्वारा पेश किया गया था। हालाँकि, आई. आर. एम. शब्द कभी-कभी आर. आई. सी. एम. सेटअप का वर्णन करने के लिए होता है। तकनीक का वर्णन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नामों की बहुलता ने कुछ भ्रम पैदा किया है, और 1985 की शुरुआत में वर्सुएरेन द्वारा चर्चा की गई थी। बेराइटर-हैन और कोनराड बेक ने तकनीक को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ सहसंबंधित किया, जिससे पता चलता है कि विभिन्न स्तनधारी कोशिका रेखाएं विशिष्ट फोकल आसंजन स्थलों में कांच के सब्सट्रेट का पालन करती हैं। सिद्धांत संलग्न कोशिका की एक छवि बनाने के लिए, एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य का प्रकाश एक ध्रुवीकरण के माध्यम से पारित किया जाता है। यह रैखिक ध्रुवीकृत प्रकाश उद्देश्य की ओर एक बीम स्प्लिटर द्वारा परावर्तित होता है, जो प्रकाश को नमूने पर केंद्रित करता है। कांच की सतह कुछ हद तक परावर्तक है और ध्रुवीकृत प्रकाश को परावर्तित करेगी। जो प्रकाश कांच द्वारा परावर्तित नहीं होता है, वह कोशिका में प्रवेश करेगा और कोशिका झिल्ली द्वारा परावर्तित होगा। तीन स्थितियाँ हो सकती हैं। सबसे पहले, जब झिल्ली कांच के करीब होती है, तो कांच से परावर्तित प्रकाश को तरंग दैर्ध्य के आधे हिस्से में स्थानांतरित किया जाता है, ताकि झिल्ली से परावर्तित प्रकाश में कांच के चरणों से परावर्तित प्रकाश की तुलना में एक चरण बदलाव हो और इसलिए एक दूसरे को रद्द कर दें (हस्तक्षेप)। इस हस्तक्षेप के परिणामस्वरूप अंतिम छवि (आकृति में बाईं ओर का मामला) में एक गहरा पिक्सेल होता है। दूसरा, जब झिल्ली कांच से जुड़ी नहीं होती है, तो झिल्ली से प्रतिबिंब में कांच से परावर्तित प्रकाश की तुलना में एक छोटा चरण बदलाव होता है, और इसलिए वे एक-दूसरे को रद्द नहीं करेंगे, जिसके परिणामस्वरूप छवि में एक उज्ज्वल पिक्सेल होगा (आकृति में सही मामला)। तीसरा, जब कोई नमूना नहीं होता है, तो केवल कांच से परावर्तित प्रकाश का पता लगाया जाता है और अंतिम छवि में उज्ज्वल पिक्सेल के रूप में दिखाई देगा। परावर्तित प्रकाश बीम स्प्लिटर पर वापस जाएगा और अंतिम चित्र बनाने के लिए डिटेक्टर (आमतौर पर एक सी. सी. डी. कैमरा) तक पहुंचने से पहले एक दूसरे ध्रुवीकरण से गुजरेगा, जो बिखरे हुए प्रकाश को समाप्त करता है। ध्रुवीकरणकर्ता बिखरे हुए प्रकाश को कम करके दक्षता बढ़ा सकते हैं; हालाँकि एक संवेदनशील डिजिटल कैमरे के साथ एक आधुनिक सेटअप में, उनकी आवश्यकता नहीं है। सिद्धांत परावर्तन अपवर्तन सूचकांक में परिवर्तन के कारण होता है, इसलिए प्रत्येक सीमा पर प्रकाश का एक हिस्सा परावर्तित होगा। परावर्तन की मात्रा परावर्तन गुणांक द्वारा दी जाती है, निम्नलिखित नियम के अनुसारः परावर्तनशीलता परावर्तित प्रकाश की तीव्रता () और आने वाली प्रकाश की तीव्रता () का अनुपात हैः कांच (1.50-1.54, सूची देखें), पानी (1.31, सूची देखें), कोशिका झिल्ली (1.48) और साइटोसोल (1.35) के लिए विशिष्ट अपवर्तक सूचकांकों का उपयोग करके, प्रत्येक इंटरफेस द्वारा परावर्तित होने वाले प्रकाश के अंश की गणना की जा सकती है। अपवर्तक सूचकांकों के बीच अंतर बढ़ने पर परावर्तन की मात्रा बढ़ जाती है, जिसके परिणामस्वरूप कांच की सतह और संवर्धन माध्यम (लगभग पानी के बराबरः 1.31-1.33) के बीच इंटरफेस से एक बड़ा परावर्तन होता है। इसका मतलब है कि एक कोशिका के बिना छवि उज्ज्वल होगी, जबकि जब कोशिका जुड़ी होती है, तो मध्यम और झिल्ली के बीच का अंतर एक बड़े परावर्तन का कारण बनता है जो चरण में थोड़ा स्थानांतरित होता है, जिससे कांच द्वारा परावर्तित प्रकाश में हस्तक्षेप होता है। चूंकि मध्यम-झिल्ली इंटरफेस से परावर्तित प्रकाश का आयाम प्रकीर्णन के कारण कम हो जाता है, इसलिए संलग्न क्षेत्र गहरा दिखाई देगा लेकिन पूरी तरह से काला नहीं होगा। चूँकि नमूने पर केंद्रित प्रकाश का शंकु आपतित प्रकाश के विभिन्न कोणों को जन्म देता है, इसलिए हस्तक्षेप पैटर्न की एक विस्तृत श्रृंखला है। जब पैटर्न 1 से कम तरंग दैर्ध्य (शून्य-क्रम फ्रिंज) से भिन्न होते हैं, तो पैटर्न अभिसरण करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप तीव्रता में वृद्धि होती है। यह 1 से अधिक संख्यात्मक छिद्र वाले उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। आवश्यकताएँ आई. आर. एम. का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि बनाने के लिए, एक सूक्ष्मदर्शी को कम से कम निम्नलिखित तत्वों की आवश्यकता होती हैः 1) एक प्रकाश स्रोत, जैसे कि हैलोजन लैंप, 2) एक ऑप्टिकल फिल्टर (जो तरंग दैर्ध्य की एक छोटी सीमा को पार करता है), और 3) एक बीम स्प्लिटर (जो 50 प्रतिशत परावर्तित करता है और चुनी गई तरंग दैर्ध्य का 50 प्रतिशत संचारित करता है)। प्रकाश स्रोत को उच्च तीव्रता वाले प्रकाश का उत्पादन करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि बीम स्प्लिटर और नमूने से ही बहुत अधिक प्रकाश खो जाएगा। अलग-अलग तरंग दैर्ध्य के परिणामस्वरूप अलग-अलग आई. आर. एम. छवियाँ बनती हैं; बेरेटर-हैन और उनके सहयोगियों ने दिखाया कि उनकी पी. टी. के. 2 कोशिकाओं के लिए, 546 एन. एम. की तरंग दैर्ध्य वाले प्रकाश के परिणामस्वरूप 436 एन. एम. की तरंग दैर्ध्य वाले नीले प्रकाश की तुलना में बेहतर कंट्रास्ट होता है। आई. आर. एम. के मूल सिद्धांत में कई संशोधन किए गए हैं, जिनमें से अधिकांश छवि निर्माण की दक्षता और उपज में वृद्धि करते हैं। बीम स्प्लिटर और नमूने के बीच ध्रुवीकरण और एक चौथाई तरंग प्लेट रखकर, रैखिक ध्रुवीकृत प्रकाश को गोलाकार ध्रुवीकृत प्रकाश में परिवर्तित किया जा सकता है और बाद में रैखिक ध्रुवीकृत प्रकाश में परिवर्तित किया जा सकता है, जिससे प्रणाली की दक्षता बढ़ जाती है। वृत्ताकार ध्रुवीकरण लेख में इस प्रक्रिया पर विस्तार से चर्चा की गई है। इसके अलावा, एक दूसरे ध्रुवीकरण को शामिल करके, जो पहले ध्रुवीकरण की तुलना में 90° घुमाया जाता है, आवारा प्रकाश को डिटेक्टर तक पहुंचने से रोका जा सकता है, जिससे संकेत और शोर का अनुपात बढ़ जाता है (वर्सुएरेन का चित्र 2 देखें)। जैविक अनुप्रयोग जैविक नमूनों का अध्ययन करने के लिए आई. आर. एम. का उपयोग कई तरीकों से किया जा सकता है। तकनीक के उपयोग के प्रारंभिक उदाहरण कोशिका आसंजन और कोशिका प्रवास पर केंद्रित हैं। वेसिकल फ्यूजन हाल ही में, तकनीक का उपयोग क्रोमाफिन कोशिकाओं में एक्सोसाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए किया गया है। जब डी. आई. सी. का उपयोग करके छवि बनाई जाती है, तो क्रोमाफिन कोशिकाएं छोटे प्रोट्रूशन के साथ गोल कोशिकाओं के रूप में दिखाई देती हैं। जब एक ही कोशिका को आई. आर. एम. का उपयोग करके चित्रित किया जाता है, तो कांच पर कोशिका के पदचिह्न को स्पष्ट रूप से छोटे प्रोट्रूशन के साथ एक काले क्षेत्र के रूप में देखा जा सकता है। जब पुटिकाएं झिल्ली के साथ जुड़ती हैं, तो वे काले पदचिह्न (दाहिने पैनल में शीर्ष कोशिका में उज्ज्वल धब्बे) के भीतर छोटे प्रकाश वृत्तों के रूप में दिखाई देती हैं। आई. आर. एम. का उपयोग करके क्रोमाफिन कोशिकाओं में पुटिका संलयन का एक उदाहरण फिल्म 1 में दिखाया गया है। 60 एम. एम. पोटेशियम के साथ उत्तेजना पर, घने कोर दाने के एक्सोसाइटोसिस के परिणामस्वरूप क्रोमाफिन कोशिका के काले पदचिह्न के अंदर कई चमकीले धब्बे दिखाई देने लगते हैं। चूंकि आई. आर. एम. को एक फ्लोरोसेंट लेबल की आवश्यकता नहीं होती है, इसलिए इसे अन्य इमेजिंग तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे कि एपिफ्लोरेसेन्स और टी. आई. आर. एफ. माइक्रोस्कोपी ताकि वेसिकिल एक्सोसाइटोसिस और एंडोसाइटोसिस के साथ प्रोटीन डायनामिक्स का अध्ययन किया जा सके। फ्लोरोसेंट लेबल की कमी का एक अन्य लाभ फोटोटॉक्सिसिटी को कम करना है। संदर्भ आगे पढ़ने के लिए क्वांटिटेटिव रिफ्लेक्शन इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (आर. आई. सी. एम.) इन सॉफ्ट मैटर एंड सेल एडहेशन, लॉरेंट लिमोजिन और खेया सेनगुप्ता, केमफिज़चेम 2009,10,2752-2768। बाहरी लिंक आई. आर. एम. पर अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन निकॉन माइक्रोस्कोपी यू ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों पर रिफ्लेक्टेड कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी वीडियो क्लिप वाले लेख