Combined bisulfite restriction analysis
સંયુક્ત બિસલ્ફાઇટ પ્રતિબંધ વિશ્લેષણ (અથવા કોબ્રા) એ એક મોલેક્યુલર બાયોલોજી તકનીક છે જે જીનોમિક ડીએનએના નાના નમૂનામાં ડીએનએ ક્રમ પર ચોક્કસ જીનોમિક લોકસ પર ડીએનએ મિથાઇલેશન સ્તરોના સંવેદનશીલ પ્રમાણ માટે પરવાનગી આપે છે. આ તકનીક બાયસલ્ફાઇટ અનુક્રમણિકાની વિવિધતા છે, અને પ્રતિબંધ પાચન સાથે બાયસલ્ફાઇટ રૂપાંતરણ આધારિત પોલિમરેઝ સાંકળ પ્રતિક્રિયાને જોડે છે. મૂળરૂપે માઇક્રોડિસેક્ટેડ પેરાફિન-એમ્બેડેડ પેશીઓના નમૂનાઓમાંથી સૂક્ષ્મ માત્રામાં જીનોમિક ડીએનએને વિશ્વસનીય રીતે નિયંત્રિત કરવા માટે વિકસાવવામાં આવી હતી, ત્યારથી આ તકનીકનો કેન્સર સંશોધન અને એપિજેનેટિક્સ અભ્યાસોમાં વ્યાપક ઉપયોગ જોવા મળ્યો છે. પ્રોસિજર બિસલ્ફાઇટ ટ્રીટમેન્ટ રસના જીનોમિક ડીએનએની સારવાર સોડિયમ બિસલ્ફાઇટ સાથે કરવામાં આવે છે, જે મિથાઇલેશન-આધારિત અનુક્રમ તફાવતો રજૂ કરે છે. સોડિયમ બાયસલ્ફાઇટ સારવાર દરમિયાન, અનમિથાઇલેટેડ સાયટોસિન અવશેષો યુરેસિલમાં રૂપાંતરિત થાય છે, જ્યારે મિથાઇલેટેડ સાયટોસિન અવશેષો અપ્રભાવિત હોય છે. પી. સી. આર. એમ્પ્લીફિકેશન બિસલ્ફાઇટ સારવાર કરાયેલ ડી. એન. એ. પછી પી. સી. આર. એમ્પ્લીફાય થાય છે, જેના પરિણામે મૂળ રીતે મિથાઇલેટેડ સ્થિતિ પર સાયટોસિન અવશેષો અને મૂળ રીતે અનમિથાઇલેટેડ સ્થિતિ (જે યુરેસિલમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા) પર થાઇમિન અવશેષો થાય છે. આ તબક્કા દરમિયાન ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાઇમરમાં સી. પી. જી. સાઇટ્સ (સાયટોસિન મિથાઇલેશનનું સામાન્ય લક્ષ્ય) હોતું નથી, તેથી એમ્પ્લીફિકેશન પ્રક્રિયા મિથાઇલેશનની સ્થિતિના આધારે નમૂનાઓ વચ્ચે ભેદભાવ કરતી નથી. આગામી તબક્કામાં સંપૂર્ણ પાચન સુનિશ્ચિત કરવા માટે પી. સી. આર. ઉત્પાદનોને શુદ્ધ કરવામાં આવે છે. પ્રતિબંધ પાચન ઉપરોક્ત પગલાંઓ મિથાઇલેશન આધારિત જાળવણી અથવા સી. પી. જી. ધરાવતા પ્રતિબંધ ઉત્સેચક સ્થળોની ખોટ તરફ દોરી જાય છે, જેમ કે ટી. એ. ક્યુ. આઈ. (ટી. સી. જી. એ.) અને બી. એસ. ટી. યુ. આઈ. (સી. જી. સી. જી.) માટે, તે અનુક્રમે સાયટોસિન અવશેષો મૂળરૂપે મિથાઇલેટેડ હતા કે નહીં તેના આધારે છે. ઉપરોક્ત પગલામાં મિથાઇલેશન-સ્વતંત્ર એમ્પ્લીફિકેશનને કારણે, પરિણામી પી. સી. આર. ઉત્પાદનો એવા ટુકડાઓની મિશ્ર વસ્તી હશે કે જેમણે સી. પી. જી. ધરાવતા પ્રતિબંધ એન્ઝાઇમ સાઇટ્સ ગુમાવ્યા છે અથવા જાળવી રાખ્યા છે, જેમની સંબંધિત ટકાવારી નમૂના ડીએનએમાં ડીએનએ મિથાઇલેશનના મૂળ સ્તર સાથે સીધી રીતે સંકળાયેલી હશે. પછી પી. સી. આર. ઉત્પાદનોની સારવાર પ્રતિબંધ ઉત્સેચક (દા. ત.) સાથે કરવામાં આવે છે. બી. એસ. ટી. યુ. આઈ.), જે મૂળ રીતે મિથાઈલેટેડ (સી. જી. સી. જી.) હોય તેવી સાઇટોને જ વિભાજિત કરશે, જ્યારે મૂળ રીતે અનમીથાઈલેટેડ (ટી. જી. ટી. જી.) હોય તેવી સાઇટોને છોડી દેશે. તમામ સી. પી. જી. સાઇટ્સ મૂળરૂપે મિથાઇલેટેડ હોવાને કારણે જાળવી રાખવામાં આવે છે તેની ખાતરી કરવા માટે, અને અપૂર્ણ બાયસલ્ફાઇટ રૂપાંતરણના અવશેષને બદલે, એચ. એસ. પી. 92II જેવા ઉત્સેચકો સાથે નિયંત્રણ પાચન કરવામાં આવે છે, જે અનુક્રમ સી. એ. ટી. જી. ને ઓળખે છે, જેમાંથી કોઈ પણ બાયસલ્ફાઇટ રૂપાંતરણ પછી બાકી રહેવું જોઈએ નહીં (બિન-સી. પી. જી. મિથાઇલેશનના દુર્લભ અપવાદ સાથે) અને આમ જો બાયસલ્ફાઇટ રૂપાંતરણ પૂર્ણ થયું હોય તો કોઈ ક્લેવેજ થવો જોઈએ નહીં. માત્રાત્મકતા પછી પચેલા ટુકડાઓને પોલિઆક્રિલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ દ્વારા અલગ કરવામાં આવે છે, જેમાં એક મોટા અપચાયેલા ટુકડાને અનુરૂપ બેન્ડના અપેક્ષિત દેખાવ અને પચેલા ટુકડાઓને અનુરૂપ બહુવિધ નાના બેન્ડ હોય છે. આ બેન્ડમાં ડીએનએની માત્રાત્મક માત્રા ફોસ્ફોઇમેજર જેવા ઉપકરણ દ્વારા નક્કી કરી શકાય છે, જેના પછી મૂળ નમૂનાની મિથાઇલેશન ટકાવારીની ગણતરી આ રીતે કરી શકાય છેઃ ઉપયોગ અને ઉપયોગો કોબ્રાનો ઉપયોગ ઘણા સંશોધન-આધારિત કાર્યક્રમોમાં વ્યાપકપણે કરવામાં આવ્યો છે જેમ કે કેન્સરના અભ્યાસોમાં જનીન પ્રવર્તકો પર ડીએનએ મિથાઇલેશન ફેરફારો માટે સ્ક્રીનીંગ, છાપેલા જનીનો પર બદલાયેલી મિથાઇલેશન પેટર્ન શોધવી અને સસ્તન પ્રાણીઓમાં વિકાસ દરમિયાન જિનોમમાં મિથાઇલેશન પેટર્નની લાક્ષણિકતા. દવામાં, કોબ્રાનો ઉપયોગ અસામાન્ય ડીએનએ મિથાઇલેશન સાથે સંકળાયેલા માનવ રોગના નિદાનમાં મદદ કરવા માટે એક સાધન તરીકે કરવામાં આવે છે. સંશોધકોએ આનુવંશિક ઇમ્પ્રિન્ટિંગ ડિસઓર્ડર રસેલ-સિલ્વર સિન્ડ્રોમના નિદાનમાં ઉચ્ચ પ્રદર્શન પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફીને ડિનેચર કરવા સાથે કોબ્રાનો ઉપયોગ કર્યો હતો, જ્યાં 50 ટકા દર્દીઓમાં આ ડિસઓર્ડર માટે ઇમ્પ્રિન્ટેડ જનીન એચ19નું હાયપોમેથાઇલેશન જવાબદાર છે. શક્તિઓ સરળ, ઝડપી અને સસ્તીઃ કોબ્રામાં, બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગની જેમ, શ્રમસાધ્ય પેટા-ક્લોનિંગ અને સિક્વન્સિંગની જરૂર વગર ડીએનએ મિથાઇલેશનનું સ્તર સરળતાથી અને ઝડપથી માપવામાં આવે છે. પરીક્ષણ સીધું છે અને પ્રમાણભૂત સસ્તા મોલેક્યુલર બાયોલોજી રીએજન્ટ્સ સાથે કરી શકાય છે. ઉચ્ચ સુસંગતતાઃ પી. સી. આર. અને શુદ્ધિકરણના પગલાંઓને કારણે, આ પદ્ધતિ માત્ર ખૂબ જ ઓછી માત્રામાં જીનોમિક ડી. એન. એ. સાથે કામ કરતી નથી, પરંતુ પેરાફિન સાથે સારવાર કરાયેલા નમૂનાઓ સાથે પણ કામ કરે છે, જે બંને અન્ય ડી. એન. એ. મિથાઇલેશન ક્વોન્ટિફિકેશન પ્રોટોકોલમાં સમસ્યાઓ હોઈ શકે છે જેમ કે સધર્ન બ્લોટિંગ અને મિથાઇલેશન-સેન્સિટિવ રીસ્ટ્રિકશન એન્ઝાઇમ પાચન પછી પી. સી. આર. માત્રાત્મકઃ આ મિથાઇલેશન-વિશિષ્ટ પી. સી. આર. થી વિપરીત છે, જે ગુણાત્મક છે. કોબ્રા સાથે, ડીએનએ મિથાઇલેશનના સ્તરને આપેલ સ્થાન પર સીધા જ પ્રમાણિત કરી શકાય છે, જે પરીક્ષણ દીઠ વધુ માહિતી આપે છે. ઉચ્ચ-થ્રુપુટ નમૂના પ્રક્રિયા માટે માપનીયતાઃ કોબ્રા સાથે, રસના ઘણા પ્રદેશોને સમાન પ્રતિબંધ એન્ઝાઇમ સાથે પચાવવામાં આવેલા અલગ નમૂનાઓમાં સમાંતર પ્રક્રિયા કરી શકાય છે. આ બાયસલ્ફાઇટ અનુક્રમણિકા વિશ્લેષણથી વિપરીત છે, જ્યાં દરેક પ્રદેશની લોકસ દીઠ ઘણા ક્લોનને અનુક્રમિત કરીને સખત તપાસ કરવાની જરૂર છે, જેમાં વધુ સમય લાગે છે. પરીક્ષણ દીઠ બહુવિધ પ્રશ્નોઃ એક જ પાચન પરીક્ષણમાં બહુવિધ સી. પી. જી. ધરાવતા પ્રતિબંધ સ્થળો પર મિથાઇલેશનની સ્થિતિની પૂછપરછ કરી શકાય છે. નબળાઈઓ પરીક્ષણ રસના ક્ષેત્રમાં હાલની પ્રતિબંધ સાઇટ્સનો ઉપયોગ કરવા સુધી મર્યાદિત છે, અને મિથાઇલેશન કે જે ચોક્કસ પ્રતિબંધ સાઇટના સંદર્ભમાં થતું નથી તેનું પરીક્ષણ કરવામાં આવશે નહીં. પી. સી. આર. પછી પ્રતિબંધ ઉત્સેચકો દ્વારા અપૂર્ણ પાચન વિશ્લેષણને ગૂંચવી શકે છેઃ અપૂર્ણ પાચન ડીએનએ મિથાઇલેશનનો અભાવ સૂચવે છે (જો એચ. પી. એ. આઈ. આઈ. જેવા મિથાઇલેશન-સંવેદનશીલ એન્ઝાઇમ સાથે કાપવામાં આવે તો). તે પણ જાણીતું છે કે BstUI બિનપરિવર્તિત સ્થળો પર કાપ મૂકી શકે છે, જે મિથાઇલેશન સ્તરોના વધુ પડતા અંદાજ તરફ દોરી જાય છે અને તેથી ઘણીવાર HPAII નો ઉપયોગ જરૂરી છે. જટિલ નમૂનાઓમાં, કોષ-પ્રકારની વિજાતીયતા વિશ્લેષણને ગૂંચવી શકે છે કારણ કે ડીએનએને અનુક્રમિત કરવામાં આવતું નથી, નમૂનામાં વિવિધ કોષોમાંથી અનુક્રમમાં વિજાતીયતા (એટલે કે. ગાંઠની અંદર વિવિધ કોષોની વસ્તી) કે જેમણે પૂછપરછ કરાયેલા પ્રદેશમાં પરિવર્તન પ્રાપ્ત કર્યું છે, જેમ કે સી. જી. ડિન્યુક્લિયોટાઇડને સી. એ. અથવા સી. ટી. માં બદલવું, પાચનના અભાવને કારણે દેખીતી રીતે મિથાઇલેટેડ પ્રદેશને જન્મ આપતા પ્રતિબંધ સ્થળની ખોટમાં પરિણમશે. આ આપેલ નમૂનામાં ડીએનએ મિથાઇલેશન સ્તરોના પ્રમાણને તિરાડ કરશે. વૈકલ્પિક સામાન્ય રીતે, કોબ્રા ઘણીવાર અન્ય ડીએનએ મિથાઇલેશન વિશ્લેષણ સાથે જોડાય છે અને રસના સ્થાનની પ્રારંભિક તપાસમાં તેનો વારંવાર ઉપયોગ થાય છે. જો કોબ્રા ફેરફાર કરેલ મિથાઇલેશન પેટર્ન સૂચવે છે, તો પછી વધુ સખત, શ્રમ-સઘન તકનીકો લાગુ કરી શકાય છે, જેમ કે બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ અથવા એમ. ઇ. ડી. આઈ. પી. ડીએનએ મિથાઇલેશન શોધવા માટે પેકબાયો સિક્વન્સિંગનો પણ ઉપયોગ કરી શકાય છે. સંદર્ભો મોલેક્યુલર બાયોલોજી તકનીકો