Optical mapping
ऑप्टिकल मैपिंग डी. एन. ए. के एकल, दागदार अणुओं से क्रमबद्ध, जीनोम-वाइड, उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रतिबंध मानचित्र बनाने की एक तकनीक है, जिसे "ऑप्टिकल मानचित्र" कहा जाता है। किसी जीव के अज्ञात डीएनए के साथ प्रतिबंध एंजाइम स्थलों के स्थान का मानचित्रण करके, परिणामी डीएनए टुकड़ों का स्पेक्ट्रम सामूहिक रूप से उस अनुक्रम के लिए एक अद्वितीय "फिंगरप्रिंट" या "बारकोड" के रूप में कार्य करता है। मूल रूप से 1990 के दशक में डॉ. डेविड सी. श्वार्ट्ज और एनवाईयू में उनकी प्रयोगशाला द्वारा विकसित यह विधि तब से माइक्रोबियल और यूकेरियोटिक जीनोम दोनों के लिए कई बड़े पैमाने पर अनुक्रमण परियोजनाओं की असेंबली प्रक्रिया का अभिन्न अंग रही है। बाद की प्रौद्योगिकियां ऑप्टिकल मानचित्रण बनाने के लिए डी. एन. ए. पिघलने, डी. एन. ए. प्रतिस्पर्धी बंधन या एंजाइमेटिक लेबलिंग का उपयोग करती हैं। प्रौद्योगिकी आधुनिक ऑप्टिकल मैपिंग प्लेटफॉर्म इस प्रकार काम करता हैः जीनोमिक डीएनए लाइस्ड कोशिकाओं से प्राप्त किया जाता है, और ऑप्टिकल मैपिंग के लिए बड़े जीनोमिक अणुओं की "लाइब्रेरी" का उत्पादन करने के लिए यादृच्छिक रूप से कतरित किया जाता है। डी. एन. ए. के एक एकल अणु को बढ़ाया जाता है (या लंबा किया जाता है) और आवेश अंतःक्रियाओं के कारण एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत एक स्लाइड पर रखा जाता है। डी. एन. ए. अणु को अतिरिक्त प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा पचाया जाता है, जो विशिष्ट पाचन स्थलों पर टूट जाते हैं। परिणामी अणु के टुकड़े सतह से जुड़े रहते हैं। दरार स्थलों पर टुकड़े के अंत को पीछे खींचा जाता है (रैखिक डीएनए की लोच के कारण), जिससे सूक्ष्मदर्शी के तहत पहचाने जाने वाले अंतराल निकल जाते हैं। इंटरकेलेटिंग डाई के साथ रंगीन डीएनए टुकड़ों को प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी द्वारा देखा जाता है और एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापकर आकार दिया जाता है। यह एकल अणुओं का एक ऑप्टिकल मानचित्र तैयार करता है। एक आम सहमति, जीनोमिक ऑप्टिकल मानचित्र बनाने के लिए अलग-अलग ऑप्टिकल मानचित्रों को जोड़ा जाता है। ऑप्टिकल मैपिंग प्लेटफॉर्म का इतिहास प्रारंभिक प्रणाली डीएनए अणुओं को एक कवर स्लिप और एक माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच विकसित पिघले हुए अगरोज पर स्थिर किया गया था। डीएनए प्लेसमेंट से पहले रिस्ट्रिक्शन एंजाइम को पिघले हुए अगरोज के साथ पहले से मिश्रित किया गया था और मैग्नीशियम को जोड़ने से दरार पैदा हो गई थी। एक जेल मैट्रिक्स के भीतर स्थिर होने के बजाय आवेशित सतहों का उपयोग करते हुए, डी. एन. ए. अणुओं को एक सकारात्मक आवेशित सतह पर स्थिरविद्युत अंतःक्रियाओं द्वारा स्थान पर रखा गया था। रिज़ॉल्यूशन में इस तरह से सुधार हुआ कि टुकड़े ~ 30 के. बी. से लेकर 800 बी. पी. तक छोटे हो सकते थे। स्वचालित प्रणाली इसमें समानांतर एंजाइमेटिक प्रसंस्करण के लिए एक स्लाइड पर कई एकल अणुओं (जैसे एक माइक्रोएरे) का पता लगाने के लिए एक स्वचालित स्पॉटिंग प्रणाली का विकास और एकीकरण, छवि अधिग्रहण के लिए स्वचालित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, छवियों को संभालने के लिए छवि जुलूस दृष्टि, ऑप्टिकल मानचित्र निर्माण के लिए एल्गोरिदम, बड़ी मात्रा में डेटा को संसाधित करने के लिए क्लस्टर कंप्यूटिंग शामिल है। नैनोकोडिंग तकनीक का उपयोग करने वाली अगली पीढ़ी की प्रणाली ऑप्टिकल मैपिंग में सुधार, जिसे "नैनोकोडिंग" कहा जाता है, में नैनोकॉन्फिनेमेंट्स में लंबे डीएनए अणुओं को फंसाकर थ्रूपुट को बढ़ावा देने की क्षमता है। तुलना अन्य मानचित्रण तकनीक पारंपरिक मानचित्रण तकनीकों पर ओ. एम. का लाभ यह है कि यह डी. एन. ए. टुकड़े के क्रम को संरक्षित करता है, जबकि प्रतिबंध मानचित्रण का उपयोग करके क्रम का पुनर्निर्माण करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, चूंकि नक्शे सीधे जीनोमिक डीएनए अणुओं से बनाए जाते हैं, इसलिए क्लोनिंग या पीसीआर कलाकृतियों से बचा जाता है। हालांकि, प्रत्येक ओ. एम. प्रक्रिया अभी भी गलत सकारात्मक और नकारात्मक साइटों से प्रभावित होती है क्योंकि प्रत्येक अणु में सभी प्रतिबंध साइटों को अलग नहीं किया जाता है और कुछ साइटों को गलत तरीके से काटा जा सकता है। व्यवहार में, एक ही जीनोमिक क्षेत्र के अणुओं से कई ऑप्टिकल मानचित्र बनाए जाते हैं, और सर्वोत्तम सर्वसम्मति मानचित्र निर्धारित करने के लिए एक एल्गोरिथ्म का उपयोग किया जाता है। जीनोम विश्लेषण की अन्य विधियाँ जीनोम के बीच बड़े पैमाने पर जीनोमिक विविधताओं (जैसे इंडेल्स, डुप्लिकेशन, इनवर्जन, ट्रांसलोकेशन) की पहचान करने के लिए विभिन्न प्रकार के दृष्टिकोण हैं। विधियों की अन्य श्रेणियों में माइक्रोएरे, पल्स-फील्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, साइटोजेनेटिक्स और पेयर्ड-एंड टैग का उपयोग करना शामिल है। उपयोग प्रारंभ में, ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली का उपयोग बैक्टीरिया, परजीवी और कवक के संपूर्ण जीनोम प्रतिबंध मानचित्रों के निर्माण के लिए किया गया है। इसका उपयोग बैक्टीरियल जीनोम को तराशने और मान्य करने के लिए भी किया गया है। असेंबली के लिए मचान के रूप में काम करने के लिए, ज्ञात अनुक्रम डेटा का उपयोग करके और उन्हें असेंबल किए गए जीनोमिक ऑप्टिकल मानचित्र के साथ संरेखित करके सिलिको में प्रतिबंध स्थलों के लिए असेंबल किए गए अनुक्रम कोंटिग्स को स्कैन किया जा सकता है। वाणिज्यिक कंपनी, ओपजेन ने माइक्रोबियल जीनोम के लिए ऑप्टिकल मैपिंग प्रदान की है। बड़े यूकेरियोटिक जीनोम के लिए, केवल डेविड सी. श्वार्ट्ज प्रयोगशाला (अब मैडिसन-विस्कॉन्सिन में) ने चूहे, मानव, चावल और मक्के के लिए ऑप्टिकल मानचित्र तैयार किए हैं। ऑप्टिकल अनुक्रमण एक एकल अणु डीएनए अनुक्रमण तकनीक है जो अनुक्रम-दर-संश्लेषण का अनुसरण करती है और ऑप्टिकल मानचित्रण तकनीक का उपयोग करती है। एस. एम. आर. टी. अनुक्रमण जैसे अन्य एकल आणविक अनुक्रमण दृष्टिकोणों के समान, यह तकनीक प्रारंभिक नमूने को बढ़ाने और डी. एन. ए. की कई प्रतियों को अनुक्रमित करने के बजाय एक एकल डी. एन. ए. अणु का विश्लेषण करती है। संश्लेषण के दौरान, फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड्स को डी. एन. ए. पोलीमरेज़ के उपयोग के माध्यम से शामिल किया जाता है और प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी द्वारा ट्रैक किया जाता है। यह तकनीक मूल रूप से 2003 में डेविड सी. श्वार्ट्ज और अरविंद रामनाथन द्वारा प्रस्तावित की गई थी। ऑप्टिकल अनुक्रमण चक्र निम्नलिखित ऑप्टिकल अनुक्रमण प्रक्रिया में प्रत्येक चक्र का एक अवलोकन है। चरण 1: डी. एन. ए. बारकोडिंग कोशिकाओं को जीनोमिक डी. एन. ए. जारी करने के लिए विभाजित किया जाता है। ये डी. एन. ए. अणु अनछुए होते हैं, जिन्हें माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों वाली ऑप्टिकल मानचित्रण सतह पर रखा जाता है और डी. एन. ए. को चैनलों के माध्यम से प्रवाहित होने दिया जाता है। इन अणुओं को फिर ऑप्टिकल मैपिंग की तकनीक के माध्यम से जीनोमिक स्थानीयकरण की अनुमति देने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा बारकोड किया जाता है। उन चरणों के लिए "प्रौद्योगिकी" पर उपरोक्त खंड देखें। चरण 2: टेम्पलेट निकिंग डी. एन. एज़. I को घुड़सवार डी. एन. ए. अणुओं को यादृच्छिक रूप से निक करने के लिए जोड़ा जाता है। इसके बाद डी. एन. एज़. I को हटाने के लिए एक धुलाई की जाती है। प्रति टेम्पलेट होने वाले निक्स की औसत संख्या डी. एन. एज़. I की सांद्रता के साथ-साथ ऊष्मायन समय पर निर्भर करती है। चरण 3: अंतराल निर्माण टी7 एक्सोन्यूक्लीज़ जोड़ा जाता है जो 5 '-3' दिशा में अंतराल का विस्तार करने के लिए डी. एन. ए. अणुओं में निक्स का उपयोग करता है। डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक के अत्यधिक उच्च स्तर से बचने के लिए T7 एक्सोन्यूक्लीज़ की मात्रा को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। चरण 4: फ्लोरोक्रोम निगमन डी. एन. ए. पोलीमरेज़ का उपयोग प्रत्येक डी. एन. ए. अणु के साथ कई गैप्ड साइटों में फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड्स (एफ. डी. एन. टी. पी.) को शामिल करने के लिए किया जाता है। प्रत्येक चक्र के दौरान, प्रतिक्रिया मिश्रण में एक ही प्रकार का एफ. डी. एन. टी. पी. होता है और उस न्यूक्लियोटाइड प्रकार के कई परिवर्धन की अनुमति देता है। इसके बाद इमेजिंग और एफ. डी. एन. टी. पी. जोड़ के अगले चक्र की तैयारी में अनिगमित एफ. डी. एन. टी. पी. को हटाने के लिए विभिन्न धुलाई की जाती है। चरण 5: इमेजिंग यह चरण प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके अंतराल क्षेत्रों में शामिल फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड्स की संख्या को गिनता है। चरण 6: फोटोब्लीचिंग फ्लोरोक्रोम को उत्तेजित करने के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर रोशनी का उपयोग फ्लोरोक्रोम संकेत को नष्ट करने के लिए भी किया जाता है। यह अनिवार्य रूप से फ्लोरोक्रोम काउंटर को रीसेट करता है, और अगले चक्र के लिए काउंटर तैयार करता है। यह चरण ऑप्टिकल अनुक्रमण का एक अनूठा पहलू है क्योंकि यह वास्तव में न्यूक्लियोटाइड के फ्लोरोक्रोम लेबल को इसके समावेश के बाद नहीं हटाता है। फ्लूरोक्रोम लेबल को न हटाने से अनुक्रमण अधिक किफायती हो जाता है, लेकिन इसके परिणामस्वरूप लगातार फ्लूरोक्रोम लेबल को शामिल करने की आवश्यकता होती है जिसके परिणामस्वरूप लेबल की भारी मात्रा के कारण समस्याएं हो सकती हैं। चरण 7: चरणों को दोहराएं 4-6 चरणों को चरण 4 के साथ एक प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग करके दोहराया जाता है जिसमें हर बार एक अलग फ्लोरोक्रोम-लेबल न्यूक्लियोटाइड (एफ. डी. एन. टी. पी.) होता है। इसे तब तक दोहराया जाता है जब तक कि वांछित क्षेत्र अनुक्रमित न हो जाए। अनुकूलन रणनीतियाँ एक उपयुक्त डी. एन. ए. पोलीमरेज़ का चयन आधार संयोजन चरण की दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है और इसे कई मानदंडों को पूरा करना चाहिएः लगातार स्थितियों में एफ. डी. एन. टी. पी. को कुशलता से शामिल करने की क्षमता 3 '-5' एक्सोन्यूक्लीज़ की कमी और नए शामिल किए गए एफ. डी. एन. टी. पी. को हटाने से रोकने के लिए प्रूफरीडिंग गतिविधि गलत संयोजनों को कम करने के लिए उच्च निष्ठा सतहों पर लगे टेम्पलेटों पर अच्छी गतिविधि (जैसे। ऑप्टिकल मानचित्रण सतह) इसके अलावा, विभिन्न फ्लोरोक्रोम के लिए अलग-अलग पोलीमरेज़ वरीयता, फ्लोरोक्रोम-न्यूक्लियोटाइड्स पर लिंकर की लंबाई और बफर संरचनाएं भी महत्वपूर्ण कारक हैं जिन पर आधार जोड़ प्रक्रिया को अनुकूलित करने और लगातार एफ. डी. एन. टी. पी. निगमन की संख्या को अधिकतम करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। लाभ एकल-अणु विश्लेषण चूंकि न्यूनतम डी. एन. ए. नमूने की आवश्यकता होती है, इसलिए नमूना तैयार करने की प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करने के लिए समय लेने वाले और महंगे प्रवर्धन कदम से बचा जाता है। बड़े डी. एन. ए. अणु टेम्पलेट (~ 500 के. बी.) बनाम छोटे डी. एन. ए. अणु टेम्पलेट (<1के. बी.) जबकि अधिकांश अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों का उद्देश्य बड़ी मात्रा में छोटे अनुक्रम पढ़ने हैं, ये छोटे अनुक्रम पढ़ने से डी नोवो अनुक्रमण प्रयासों और जीनोम दोहराव क्षेत्रों को समझना मुश्किल हो जाता है। ऑप्टिकल सीक्वेंसिंग में सीक्वेंसिंग के लिए बड़े डीएनए अणु टेम्प्लेट (~ 500 केबी) का उपयोग किया जाता है और ये छोटे टेम्प्लेट की तुलना में कई फायदे प्रदान करते हैंः इन बड़े डीएनए टेम्प्लेट को विश्वास के साथ उनके जीनोमिक स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए "डीएनए बारकोड" किया जा सकता है। इसलिए, बड़े टेम्पलेट से लिए गए किसी भी अनुक्रम को उच्च स्तर के आत्मविश्वास के साथ जीनोम पर मैप किया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि उच्च दोहराव वाले क्षेत्रों से अनुक्रम पढ़ने को अधिक आत्मविश्वास के साथ रखा जा सकता है, जबकि लघु पढ़ने वाले उच्च दोहराव वाले क्षेत्रों में मानचित्रण अनिश्चितता से पीड़ित होते हैं। एकल-अणु बारकोड को एक संदर्भ जीनोम के साथ संरेखित करने के लिए ऑप्टिकल मैपिंग और नैनोकोडिंग जैसे विशेष एल्गोरिदम और सॉफ्टवेयर विकसित किए गए हैं। एक ही बड़े टेम्पलेट अणु से कई अनुक्रम पढ़ते हैं। ये कई अनुक्रम डी नोवो असेंबली की जटिलता को कम करते हैं, जीनोमिक पुनर्व्यवस्था क्षेत्रों को स्पष्ट करते हैं, और "किसी भी असेंबली त्रुटियों से आंतरिक रूप से मुक्त" होते हैं। अनुक्रम अधिग्रहण के साथ बड़े डी. एन. ए. आणविक टेम्पलेटों की आणविक बारकोडिंग व्यापक और विशिष्ट जीनोमिक विश्लेषण प्रदान करती है नुकसान एकल अणु डी. एन. ए. अनुक्रमण के लिए वर्तमान अगली पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों द्वारा प्रदान किए गए अनावश्यक पठन कवरेज से आत्मविश्वास से मेल खाने के लिए उच्च स्तर की सटीकता की आवश्यकता होती है। अनुक्रम-दर-संश्लेषण के दौरान समान स्थितियों में दोनों तारों पर निक्स के परिणामस्वरूप कम टेम्पलेट होता है। फ्लोरोक्रोम-लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड्स को शामिल करने के बाद नहीं हटाया जाता है और इन भारी लेबलों के कारण, कई संयोजन मुश्किल हो सकते हैं। संदर्भ बाहरी लिंक ऑपजेन ऑप्टिकल मैपिंग सॉल्यूशंस डॉ. डेविड सी. श्वार्ट्ज लैब बायोफिजिक्स जीनोमिक्स तकनीक माइक्रोस्कोपी आणविक जीव विज्ञान