Hot start PCR
हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. पारंपरिक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पी. सी. आर.) का एक संशोधित रूप है जो कमरे (या ठंडे) तापमान पर गैर-विशिष्ट डी. एन. ए. प्रवर्धन के कारण अवांछित उत्पादों और प्राइमर डाइमर की उपस्थिति को कम करता है। उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए पी. सी. आर. प्रक्रिया के कई बदलाव और संशोधन विकसित किए गए हैं; हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. उनमें से एक है। हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. पारंपरिक पी. सी. आर. के समान सिद्धांतों का पालन करता है-जिसमें यह एकल फंसे हुए टेम्पलेट से डी. एन. ए. को संश्लेषित करने के लिए डी. एन. ए. पोलीमरेज़ का उपयोग करता है। हालांकि, यह अतिरिक्त हीटिंग और पृथक्करण विधियों का उपयोग करता है, जैसे कि उत्पाद की उपज बढ़ाने के साथ-साथ उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए ताक पोलीमरेज़ के बंधन को निष्क्रिय या बाधित करना और ताक पोलीमरेज़ को देर से जोड़ना। विकृतीकरण के बाद प्रतिक्रिया मिश्रण को पूरा करके गैर-विशिष्ट बंधन और प्राइमर डाइमर के प्राइमिंग या गठन को कम किया जाता है। उच्च तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रणों को पूरा करने के कुछ तरीकों में ऐसे संशोधन शामिल हैं जो कम तापमान में डी. एन. ए. पोलीमरेज़ गतिविधि को अवरुद्ध करते हैं, संशोधित डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डी. एन. टी. पी.) का उपयोग, और विकृतीकरण के बाद आवश्यक अभिकर्मकों में से एक का भौतिक जोड़। इन अतिरिक्त विधियों के माध्यम से, हॉट स्टार्ट पीसीआर गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की मात्रा को कम करने में सक्षम है जो स्वाभाविक रूप से कम तापमान के दौरान होता है-जो पारंपरिक पीसीआर के लिए एक समस्या बनी हुई है। ये संशोधन यह सुनिश्चित करने के लिए समग्र रूप से काम करते हैं कि घोल में विशिष्ट एंजाइम निष्क्रिय रहेंगे या इष्टतम एनीलिंग तापमान तक पहुंचने तक बाधित रहेंगे। गैर-विशिष्ट पी. सी. आर. उत्पादों के गठन को रोकने, विशेष रूप से शुरुआती चक्रों में, पी. सी. आर. द्वारा प्रवर्धन की संवेदनशीलता में पर्याप्त वृद्धि होती है। पी. सी. आर. या आर. टी.-पी. सी. आर. के नैदानिक अनुप्रयोगों में यह अत्यंत महत्वपूर्ण है। पृष्ठभूमि पॉलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पी. सी. आर.) एक आणविक जीव विज्ञान तकनीक है जिसका उपयोग विशिष्ट डी. एन. ए. खंडों को परिमाण के कई क्रमों से बढ़ाने के लिए किया जाता है। डी. एन. ए. के विशिष्ट खंडों को तीन प्रक्रियाओं, विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार में प्रवर्धित किया जाता है-जहां डी. एन. ए. स्ट्रैंड को कमरे के तापमान से इष्टतम तापमान तक बढ़ाकर अलग किया जाता है, इससे पहले कि प्राइमर बांधें और पॉलीमरेज़ न्यूक्लियोटाइड्स को टेम्पलेट स्ट्रैंड से संरेखित करें। यह डी. एन. ए. पोलीमरेज़ का उपयोग करता है, जो कम तापमान पर थोड़ा सक्रिय होता है। पारंपरिक पी. सी. आर. में, प्रतिक्रिया मिश्रण कमरे के तापमान पर पूरा होता है, और डी. एन. ए. पोलीमरेज़ गतिविधि के कारण, प्राइमर प्राइमर डायमर या एनियल से डी. एन. ए. बना सकते हैं। पी. सी. आर. प्रक्रिया के दौरान, डी. एन. ए. पोलीमरेज़ बंधे हुए प्राइमर के साथ डी. एन. ए. के किसी भी टुकड़े का विस्तार करेगा, जिससे लक्षित उत्पाद उत्पन्न होंगे लेकिन गैर-विशिष्ट उत्पाद भी उत्पन्न होंगे जो उपज को कम करते हैं। हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. में, कुछ अभिकर्मकों को अलग रखा जाता है जब तक कि मिश्रण को विशिष्ट एनीलिंग तापमान तक गर्म नहीं किया जाता है। यह एनीलिंग समय को कम करता है, जो बदले में गैर-विशिष्ट डीएनए विस्तार की संभावना और विकृतीकरण से पहले गैर-विशिष्ट प्राइमर बंधन के प्रभाव को कम करता है। पारंपरिक पी. सी. आर. में, इष्टतम एनीलिंग तापमान (50-65 डिग्री सेल्सियस) से नीचे के कम तापमान के परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट प्रवर्धन जैसे लक्ष्य संशोधन होते हैं जहां प्राइमर गैर-विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड से जुड़ेंगे। ये गैर-विशिष्ट प्राइमर कॉम्प्लेक्स, जो मिश्रण में अधिक होते हैं, प्राइमर डाइमर और मिस-प्राइमिंग जैसे उप-उत्पादों के संश्लेषण के पीछे का कारण हैं। मिस-प्राइमिंग प्रवर्धन के लिए लक्ष्य अनुक्रमों के साथ सक्रिय रूप से प्रतिस्पर्धा के माध्यम से पीसीआर प्रवर्धन की दक्षता को बहुत बाधित और कम करता है। इसी तरह, प्राइमर डायमर परिसर बनाते हैं जो प्राप्त प्रतिलिपि संख्या प्रवर्धन की मात्रा को कम करते हैं। इसे हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. लागू करके नियंत्रित किया जा सकता है जो इष्टतम तापमान पूरा होने तक प्राइमर एक्सटेंशन को अवरुद्ध करने की अनुमति देता है। हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. में, महत्वपूर्ण अभिकर्मकों (जैसे डी. एन. ए. पोलीमरेज़ और मैग्नीशियम कोफैक्टर्स) को पी. सी. आर. मिश्रण में प्रतिक्रिया करने से रोका जाता है जब तक कि भौतिक पृथक्करण या रासायनिक संशोधनों के माध्यम से इष्टतम तापमान पूरा नहीं हो जाता है। हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. तब भी हो सकता है जब टी. ए. क्यू. पोलीमरेज़ को बाधित/निष्क्रिय किया जाता है या इसके जोड़ में इष्टतम एनीलिंग तापमान तक देरी होती है, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट संशोधनों के माध्यम से या पिंजरे और माध्यमिक संरचना हेरफेर के माध्यम से प्राइमर को संशोधित करके। हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. अक्सर उन परिस्थितियों में पारंपरिक पी. सी. आर. के विपरीत एक बेहतर दृष्टिकोण है जहां प्रतिक्रिया मिश्रण में डी. एन. ए. की कम सांद्रता होती है, डी. एन. ए. टेम्पलेट अत्यधिक जटिल होता है, या यदि पी. सी. आर. में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर के कई जोड़े होते हैं। विधि हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. एक ऐसी विधि है जो उपज हानि को कम करने के लिए गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए कम तापमान पर डी. एन. ए. पोलीमरेज़ के विस्तार को रोकती है। हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. पी. सी. आर. के हीटिंग चरणों तक सीमित अभिकर्मकों के माध्यम से गैर-विशिष्ट बंधन की मात्रा को कम करता है-प्रतिक्रिया में टी. ए. क्यू. डी. एन. ए. पोलीमरेज़ को सीमित करके प्रतिक्रिया को जल्दी सीमित करता है। गैर-विशिष्ट बंधन अक्सर प्राइमर डाइमर और गलत-प्राथमिक/गलत प्राथमिक लक्ष्यों की ओर ले जाता है। इन्हें संशोधित तरीकों के माध्यम से ठीक किया जा सकता है जैसे किः टीक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी/टीक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ एंटीबॉडी के साथ जटिल टी. एन. ए. पोलीमरेज़ का निष्क्रियकरण/अवरोधः एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी टीक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ को निष्क्रिय कर देते हैं। एंटीबॉडीज पोलीमरेज़ से जुड़ते हैं और जुड़ते हैं, जिससे डी. एन. ए. के शीघ्र प्रवर्धन को रोका जा सकता है जो कम तापमान पर हो सकता है। एक बार इष्टतम एनीलिंग तापमान पूरा हो जाने के बाद, एंटीबॉडी क्षीण और विघटित होना शुरू कर देंगे, प्रतिक्रिया में टीएक्यू डीएनए पोलीमरेज़ को जारी करेंगे और प्रवर्धन प्रक्रिया को शुरू करने की अनुमति देंगे। प्लेटिनम टाक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ और एक्यूस्टार्ट टाक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ (दोनों क्रमशः लाइफ टेक्नोलॉजीज और क्वांटा बायोसाइंसेज में अयूब राश्चियन द्वारा विकसित) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी आधारित हॉट स्टार्ट टाक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ के उदाहरण हैं। ये टाक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ टाक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ पूर्व-जटिल हैं। मोम के मोतीः तापमान पर निर्भर मोम के मोतियों द्वारा ताक डी. एन. ए. पोलीमरेज़ और शेष पी. सी. आर. घटकों के बीच एक भौतिक अवरोध बनाया जाता है। एक बार जब तापमान 70 डिग्री सेल्सियस से अधिक बढ़ जाता है, तो पहले चक्र में विकृतीकरण चरण के दौरान, मोम का मोती पिघल जाता है, जिससे ताक डीएनए पोलीमरेज़ बाधा से बच जाता है और प्रतिक्रिया में छोड़ दिया जाता है-प्रवर्धन प्रक्रिया शुरू होती है। इसके बाद मोम की परत प्रवर्धन चरण के दौरान प्रतिक्रिया मिश्रण के शीर्ष पर चली जाती है और बाद में वाष्प अवरोध के रूप में कार्य करती है। अत्यधिक विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइडः ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड न्यूक्लिक एसिड के छोटे पॉलिमर होते हैं जो आसानी से जुड़ जाते हैं। अत्यधिक विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, जैसे कि एप्टामर्स, कम तापमान पर टाक डीएनए पोलीमरेज़ से जुड़ते हैं जिससे यह मिश्रण में निष्क्रिय हो जाता है। केवल उच्च तापमान पर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स टाक से अलग हो जाएंगे जिससे यह प्रतिक्रिया कर पाएगा। ये हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. के लिए सबसे प्रभावी तरीके हैं, एंजाइम से जुड़े एंटीबॉडी और विशेष रूप से अत्यधिक विशिष्ट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड तरीके उन प्रक्रियाओं के दौरान सबसे उपयुक्त हैं जिनके लिए कम निष्क्रियता समय की आवश्यकता होती है। हालांकि, अन्य तरीकों को लागू करने के लिए जाना जाता है जैसे किः टाक डीएनए पोलीमरेज़ प्रीहीटिंग का देर से जोड़ः पीसीआर मशीन को पहले से गर्म किया जाता है जबकि घटकों को बर्फ पर मिलाया जाता है और फिर इष्टतम तापमान तक पहुंचने के बाद तुरंत पीसीआर मशीन में रखा जाता है। यह आवश्यक वार्म-अप प्रक्रिया को समाप्त कर देगा, प्राइमर की गैर-विशिष्ट एनीलिंग को कम करेगा और यह सुनिश्चित करेगा कि मिश्रण में किसी भी मिस पेयर प्राइमर को अलग किया जाए। फ्रीज़िंगः फ्रीज़िंग मोम के मोतियों की तरह शारीरिक अलगाव के रूप में कार्य करता है। प्राइमर, टेम्पलेट स्ट्रैंड, पानी और डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डी. एन. टी. पी.) युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण को टी. ए. क्यू. पोलीमरेज़ से पहले जमाया जाता है और शेष पी. सी. आर. घटकों को जमे हुए मिश्रण के ऊपर मिलाया जाता है। यह गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए कार्य करता है। बाद में ताक का जोड़ः प्रतिक्रिया मिश्रण में पी. सी. आर. के घटकों को ताक के जोड़े बिना तैयार और गर्म किया जाता है। ताक को बाद में मिश्रण में तभी डाला जाता है जब इष्टतम तापमान तक पहुँच जाता है। हालाँकि, यह विधि सबसे कम विश्वसनीय है और घटकों के संदूषण का कारण बन सकती है। एक अन्य विधि डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट मध्यस्थ गर्म प्रारंभ पी. सी. आर. के माध्यम से है जो एक सुरक्षा समूह के माध्यम से न्यूक्लियोटाइड आधारों को संशोधित करता है। डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (डीएनटीपी) संशोधन हॉट स्टार्ट डीएनटीपी को रासायनिक रूप से संशोधित किया जा सकता है ताकि 3 प्रमुख टर्मिनस पर एक गर्मी संवेदनशील सुरक्षा समूह को शामिल किया जा सके। यह संशोधन न्यूक्लियोटाइड्स को ताक पोलीमरेज़ के साथ अंतःक्रिया करने से रोक देगा ताकि वे इष्टतम तापमान तक पहुंचने तक टेम्पलेट स्ट्रैंड से जुड़ सकें, इसलिए गर्मी सक्रियण चरण के दौरान सुरक्षात्मक समूह को हटा दिया जाएगा। हॉट स्टार्ट डी. एन. टी. पी., डी. ए., डी. टी., डी. सी. और डी. जी. प्राकृतिक न्यूक्लियोटाइड्स की जगह लेते हैं। सभी चार संशोधित न्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, हालांकि, पिछले शोध से पता चलता है कि प्राकृतिक न्यूक्लियोटाइड्स में से एक या दो को संशोधित डीएनटीपी के साथ बदलने से यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त होगा कि गैर-विशिष्ट प्रवर्धन न हो। न्यूक्लिक एसिड का एक अन्य रासायनिक संशोधन गर्मी-प्रतिवर्ती सहसंयोजक संशोधन के माध्यम से होता है जो रुचि के टेम्पलेट के लिए प्राइमर के संकरण को बाधित करने का कार्य करता है। ग्वानोसिन अमीनो समूह डी. जी. बनाने के लिए ग्लायोक्सल के साथ अंतःक्रिया करता है। संशोधित प्राइमर द्वितीयक संरचनाः कुछ द्वितीयक संरचना प्राइमर के कार्यों में बाधा डाल सकती है। उदाहरण के लिए, एक हेयरपिन संरचना के साथ ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड एक प्राइमर के रूप में कुशलता से कार्य नहीं कर सकते हैं। हालांकि, एनीलिंग तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण को गर्म करने के बाद प्राइमर एक संरचना परिवर्तन से गुजरेगा जो प्राइमर को इसके बजाय एक रैखिक संरचना बनाने की अनुमति देता है, जो प्राइमर को लक्ष्य खंड से जुड़ने और पीसीआर शुरू करने में सक्षम बनाता है। वास्तव में, हेयरपिन प्राइमर के लिए एक अधिक स्थिर विन्यास है जिसे 'डबल-बबल' प्राइमर कहा जाता है, जो एक हेड टू टेल होमोडिमर विन्यास बनाता है जिसका उपयोग रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन और हॉट-स्टार्ट पीसीआर दोनों के लिए किया जा सकता है। प्रकाश रासायनिक रूप से हटाने योग्य पिंजरेः एक पिंजरे का समूह जो एक सुरक्षा समूह है जो प्रकाश रासायनिक रूप से हटाने योग्य है, जैसे कि पिंजरे में रखे थाइमाइडिन फॉस्फोरामिडाइट्स को एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर में शामिल किया जाता है। यह यूवी विकिरण (365 एनएम) के उपयोग के माध्यम से प्राइमर के कार्य को सक्रिय और निष्क्रिय करने की अनुमति देता है। इसलिए, एनीलिंग तापमान तक पहुँचने के बाद प्राइमर को सक्रिय किया जा सकता है। पी. सी. आर. में मैग्नीशियम के नियंत्रित जोड़ की आवश्यकता होती है और यह एक सह-कारक के रूप में कार्य करता है क्योंकि टी. ए. क्यू. पोलीमरेज़ मैग्नीशियम पर निर्भर है। मैग्नीशियम और फॉस्फेट की सांद्रता को मानक बफर अभिकर्मकों में बढ़ाने से एक मैग्नीशियम अवक्षेप पैदा होता है, जो प्रतिक्रिया के लिए एक गर्म शुरुआत प्रदान करता है क्योंकि थर्मल साइक्लिंग चरण के दौरान डी. एन. ए. पोलीमरेज़ के लिए कोई मैग्नीशियम नहीं होता है। थर्मल साइक्लिंग के दौरान, मैग्नीशियम फिर से घोल में घुल जाएगा और पॉलीमरेज़ के उपयोग के लिए उपलब्ध हो जाएगा जिससे यह सामान्य रूप से कार्य कर सके। लाभ हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. फायदेमंद है क्योंकि इसे कम संभालने की आवश्यकता होती है और संदूषण के जोखिम को कम करता है। हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. या तो रासायनिक रूप से संशोधित या एंटीबॉडी आधारित हो सकता है जो प्रक्रिया को विभिन्न लाभ प्रदान करता है। रासायनिक रूप से संशोधित हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. में, प्रक्रिया को कमरे के तापमान के तहत लिया जा सकता है और पी. सी. आर. प्रक्रिया शुरू होने से पहले प्राइमर को एक दूसरे से जुड़ने से रोकने के साथ-साथ गैर-विशिष्ट प्राइमिंग को सीमित करके प्राइमर-डाइमर के गठन को काफी कम कर देता है। इसी तरह, हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. टेम्पलेट अनुक्रमों के लिए प्राइमर के बंधन को रोकता है जिसमें कम समरूपता होती है जो गलत प्राइमिंग की ओर ले जाती है। यह कठोर परिस्थितियों के कारण विशिष्टता और संवेदनशीलता में भी सुधार कर सकता है, साथ ही लक्षित टुकड़े की उत्पाद उपज में वृद्धि कर सकता है। एंटीबॉडी आधारित हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. में, साइकिलिंग प्रक्रिया के दौरान प्रारंभिक विकृतीकरण चरण के बाद पोलीमरेज़ सक्रिय हो जाता है, इसलिए आवश्यक समय कम हो जाता है। यह एक उच्च विशिष्टता की ओर भी ले जाता है। सीमाएँ इसके फायदों के साथ-साथ, हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. की भी सीमाएँ हैं जिन पर विधि को लागू करने से पहले विचार किया जाना चाहिए। हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. के लिए पारंपरिक पी. सी. आर. के विपरीत लंबे समय तक गर्मी जोड़ने की आवश्यकता होती है, इसलिए, टेम्पलेट डी. एन. ए. क्षतिग्रस्त होने के लिए अधिक संवेदनशील होता है। गर्म करने के समय में वृद्धि का मतलब यह भी है कि प्रक्रिया कुछ प्रक्रियाओं जैसे कि वन ट्यूब, सिंगल बफर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पीसीआर विधि के लिए संगत नहीं है, जिसके लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण से गुजरने के लिए कम तापमान की आवश्यकता होती है। रासायनिक रूप से संशोधित हॉट स्टार्ट पी. सी. आर. में, डी. एन. ए. की प्रवर्धन प्रक्रिया नकारात्मक रूप से प्रभावित हो सकती है, पहला पॉलीमरेज़ को सक्रिय करने के लिए आवश्यक पुनः सक्रियण समय में महत्वपूर्ण वृद्धि के कारण और दूसरा यदि लक्ष्य डी. एन. ए. टेम्पलेट की लंबाई बहुत लंबी है। एंटीबॉडी आधारित प्रक्रियाओं में, प्रत्येक एंजाइम को एक अलग एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है और इसलिए प्रक्रिया को करने की लागत अधिक होती है। इस बात के भी प्रमाण हैं कि कई वाणिज्यिक हॉट स्टार्ट एंजाइमों में वास्तव में विकृतीकरण से पहले कुछ स्तर की गतिविधि होती है, और कुछ आपूर्तिकर्ता इस अवशिष्ट गतिविधि के लिए परीक्षण के बारे में कोई जानकारी प्रदान करते हैं। इसका मतलब है कि हॉट स्टार्ट एंजाइमों के लिए जिम्मेदार लाभों को महसूस नहीं किया जा सकता है, या सबसे अच्छा बैचों या निर्माता के बीच भिन्न होगा। संदर्भ पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया