Transmission electron microscopy DNA sequencing
ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ એ સિંગલ-મોલેક્યુલ સિક્વન્સિંગ ટેકનોલોજી છે જે ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી તકનીકોનો ઉપયોગ કરે છે. આ પદ્ધતિની કલ્પના અને વિકાસ 1960 અને 70 ના દાયકામાં કરવામાં આવ્યો હતો, પરંતુ જ્યારે નમૂનાને નુકસાનની હદ ઓળખવામાં આવી ત્યારે તેની તરફેણ ગુમાવી દેવામાં આવી હતી. ડીએનએને ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ સ્પષ્ટ રીતે જોવા માટે, તેને ભારે અણુઓ સાથે લેબલ કરવું આવશ્યક છે. વધુમાં, વિશિષ્ટ ઇમેજિંગ તકનીકો અને વિચલન સુધારેલ ઓપ્ટિક્સ લેબલ થયેલ ડીએનએ પરમાણુની છબી બનાવવા માટે જરૂરી રીઝોલ્યુશન મેળવવા માટે ફાયદાકારક છે. સિદ્ધાંતમાં, ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ અત્યંત લાંબી વાંચન લંબાઈ પ્રદાન કરી શકે છે, પરંતુ ઇલેક્ટ્રોન બીમના નુકસાનનો મુદ્દો હજુ પણ રહી શકે છે અને આ તકનીક હજુ સુધી વ્યાવસાયિક રીતે વિકસાવવામાં આવી નથી. જેમ્સ વોટસન અને ફ્રાન્સિસ ક્રિક દ્વારા ડીએનએની રચનાનું અનુમાન લગાવ્યાના થોડા વર્ષો પછી, અને ફ્રેડરિક સેંગરે ઝડપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ માટેની પ્રથમ પદ્ધતિ પ્રકાશિત કર્યાના લગભગ બે દાયકા પહેલાં, અમેરિકન ભૌતિકશાસ્ત્રી રિચાર્ડ ફેનમેને ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપની એવી સાધન તરીકે કલ્પના કરી હતી જે એક દિવસ જીવવિજ્ઞાનીઓને "ડીએનએ સાંકળમાં પાયાના ક્રમને જોવાની" મંજૂરી આપશે. ફેનમેન માનતા હતા કે જો ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપને પૂરતો શક્તિશાળી બનાવી શકાય, તો ડીએનએ સહિત કોઈપણ અને તમામ રાસાયણિક સંયોજનોની અણુ રચનાની કલ્પના કરવી શક્ય બનશે. 1970માં, આલ્બર્ટ ક્રેવેએ સ્કેનીંગ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપમાં હાઇ-એંગલ એન્યુલર ડાર્ક-ફિલ્ડ ઇમેજિંગ (એચએએડીએફ) ઇમેજિંગ તકનીક વિકસાવી હતી. આ તકનીકનો ઉપયોગ કરીને, તેમણે પાતળા આકારહીન કાર્બન ફિલ્મો પર વ્યક્તિગત ભારે અણુઓની કલ્પના કરી. 2010 માં ક્રિવનેક અને તેમના સાથીઓએ એચએએડીએફ પદ્ધતિમાં કેટલાક તકનીકી સુધારાઓની જાણ કરી હતી, જેમાં વિચલન સુધારેલા ઇલેક્ટ્રોન ઓપ્ટિક્સ અને નીચા પ્રવેગક વોલ્ટેજના સંયોજનનો સમાવેશ થાય છે. બાદમાં જૈવિક પદાર્થોના ઇમેજિંગ માટે નિર્ણાયક છે, કારણ કે તે બીમ દ્વારા નુકસાનને ઘટાડવા અને પ્રકાશ અણુઓ માટે ઇમેજ કોન્ટ્રાસ્ટને વધારવાની મંજૂરી આપે છે. પરિણામે, બોરોન નાઇટ્રાઇડ મોનોલેયરમાં એક અણુ અવેજીની છબી બનાવી શકાય છે. રાસાયણિક અને ફ્લોરોસન્ટ સિક્વન્સિંગ તકનીકોની સંખ્યાબંધ શોધ છતાં, ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી હજુ પણ સિંગલ-મોલેક્યુલ ડીએનએ સિક્વન્સિંગ કરવાના સાધન તરીકે શોધવામાં આવી રહી છે. ઉદાહરણ તરીકે, 2012 માં હાર્વર્ડ યુનિવર્સિટી, યુનિવર્સિટી ઓફ ન્યૂ હેમ્પશાયર અને ઝેડએસ જિનેટિક્સના વૈજ્ઞાનિકો વચ્ચેના સહયોગથી આ તકનીકનો ઉપયોગ કરીને ડીએનએના લાંબા ક્રમને વાંચવાની ક્ષમતા દર્શાવવામાં આવી હતી, જો કે ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તકનીક હજુ પણ વ્યાવસાયિક રીતે ઉપલબ્ધ નથી. સિદ્ધાંત ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપમાં 100 પી. એમ. સુધી રિઝોલ્યુશન મેળવવાની ક્ષમતા હોય છે, જેમાં માઇક્રોસ્કોપિક બાયોમોલેક્યુલ્સ અને માળખાઓ જેમ કે વાયરસ, રાઇબોસોમ્સ, પ્રોટીન, લિપિડ્સ, નાના અણુઓ અને એક અણુનું પણ નિરીક્ષણ કરી શકાય છે. ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપ દ્વારા અવલોકન કરવામાં આવે ત્યારે ડીએનએ દેખાય છે, તેમ છતાં, મેળવેલ છબીનું રિઝોલ્યુશન વ્યક્તિગત પાયાના ક્રમને સમજવા માટે પૂરતું ઊંચું નથી, એટલે કે, ડીએનએ સિક્વન્સિંગ. જો કે, ભારે અણુઓ અથવા ધાતુઓ સાથે ડીએનએ પાયાના વિભેદક લેબલિંગ પર, વ્યક્તિગત પાયા વચ્ચે કલ્પના અને તફાવત બંને શક્ય છે. તેથી, વિભેદક ભારે અણુ ડીએનએ લેબલિંગ સાથે જોડાણમાં ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ તેનો ક્રમ નક્કી કરવા માટે ડીએનએની સીધી છબી બનાવવા માટે થઈ શકે છે. વર્કફ્લો પગલું 1-ડીએનએ વિકૃતિકરણ પ્રમાણભૂત પોલિમરેઝ સાંકળ પ્રતિક્રિયા (પી. સી. આર.) ની જેમ, લેબલવાળા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ સાથે બીજા સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ કરી શકાય તે પહેલાં અનુક્રમિત કરવા માટેના ડબલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ પરમાણુઓને વિકૃતિકરણ કરવું આવશ્યક છે. પગલું 2-ભારે અણુ લેબલિંગ જૈવિક અણુઓ (સી, એચ, એન, ઓ, પી, એસ) બનાવતા તત્વો ખૂબ હળવા (નીચા અણુ નંબર, ઝેડ) હોય છે જેને ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા વ્યક્તિગત અણુ તરીકે સ્પષ્ટ રીતે જોવામાં આવે છે. આ સમસ્યાને અવગણવા માટે, ડીએનએ પાયાને ભારે અણુઓ (ઉચ્ચ ઝેડ) સાથે લેબલ કરી શકાય છે. દરેક ન્યુક્લિયોટાઇડને લાક્ષણિક ભારે લેબલ સાથે ટેગ કરવામાં આવે છે, જેથી તેમને ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફમાં અલગ કરી શકાય. ઝેડએસ જિનેટિક્સ ત્રણ ભારે લેબલનો ઉપયોગ કરવાની દરખાસ્ત કરે છેઃ બ્રોમિન (ઝેડ = 35), આયોડિન (ઝેડ = 53), અને ટ્રાઇક્લોરોમિથેન (કુલ ઝેડ = 63). આ માઇક્રોગ્રાફ પર વિભેદક શ્યામ અને હળવા ફોલ્લીઓ તરીકે દેખાશે, અને ચોથો ડીએનએ આધાર લેબલ વગરનો રહેશે. હેલસિઓન મોલેક્યુલર, ટોસ્ટે જૂથ સાથે મળીને, દરખાસ્ત કરે છે કે પ્યુરિન અને પાયરિમિડીન પાયાને અનુક્રમે પ્લેટિનમ ડાયમાઇન અથવા ઓસ્મિયમ ટેટ્રાઓક્સાઇડ બાયપાઇરિડિન સાથે કાર્યરત કરી શકાય છે. ઓસ્મિયમ (ઝેડ = 76), ઇરિડિયમ (ઝેડ = 77), સોનું (ઝેડ = 79), અથવા યુરેનિયમ (ઝેડ = 92) જેવા ભારે ધાતુના અણુઓ પછી વ્યક્તિગત પાયાને લેબલ કરવા માટે આ કાર્યાત્મક જૂથો સાથે ધાતુ-ધાતુના બંધ બનાવી શકે છે. પગલું 3-સબસ્ટ્રેટ પર ડીએનએ સંરેખણ ડીએનએ પરમાણુઓને પાતળા, નક્કર સબસ્ટ્રેટ પર ખેંચવા જોઈએ જેથી ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ પર લેબલ કરેલા પાયાનો ક્રમ સ્પષ્ટ રીતે દેખાશે. મોલેક્યુલર કોમ્બિંગ એ એક એવી તકનીક છે જે ડીએનએ અણુઓને વિસ્તારવા માટે ઘટતા હવા-પાણીના આંતરપૃષ્ઠના બળનો ઉપયોગ કરે છે, જે તેમને સૂકાયા પછી સિલેન સ્તર સાથે અપરિવર્તનીય રીતે બંધાયેલ રાખે છે. આ એક એવું માધ્યમ છે જેના દ્વારા નક્કર સબસ્ટ્રેટ પર ડીએનએનું સંરેખણ પ્રાપ્ત કરી શકાય છે. પગલું 4-TEM ઇમેજિંગ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (TEM) ખૂબ જ પાતળા નમૂનામાંથી ઇલેક્ટ્રોનની બીમ પસાર કરીને ઉચ્ચ વિસ્તૃતીકરણ, ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન છબીઓ ઉત્પન્ન કરે છે. જ્યારે અણુ રીઝોલ્યુશન પરંપરાગત TEM સાથે દર્શાવવામાં આવ્યું છે, ત્યારે અવકાશી રીઝોલ્યુશનમાં વધુ સુધારણાને માઇક્રોસ્કોપ લેન્સના ગોળાકાર અને રંગીન વિચલનોને સુધારવાની જરૂર છે. આ માત્ર સ્કેનીંગ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપીમાં જ શક્ય બન્યું છે જ્યાં કેથોડ રે ટ્યુબ જેવી જ રીતે બારીક કેન્દ્રિત ઇલેક્ટ્રોન બીમ સાથે ઑબ્જેક્ટને સ્કેન કરીને છબી મેળવવામાં આવે છે. જો કે, રિઝોલ્યુશનમાં પ્રાપ્ત થયેલ સુધારો અભ્યાસ કરાયેલ પદાર્થના કિરણોત્સર્ગ સાથે ઘણી ઊંચી બીમ તીવ્રતા, સહવર્તી નમૂનાને નુકસાન અને સંકળાયેલ ઇમેજિંગ કલાકૃતિઓ સાથે આવે છે. નમૂનામાં ભારે અથવા હળવા અણુઓ છે કે કેમ તેના આધારે વિવિધ ઇમેજિંગ તકનીકો લાગુ કરવામાં આવે છેઃ કુંડલાકાર ડાર્ક-ફિલ્ડ ઇમેજિંગ ઇલેક્ટ્રોનના સ્કેટરિંગને માપે છે કારણ કે તેઓ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી નમૂનામાં અણુઓના કેન્દ્રને વિક્ષેપિત કરે છે. આ ભારે અણુઓ ધરાવતા નમૂનાઓ માટે શ્રેષ્ઠ અનુકૂળ છે, કારણ કે તેઓ ઇલેક્ટ્રોનના વધુ સ્કેટરિંગનું કારણ બને છે. આ તકનીકનો ઉપયોગ અણુઓને બોરોન, નાઇટ્રોજન અને કાર્બન જેવા પ્રકાશ તરીકે દર્શાવવા માટે કરવામાં આવ્યો છે; જો કે, આવા પ્રકાશ પરમાણુઓ માટે સંકેત ખૂબ જ નબળો છે. જો એન્યુલર ડાર્ક-ફિલ્ડ માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ માટે કરવામાં આવે, તો ડીએનએ બેઝને ભારે અણુઓ સાથે લેબલ કરવું ચોક્કસપણે જરૂરી રહેશે જેથી મજબૂત સંકેત શોધી શકાય. કુંડલાકાર તેજસ્વી-ક્ષેત્ર ઇમેજિંગ નમૂના દ્વારા સીધા પ્રસારિત ઇલેક્ટ્રોનને શોધી કાઢે છે, અને અણુ કેન્દ્રક સાથેની તેમની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા ઉત્પન્ન તરંગ હસ્તક્ષેપને માપે છે. આ તકનીક કુંડલાકાર શ્યામ-ક્ષેત્ર ઇમેજિંગ પદ્ધતિઓ કરતાં વધુ સંવેદનશીલતા ધરાવતા પ્રકાશ પરમાણુઓને શોધી શકે છે. હકીકતમાં, સ્ફટિકીય ઘન પદાર્થોમાં ઓક્સિજન, નાઇટ્રોજન, લિથિયમ અને હાઇડ્રોજનને કુંડલાકાર તેજસ્વી-ક્ષેત્ર ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને ચિત્રિત કરવામાં આવ્યા છે. આમ, ડીએનએ સાંકળમાં અણુઓની સીધી છબીઓ મેળવવી સૈદ્ધાંતિક રીતે શક્ય છે; જો કે, ડીએનએની રચના સ્ફટિકીય ઘન પદાર્થો કરતાં ઘણી ઓછી ભૌમિતિક છે, તેથી પૂર્વ લેબલિંગ વિના સીધી ઇમેજિંગ પ્રાપ્ત કરી શકાતી નથી. પગલું 5-ડેટા વિશ્લેષણ ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોગ્રાફ પર શ્યામ અને તેજસ્વી ફોલ્લીઓ, અલગ રીતે લેબલ થયેલ ડીએનએ પાયાને અનુરૂપ, કમ્પ્યુટર સોફ્ટવેર દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. એપ્લિકેશન્સ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ હજી વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ નથી, પરંતુ આ તકનીક એક દિવસ પ્રદાન કરી શકે તેવી લાંબી વાંચન લંબાઈ તેને વિવિધ સંદર્ભોમાં ઉપયોગી બનાવશે. ડી નોવો જિનોમ એસેમ્બલી જ્યારે જિનોમને અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે, ત્યારે તેને એવા ટુકડાઓમાં વિભાજિત કરવું આવશ્યક છે જે એક જ વાંચનમાં અનુક્રમિત કરવા માટે પૂરતા ટૂંકા હોય. આ રીડ્સને પછી રીડ્સ વચ્ચે ઓવરલેપ થતા પ્રદેશોને સંરેખિત કરીને જીગ્સૉ પઝલની જેમ એકસાથે મૂકવા જોઈએ; આ પ્રક્રિયાને ડી નોવો જીનોમ એસેમ્બલી કહેવામાં આવે છે. અનુક્રમણિકા પ્લેટફોર્મ જેટલી લાંબી વાંચન લંબાઈ પ્રદાન કરે છે, તેટલા લાંબા ઓવરલેપિંગ પ્રદેશો અને જીનોમને એસેમ્બલ કરવાનું સરળ બને છે. કોમ્પ્યુટેશનલ દ્રષ્ટિકોણથી, માઇક્રોફ્લુઇડિક સેંગર સિક્વન્સિંગ એ હજુ પણ જીનોમનો ક્રમ અને એસેમ્બલ કરવાની સૌથી અસરકારક રીત છે, જેના માટે કોઈ સંદર્ભ જીનોમ ક્રમ અસ્તિત્વમાં નથી. પ્રમાણમાં લાંબી વાંચન લંબાઈ વ્યક્તિગત અનુક્રમણિકા વાંચન વચ્ચે નોંધપાત્ર ઓવરલેપ પ્રદાન કરે છે, જે એસેમ્બલીમાં વધુ આંકડાકીય વિશ્વાસ માટે પરવાનગી આપે છે. વધુમાં, લાંબા સેંગર રીડ્સ પુનરાવર્તિત ડીએનએ ક્રમના મોટાભાગના પ્રદેશોમાં ફેલાવવા માટે સક્ષમ છે જે અન્યથા ખોટી ગોઠવણી કરીને અનુક્રમ એસેમ્બલીને ગૂંચવે છે. જો કે, સેંગર સિક્વન્સિંગ દ્વારા ડી નોવો જીનોમ એસેમ્બલી અત્યંત ખર્ચાળ અને સમય માંગી લે તેવી છે. બીજી પેઢીની અનુક્રમણિકા તકનીકો, ઓછી ખર્ચાળ હોવા છતાં, ટૂંકા વાંચન લંબાઈને કારણે સામાન્ય રીતે ડી નોવો જીનોમ એસેમ્બલી માટે અયોગ્ય છે. સામાન્ય રીતે, ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ સહિત ત્રીજી પેઢીની સિક્વન્સિંગ તકનીકોનો ઉદ્દેશ ઓછા સિક્વન્સિંગ ખર્ચને જાળવી રાખીને વાંચનની લંબાઈમાં સુધારો કરવાનો છે. આમ, જેમ જેમ ત્રીજી પેઢીની અનુક્રમણિકા તકનીકોમાં સુધારો થશે તેમ તેમ ઝડપી અને સસ્તી ડી નોવો જીનોમ એસેમ્બલી એક વાસ્તવિકતા બની જશે. હેપ્લોટાઇપ એ જોડાયેલા એલીલ્સની શ્રેણી છે જે એક જ રંગસૂત્ર પર વારસામાં મળે છે. ડીએનએ સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ બધા સિંગલ ન્યુક્લિયોટાઇડ પોલીમોર્ફિઝમ્સ (એસએનપી) ને જીનોટાઇપ કરવા માટે થઈ શકે છે જે હેપ્લોટાઇપ બનાવે છે. જો કે, ટૂંકા ડીએનએ અનુક્રમણિકા ઘણીવાર તબક્કાવાર કરી શકાતી નથી; એટલે કે, હેટેરોઝાયગસ સ્વરૂપોને વિશ્વાસપૂર્વક સાચા હેપ્લોટાઇપમાં સોંપી શકાતા નથી. હકીકતમાં, ટૂંકા વાંચન ડીએનએ સિક્વન્સિંગ ડેટા સાથે હેપ્લોટાઇપિંગ માટે એસએનપીને સચોટ રીતે ઓળખવા માટે ખૂબ જ ઉચ્ચ કવરેજ (દરેક ડીએનએ બેઝના સરેરાશ> 50x કવરેજ) ની જરૂર પડે છે, તેમજ માતાપિતા પાસેથી વધારાના સિક્વન્સ ડેટાની જરૂર પડે છે જેથી મેન્ડેલિયન ટ્રાન્સમિશનનો ઉપયોગ હેપ્લોટાઇપ્સનો અંદાજ કાઢવા માટે કરી શકાય. ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ સહિત લાંબા વાંચન પેદા કરતી અનુક્રમણિકા તકનીકો, એક જ વાંચનમાં સમગ્ર હેપ્લોબ્લોકને પકડી શકે છે. એટલે કે, હેપ્લોટાઇપ્સને બહુવિધ રીડ્સમાં વિભાજિત કરવામાં આવતા નથી, અને આનુવંશિક રીતે જોડાયેલા એલીલ્સ સિક્વન્સિંગ ડેટામાં એક સાથે રહે છે. તેથી, લાંબા વાંચન હેપ્લોટાઇપિંગને સરળ અને વધુ સચોટ બનાવે છે, જે વસ્તી આનુવંશિકતાના ક્ષેત્ર માટે ફાયદાકારક છે. કોપી નંબર પ્રકારો જનીનો સામાન્ય રીતે દ્વિગુણિત માનવ જિનોમમાં બે નકલોમાં હાજર હોય છે; આ પ્રમાણભૂત કોપી નંબરથી વિચલિત થતા જનીનોને કોપી નંબર પ્રકારો (સી. એન. વી.) તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. કોપી નંબરની વિવિધતા સૌમ્ય હોઈ શકે છે (આ સામાન્ય રીતે સામાન્ય સ્વરૂપો છે, જેને કોપી નંબર પોલીમોર્ફિઝમ કહેવાય છે) અથવા રોગકારક હોઈ શકે છે. સી. એન. વી. ને ફ્લોરોસન્સ ઇન સિટુ હાઇબ્રિડાઇઝેશન (એફ. આઈ. એસ. એચ.) અથવા તુલનાત્મક જીનોમિક હાઇબ્રિડાઇઝેશન (સી. જી. એચ.) દ્વારા શોધવામાં આવે છે. ચોક્કસ વિરામચિહ્નોને શોધવા માટે કે જેના પર કાઢી નાખવામાં આવે છે, અથવા ડુપ્લિકેશન અથવા એમ્પ્લીફિકેશન ઇવેન્ટ દ્વારા રજૂ કરાયેલા જીનોમિક જખમને શોધવા માટે, CGH ટાઇલિંગ એરે (એરે CGH) નો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે, અથવા વેરિઅન્ટ પ્રદેશને અનુક્રમિત કરી શકાય છે. લાંબી અનુક્રમણિકા વાંચન ખાસ કરીને ડુપ્લિકેશન અથવા એમ્પ્લીફિકેશનનું વિશ્લેષણ કરવા માટે ઉપયોગી છે, કારણ કે વિસ્તૃત સેગમેન્ટ્સની દિશાનું વિશ્લેષણ કરવું શક્ય છે જો તે એક જ અનુક્રમણિકા વાંચનમાં કેપ્ચર કરવામાં આવે. કેન્સર કેન્સર જીનોમિક્સ, અથવા ઓન્કોજેનોમિક્સ, એક ઉભરતું ક્ષેત્ર છે જેમાં ઉચ્ચ-થ્રુપુટ, બીજી પેઢીની ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તકનીકનો ઉપયોગ સમગ્ર કેન્સર જીનોમને અનુક્રમિત કરવા માટે કરવામાં આવી રહ્યો છે. આ ટૂંકા વાંચન અનુક્રમણિકાના ડેટાનું વિશ્લેષણ ટૂંકા વાંચન ડેટાનો ઉપયોગ કરીને ડી નોવો જીનોમ એસેમ્બલી સાથે સંકળાયેલી તમામ સમસ્યાઓનો સમાવેશ કરે છે. વધુમાં, કેન્સરના જીનોમ ઘણીવાર એન્યુપ્લોઇડ હોય છે. આ વિચલનો, જે અનિવાર્યપણે મોટા પાયે નકલ નંબરના પ્રકારો છે, તેનું વિશ્લેષણ બીજી પેઢીની અનુક્રમણિકા તકનીકો દ્વારા નકલ નંબરનો અંદાજ કાઢવા માટે વાંચન આવર્તનનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે. જો કે, લાંબુ વાંચન કોપી નંબર, વિસ્તૃત પ્રદેશોની દિશા અને કેન્સરના જીનોમમાં હાજર SNPનું વધુ સચોટ ચિત્ર પ્રદાન કરશે. માઇક્રોબાયોમ સિક્વન્સિંગ માઇક્રોબાયોમ એ સૂક્ષ્મ પર્યાવરણમાં હાજર સુક્ષ્મજીવાણુઓના કુલ સંગ્રહ અને તેમના સંબંધિત જીનોમનો સંદર્ભ આપે છે. ઉદાહરણ તરીકે, અંદાજે 100 ટ્રિલિયન માઇક્રોબાયલ કોષો કોઈપણ સમયે માનવ શરીરમાં વસવાટ કરે છે. માનવ માઇક્રોબાયોમ ખાસ રસ ધરાવે છે, કારણ કે આ સામાન્ય બેક્ટેરિયા માનવ સ્વાસ્થ્ય અને રોગપ્રતિકારક શક્તિ માટે મહત્વપૂર્ણ છે. પૃથ્વીના મોટાભાગના બેક્ટેરિયલ જીનોમ હજુ સુધી અનુક્રમિત કરવામાં આવ્યા નથી; માઇક્રોબાયોમ સિક્વન્સિંગ પ્રોજેક્ટ હાથ ધરવા માટે વ્યાપક ડી નોવો જીનોમ એસેમ્બલીની જરૂર પડશે, જે ટૂંકી વાંચી શકાય તેવી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તકનીકો સાથે ભયાવહ છે. લાંબા રીડ્સ નવા માઇક્રોબાયલ જીનોમની એસેમ્બલીને મોટા પ્રમાણમાં સરળ બનાવશે. શક્તિઓ અને નબળાઈઓ અન્ય બીજી અને ત્રીજી પેઢીની ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તકનીકોની તુલનામાં, ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગમાં સંખ્યાબંધ સંભવિત મુખ્ય શક્તિઓ અને નબળાઈઓ છે, જે આખરે ભવિષ્યની ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તકનીક તરીકે તેની ઉપયોગિતા અને પ્રાધાન્ય નક્કી કરશે. શક્તિઓ લાંબા સમય સુધી વાંચવાની લંબાઈઃ ઝેડએસ જિનેટિક્સે ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગની સંભવિત વાંચન લંબાઈ 10,000 થી 20,000 બેઝ જોડી હોવાનો અંદાજ મૂક્યો છે, જેનો દર દરરોજ 1.7 અબજ બેઝ જોડીનો દર છે. આવી લાંબી વાંચન લંબાઈ અન્ય એપ્લિકેશનોમાં ડી નોવો જીનોમ એસેમ્બલી અને હેપ્લોટાઇપ્સની સીધી શોધને સરળ બનાવશે. ઓછી કિંમતઃ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગનો ખર્ચ વધુ ખર્ચાળ બીજી પેઢીના ડીએનએ સિક્વન્સિંગ વિકલ્પોની સરખામણીમાં માનવ જીનોમ દીઠ માત્ર યુએસ $5,000-યુએસ $10,000 હોવાનો અંદાજ છે. કોઈ ડિફાસિંગ નથીઃ સંશ્લેષણ દરમિયાન સિંક્રોનિસિટીમાં નુકસાનને કારણે ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડ્સનું ડિફાસિંગ એ બીજી પેઢીની સિક્વન્સિંગ તકનીકોની મોટી સમસ્યા છે. ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ અને અન્ય કેટલીક ત્રીજી પેઢીની સિક્વન્સિંગ તકનીકો માટે, રીડ્સનું સિંક્રોનાઇઝેશન બિનજરૂરી છે કારણ કે એક સમયે માત્ર એક જ પરમાણુ વાંચવામાં આવે છે. ટૂંકા ટર્નઅરાઉન્ડ સમયઃ ડીએનએના મૂળ ટુકડાઓ વાંચવાની ક્ષમતા જટિલ નમૂનાની તૈયારીને સમગ્ર જીનોમ સિક્વન્સિંગના સામાન્ય કાર્યપ્રવાહમાં બિનજરૂરી પગલું બનાવે છે. પરિણામે, ટૂંકા ટર્નઅરાઉન્ડ સમય શક્ય છે. નબળાઈઓ ઉચ્ચ મૂડી ખર્ચઃ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ માટે જરૂરી પર્યાપ્ત રીઝોલ્યુશન સાથે ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપનો ખર્ચ આશરે યુએસ $1,000,000 છે, તેથી આ પદ્ધતિ દ્વારા ડીએનએ સિક્વન્સિંગને અનુસરવા માટે નોંધપાત્ર રોકાણની જરૂર છે. તકનીકી રીતે પડકારજનકઃ પસંદગીયુક્ત ભારે અણુ લેબલિંગ અને લેબલવાળા ડીએનએને સબસ્ટ્રેટ સાથે જોડવું અને સીધું કરવું એ એક ગંભીર તકનીકી પડકાર છે. વધુમાં, ડીએનએ નમૂના ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપના ઉચ્ચ શૂન્યાવકાશ અને ઉચ્ચ-ઊર્જા ઇલેક્ટ્રોનના કેન્દ્રિત બીમ દ્વારા ઇરેડિયેશન માટે સ્થિર હોવા જોઈએ. સંભવિત પી. સી. આર. પૂર્વગ્રહ અને કલાકૃતિઓઃ જોકે પી. સી. આર. નો ઉપયોગ માત્ર ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી ડી. એન. એ. અનુક્રમણિકામાં ડી. એન. એ. સ્ટ્રાન્ડને ભારે અણુઓ અથવા ધાતુઓ સાથે લેબલ કરવાના સાધન તરીકે કરવામાં આવે છે, તેમ છતાં એક જ વિસ્તરણ દરમિયાન નમૂનાની રજૂઆતમાં પૂર્વગ્રહ અથવા ભૂલો રજૂ કરવાની સંભાવના હોઈ શકે છે. અન્ય અનુક્રમણિકા તકનીકો સાથે સરખામણી ઘણી બિન-સેન્જર બીજી અને ત્રીજી પેઢીની ડીએનએ અનુક્રમણિકા તકનીકો થ્રુપુટ વધારવા અને ખર્ચ ઘટાડવાના સામાન્ય હેતુ સાથે વિકસાવવામાં આવી છે અથવા હાલમાં વિકસાવવામાં આવી રહી છે જેથી વ્યક્તિગત આનુવંશિક દવાને સંપૂર્ણપણે સાકાર કરી શકાય. એક્સ પ્રાઇઝ ફાઉન્ડેશન (સાન્ટા મોનિકા, સીએ, યુએસએ) દ્વારા સમર્થિત જીનોમિક્સ માટે યુએસ $10 મિલિયનનું આર્કોન એક્સ પ્રાઇઝ અને નેશનલ હ્યુમન જીનોમ રિસર્ચ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ ધ નેશનલ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ હેલ્થ (એનઆઈએચ-એનએચજીઆરઆઈ) દ્વારા સમર્થિત યુએસ $70 મિલિયનનું અનુદાન પુરસ્કારો બંને નવી ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તકનીકોના વિકાસમાં સંશોધન પ્રવૃત્તિના ઝડપી વિસ્ફોટને પ્રોત્સાહન આપી રહ્યા છે. વિવિધ અભિગમો, તકનીકો અને વ્યૂહરચનાઓ દરેક ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તકનીકને વ્યાખ્યાયિત કરે છે, તેથી દરેકની પોતાની શક્તિ અને નબળાઈઓ હોય છે. વિવિધ બીજી અને ત્રીજી પેઢીની ડીએનએ અનુક્રમણિકા તકનીકો વચ્ચેના મહત્વપૂર્ણ પરિમાણોની સરખામણી કોષ્ટક 1 માં રજૂ કરવામાં આવી છે. સંદર્ભો ડીએનએ સિક્વન્સિંગ ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી લેબોરેટરી તકનીકો માઇક્રોબાયોલોજી તકનીકો મોલેક્યુલર બાયોલોજી તકનીકો વૈજ્ઞાનિક તકનીકો