Polony sequencing
पोलनी अनुक्रमण एक सस्ती लेकिन अत्यधिक सटीक मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण तकनीक है जिसका उपयोग समानांतर में लाखों स्थिर डीएनए अनुक्रमों को "पढ़ने" के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक को सबसे पहले हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में डॉ. जॉर्ज चर्च के समूह द्वारा विकसित किया गया था। अन्य अनुक्रमण तकनीकों के विपरीत, पोलनी अनुक्रमण तकनीक स्वतंत्र रूप से डाउनलोड करने योग्य, मुक्त स्रोत सॉफ्टवेयर और प्रोटोकॉल के साथ एक खुला मंच है। इसके अलावा, इस तकनीक के हार्डवेयर को आम तौर पर उपलब्ध एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और कंप्यूटर-नियंत्रित फ्लोसेल/फ्लुइडिक्स सिस्टम के साथ आसानी से स्थापित किया जा सकता है। पोलनी अनुक्रमण आम तौर पर युग्मित-अंत टैग पुस्तकालय पर किया जाता है कि डी. एन. ए. टेम्पलेट का प्रत्येक अणु 135 बी. पी. लंबा होता है जिसमें दो 17-18 बी. पी. युग्मित जीनोमिक टैग अलग होते हैं और सामान्य अनुक्रमों से घिरे होते हैं। इस तकनीक की वर्तमान पढ़ने की लंबाई 26 बेस प्रति एम्प्लिकॉन और 13 बेस प्रति टैग है, जिससे प्रत्येक टैग में 4-5 बेस का अंतर रह जाता है। कार्यप्रवाह पोलनी अनुक्रमण के प्रोटोकॉल को तीन मुख्य भागों में विभाजित किया जा सकता है, जो युग्मित अंत-टैग पुस्तकालय निर्माण, टेम्पलेट प्रवर्धन और डीएनए अनुक्रमण हैं। युग्मित एंड-टैग लाइब्रेरी निर्माण यह प्रोटोकॉल यादृच्छिक रूप से परीक्षण किए गए जीनोमिक डीएनए को एक तंग आकार के वितरण में काटने से शुरू होता है। कतरित डी. एन. ए. अणुओं को फिर अंतिम मरम्मत और ए-टेल्ड उपचार के अधीन किया जाता है। अंतिम मरम्मत उपचार डी. एन. ए. के किसी भी क्षतिग्रस्त या असंगत बाहर निकलने वाले सिरों को 5 '-फॉस्फोरिलेटेड और ब्लंट-एंड डी. एन. ए. में परिवर्तित कर देता है, जो तत्काल ब्लंट-एंड बंधन को सक्षम बनाता है, जबकि ए-टेलिंग उपचार कतरित डी. एन. ए. के 3' अंत में ए जोड़ता है। 1 के. बी. की लंबाई वाले डी. एन. ए. अणुओं का चयन 6 प्रतिशत टी. बी. ई. पेज जेल पर लोड करके किया जाता है। अगले चरण में, डी. एन. ए. अणुओं को टी-टेल्ड 30 बी. पी. लंबे सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (टी30) के साथ वृत्ताकार किया जाता है, जिसमें दो बाहरी-मुखी एम. एम. ई. आई. पहचान स्थल होते हैं, और परिणामस्वरूप वृत्ताकार डी. एन. ए. चक्र प्रतिकृति से गुजरता है। प्रवर्धित वृत्ताकार डी. एन. ए. अणुओं को फिर एम. एम. ई. आई. (प्रकार II के प्रतिबंध एंडोन्यूक्लीज़) के साथ पचाया जाता है जो इसके पहचान स्थल से एक दूरी पर काट देगा, जिससे 17-18 बी. पी. टैग (लंबाई में ≈ 70 बी. पी.) से घिरे टी30 टुकड़े को छोड़ देगा। युग्मित-टैग अणुओं को उनके दोनों सिरों पर ई. पी. सी. आर. (पायस पी. सी. आर.) प्राइमर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (एफ. डी. वी. 2 और आर. डी. वी. 2) के बंधन से पहले अंत-मरम्मत की आवश्यकता होती है। परिणामस्वरूप 135 बी. पी. पुस्तकालय अणुओं को आकार-चयनित और निक अनुवादित किया जाता है। अंत में, पुस्तकालय सामग्री की मात्रा बढ़ाने और एक ही चरण में बाहरी बंधन उत्पादों को समाप्त करने के लिए पी. सी. आर. के साथ 135 बी. पी. युग्मित एंड-टैग लाइब्रेरी अणुओं को प्रवर्धित करें। परिणामी डी. एन. ए. टेम्पलेट में 44 बी. पी. एफ. डी. वी. अनुक्रम, एक 17-18 बी. पी. समीपस्थ टैग, टी30 अनुक्रम, एक 17-18 बी. पी. दूरस्थ टैग और एक 25 बी. पी. आर. डी. वी. अनुक्रम होता है। टेम्पलेट प्रवर्धन इमल्शन पी. सी. आर. मोनो-आकार, पैरामैग्नेटिक स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोती दोहरे बायोटिन फॉरवर्ड प्राइमर के साथ पहले से लोड होते हैं। स्ट्रेप्टाविडिन में बायोटिन के लिए बहुत मजबूत लगाव है, इस प्रकार आगे का प्राइमर मोतियों की सतह पर मजबूती से बंधेगा। इसके बाद, पहले से लोड किए गए मोतियों, पी. सी. आर. मिश्रण, आगे और पीछे के प्राइमर और जोड़ीदार एंड-टैग लाइब्रेरी के साथ एक जलीय चरण तैयार किया जाता है। इसे मिलाया जाता है और पायस बनाने के लिए एक तेल चरण के साथ भंवर बनाया जाता है। आदर्श रूप से, तेल पायस में पानी की प्रत्येक बूंद में एक मनका और टेम्पलेट डी. एन. ए. का एक अणु होता है, जो पी. सी. आर. का प्रदर्शन करके एक मिलीलीटर-पैमाने की मात्रा के भीतर लाखों गैर-अंतःक्रियाशील प्रवर्धन की अनुमति देता है। इमल्शन तोड़ना प्रवर्धन के बाद, पूर्ववर्ती चरण से इमल्शन को आइसोप्रोपेनॉल और डिटर्जेंट बफर (10 एम. एम. ट्रिस पी. एच. 7.5,1 एम. एम. ई. डी. टी. ए. पी. एच. 8.0,100 एम. एम. एन. ए. सी. एल., 1 प्रतिशत (वी/वी) ट्राइटन एक्स-100,1 प्रतिशत (डब्ल्यू/वी) एस. डी. एस.) का उपयोग करके तोड़ा जाता है, जिसके बाद भंवर, अपकेंद्रण और चुंबकीय पृथक्करण की एक श्रृंखला होती है। परिणामस्वरूप समाधान खाली, क्लोनल और गैर-क्लोनल मोतियों का निलंबन है, जो पायस की बूंदों से उत्पन्न होते हैं जिनमें शुरू में क्रमशः शून्य, एक या कई डीएनए टेम्पलेट अणु होते हैं। अगले चरण में प्रवर्धित मनका को समृद्ध किया जा सकता है। मोती संवर्धन प्रवर्धित मोतियों का संवर्धन एक बड़े, कम घनत्व, गैर-चुंबकीय पॉलीस्टीरिन मोतियों के संकरण के माध्यम से प्राप्त किया जाता है जो एक बायोटिनिलेटेड कैप्चर ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (डी. एन. ए. अनुक्रम जो ई. पी. सी. आर. एम्प्लिकन अनुक्रम के पूरक है) के साथ पहले से लोड होते हैं। फिर मिश्रण को प्रवर्धित और अप्रवर्धित मोतियों से मोती परिसर को पकड़ने के लिए अपकेंद्रित किया जाता है। प्रवर्धित, कैप्चर बीड कॉम्प्लेक्स का घनत्व कम होता है और इस प्रकार सुपरनेटेंट में रहेगा जबकि अप्रवर्धित मोती एक गोली बनाते हैं। सुपरनेटेंट को बरामद किया जाता है और NaOH के साथ इलाज किया जाता है जो परिसर को तोड़ देगा। पैरामैग्नेटिक एम्पलीफाइड बीड्स को मैग्नेटिक सेपरेशन द्वारा गैर-मैग्नेटिक कैप्चर बीड्स से अलग किया जाता है। यह संवर्धन प्रोटोकॉल प्रवर्धित मोतियों को पाँच गुना समृद्ध करने में सक्षम है। बीड कैपिंग बीड कैपिंग का उद्देश्य अनएक्सटेंडेड फॉरवर्ड ई. पी. सी. आर. प्राइमर और टेम्पलेट डी. एन. ए. के आर. डी. वी. खंड दोनों के 3 'छोर पर एक "कैपिंग" ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को जोड़ना है। जिस टोपी का उपयोग किया जा रहा है वह एक अमीनो समूह है जो फ्लोरोसेंट जांच को इन सिरों पर जुड़ने से रोकता है और साथ ही, टेम्पलेट डीएनए के बाद के युग्मन को एमिनोसिलेनेटेड फ्लो सेल कवरस्लिप में मदद करता है। कवर्सलिप एरेइंग सबसे पहले, कवर्सलिप को धोया जाता है और एमिनोसिलेन-उपचार किया जाता है, जिससे उस पर टेम्पलेट डीएनए के बाद के सहसंयोजक युग्मन को सक्षम किया जाता है और किसी भी फ्लोरोसेंट संदूषण को समाप्त किया जाता है। प्रवर्धित, समृद्ध मोतियों को एक्रिलामाइड के साथ मिलाया जाता है और टेफ्लॉन-मास्क माइक्रोस्कोप स्लाइड द्वारा बनाए गए उथले मोल्ड में डाला जाता है। तुरंत, एक्रिलामाइड जेल के ऊपर एमिनोसिलेन-उपचारित कवरस्लिप रखें और 45 मिनट के लिए पोलीमराइज़ होने दें। इसके बाद, स्लाइड/कवरस्लिप स्टैक को उल्टा करें और जेल से माइक्रोस्कोप स्लाइड को हटा दें। सिलेन-उपचारित कवरस्लिप जेल से सहसंयोजक रूप से जुड़ेंगे जबकि माइक्रोस्कोप स्लाइड की सतह पर टेफ्लॉन ऐक्रिलामाइड जेल से स्लाइड को बेहतर तरीके से हटाने में सक्षम होगा। कवरस्लिप्स को फिर फ्लो सेल बॉडी से जोड़ा जाता है और किसी भी असंबद्ध मोती को हटा दिया जाता है। डी. एन. ए. अनुक्रमण पोलनी अनुक्रमण का जैव रसायन मुख्य रूप से लिगाज़ और पोलीमरेज़ की भेदभावपूर्ण क्षमताओं पर निर्भर करता है। सबसे पहले, एंकर प्राइमर की एक श्रृंखला को कोशिकाओं के माध्यम से प्रवाहित किया जाता है और 17-18 bp प्रॉक्सिमल या डिस्टल जीनोमिक DNA टैग के तत्काल 3 'या 5' छोर पर सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों में संकरित किया जाता है। इसके बाद, डीजनरेट नॉनमर्स की आबादी के लिए एंकर प्राइमर की एक एंजाइमेटिक बंधन प्रतिक्रिया की जाती है जिन्हें फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया जाता है। भिन्न रूप से लेबल किए गए नॉन-एमरः 5 'Cy5-NNNNNT 5' Cy3-NNNNNNNA 5 'टेक्सस रेड-NNNNNNC 5' 6FAM-NNNNNNG फ्लोरोफोर-टैग किए गए नॉन-एमर्स क्षीण प्राइमर के समान रणनीति के अनुसार टैग अनुक्रमों में अंतर सफलता के साथ एनील करते हैं, लेकिन पॉलीमरेज़ को प्रस्तुत करने के बजाय, नॉन-एमर्स को चुनिंदा रूप से निकटवर्ती DNA-एंकर प्राइमर पर लगा दिया जाता है। फ्लोरोफोर अणु का स्थिरीकरण एक फ्लोरोसेंट संकेत प्रदान करता है जो इंगित करता है कि जीनोमिक डीएनए टैग पर प्रश्न स्थिति में ए, सी, जी, या टी है या नहीं। चार-रंगीन इमेजिंग के बाद, एंकर प्राइमर/नॉनमेर कॉम्प्लेक्स को हटा दिया जाता है और एंकर प्राइमर को बदलकर एक नया चक्र शुरू किया जाता है। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए नॉनमेर्स का एक नया मिश्रण पेश किया गया है, जिसके लिए क्वेरी स्थिति को जीनोमिक डीएनए टैग में एक आधार आगे स्थानांतरित किया जाता है। 5 'साइ5-एन. एन. एन. एन. एन. एन. टी. एन. 5' साइ3-एन. एन. एन. एन. एन. एन. एन. एन. 5 'टेक्सासरेड-एन. एन. एन. एन. एन. एन. एन. एन. 5' 6एफए. एम.-एन. एन. एन. एन. एन. एन. एन. एन. 5 'से 3' दिशा में सात आधार और 3 'छोर से छह आधारों से इस तरह से पूछताछ की जा सकती है। अंतिम परिणाम प्रत्येक टैग के बीच में 4-आधार से 5-आधार अंतराल के साथ प्रति रन 26 आधारों (प्रत्येक युग्मित टैग से 13 आधार) की एक पठनीय लंबाई है। विश्लेषण और सॉफ्टवेयर पोलनी अनुक्रमण प्रति रन लाखों 26 पाठ उत्पन्न करता है और इस जानकारी को सामान्य बनाने और अनुक्रम में परिवर्तित करने की आवश्यकता होती है। ये चर्च लैब द्वारा विकसित किए गए सॉफ्टवेयर द्वारा किए जा सकते हैं। सभी सॉफ्टवेयर मुफ़्त हैं और वेबसाइट से डाउनलोड किए जा सकते हैं। उपकरण इस तकनीक में उपयोग किए जाने वाले अनुक्रमण उपकरण को आम तौर पर उपलब्ध प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और एक कंप्यूटर नियंत्रित फ्लोसेल द्वारा स्थापित किया जा सकता है। 2005 में आवश्यक उपकरणों की कीमत लगभग 130,000 अमेरिकी डॉलर थी। एक समर्पित पोलनी अनुक्रमण मशीन, पोलोनेटर, 2009 में विकसित की गई थी और डोवर द्वारा 170,000 अमेरिकी डॉलर में बेची गई थी। इसमें ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर, अभिकर्मक और प्रोटोकॉल शामिल थे और इसका उद्देश्य व्यक्तिगत जीनोम परियोजना में उपयोग करना था। शक्ति और कमजोरियां पोलनी अनुक्रमण एक सामान्य रूप से उपलब्ध, सस्ते उपकरण के आधार पर डी. एन. ए. अनुक्रमण की उच्च प्रवाह क्षमता और उच्च सर्वसम्मति सटीकता की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह एक बहुत ही लचीली तकनीक है जो बी. ए. सी. (बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्र) और बैक्टीरियल जीनोम अनुक्रमण के साथ-साथ एस. ए. जी. ई. (जीन अभिव्यक्ति का क्रमिक विश्लेषण) टैग और बारकोड अनुक्रमण सहित परिवर्तनशील अनुप्रयोग को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, पोलनी अनुक्रमण तकनीक पर एक खुली प्रणाली के रूप में जोर दिया जाता है जो विकसित किए गए सॉफ्टवेयर, प्रोटोकॉल और अभिकर्मकों सहित सब कुछ साझा करती है। हालाँकि, हालांकि कच्चे डेटा अधिग्रहण को 786 गीगाबिट तक प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन एकत्र किए गए 10,000 बिट्स में से केवल 1 बिट जानकारी उपयोगी है। इस तकनीक की एक और चुनौती व्यक्तिगत लक्ष्यों के सापेक्ष प्रवर्धन की एकरूपता है। गैर-समान प्रवर्धन अनुक्रमण की दक्षता को कम कर सकता है और इस तकनीक में सबसे बड़ी बाधा के रूप में पोस्ट किया जा सकता है। पोलनी अनुक्रमण 1990 और 2000 के दशक के अंत से पोलनी तकनीक का एक विकास है। 2003 में एकल-आधार विस्तार का उपयोग करके सीटू पोलोनी में अनुक्रम करने के लिए तरीके विकसित किए गए थे जो 5-6 आधार रीड प्राप्त कर सकते थे। 2005 तक, मौजूदा पोलनी अनुक्रमण तकनीक को विकसित करने के लिए इन शुरुआती प्रयासों में सुधार किया गया था। पोलनी अनुक्रमण की अत्यधिक समानांतर अनुक्रमण-दर-बंधन अवधारणाओं ने ए. बी. आई. सॉलिड अनुक्रमण जैसी बाद की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के लिए आधार का योगदान दिया है। संदर्भ बाहरी लिंक डीएनए अनुक्रमण विधियाँ आनुवंशिकी तकनीकें