Proximity extension assay
નિકટતા વિસ્તરણ પરીક્ષણ (પીઇએ) એ સીરમ અથવા પ્લાઝ્મા જેવા જૈવિક નમૂનામાં હાજર ઘણા ચોક્કસ પ્રોટીનની માત્રાને શોધવા અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવાની એક પદ્ધતિ છે. આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ પ્રોટિઓમિક્સના સંશોધન ક્ષેત્રમાં થાય છે, ખાસ કરીને એફિનિટી પ્રોટિઓમિક્સ, જ્યાં એક બાયોમાર્કર તરીકે ઉપયોગ કરવા માટે લોહીમાં ઘણા ચોક્કસ પ્રોટીનની વિપુલતામાં તફાવતો શોધે છે. બાયોમાર્કર અને બાયોમાર્કર સિગ્નેચર સંયોજનો, રોગની સ્થિતિ અને દવાની અસરકારકતા નક્કી કરવા માટે ઉપયોગી છે. પ્રોટીન શોધવા માટેની મોટાભાગની પદ્ધતિઓમાં પ્રોટીન એનાલાઇટને પ્રથમ કેપ્ચર કરવા અને સ્થિર કરવા માટે નક્કર તબક્કાનો ઉપયોગ સામેલ છે, જ્યાં એક અથવા થોડા પ્રોટીનનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવે છે, જેમ કે એલિસા. તેનાથી વિપરીત, પીઇએ સજાતીય એક ટ્યુબ પ્રતિક્રિયા દ્રાવણમાં નક્કર તબક્કા વિના કરવામાં આવે છે જ્યાં અનન્ય ડીએનએ સિક્વન્સ ટેગ્સ સાથે જોડાયેલા એન્ટિબોડીઝના સેટમાં, જેને નિકટતા પ્રોબ્સ કહેવામાં આવે છે, તે દરેક લક્ષ્ય પ્રોટીન માટે ચોક્કસ જોડીમાં કામ કરે છે. પીઇએ ઘણીવાર એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે અને તે ઇમ્યુનોએસેનો એક પ્રકાર છે. નિકટતા ચકાસણી દ્વારા લક્ષ્ય બંધન ડીએનએ-ટેગની તેમની સ્થાનિક સંબંધિત અસરકારક સાંદ્રતામાં વધારો કરે છે જે એકબીજા સાથે નબળા પૂરકતાના સંકરણને સક્ષમ કરે છે જે પછી ડીએનએ પોલિમરેઝ મધ્યસ્થી વિસ્તરણને સક્ષમ કરે છે જે શોધાયેલ દરેક લક્ષ્ય પ્રોટીન માટે વિશિષ્ટ સંયુક્ત ડીએનએ અનુક્રમ બનાવે છે. 3 'એક્સોન્યુક્લીઝ નિપુણ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ પૃષ્ઠભૂમિના ઘોંઘાટને ઘટાડે છે અને હાયપર થર્મોસ્ટેબલ પોલિમરેઝ કુદરતી હોટ-સ્ટાર્ટ પ્રતિક્રિયા સાથે સરળ પરીક્ષણમાં મધ્યસ્થી કરે છે. ડીએનએ સિક્વન્સના એક્સ્ટેંશન પ્રોડક્ટ્સનો આ પૂલ પી. સી. આર. દ્વારા વિસ્તૃત એમ્પ્લિકોન બનાવે છે જ્યાં દરેક એમ્પ્લિકોન સિક્વન્સ લક્ષ્ય પ્રોટીનની ઓળખને અનુરૂપ હોય છે અને રકમ તેની માત્રાને પ્રતિબિંબિત કરે છે. ત્યારબાદ, આ એમ્પ્લિકોનને ડીએનએ-ટેગ ગણતરી દ્વારા વાસ્તવિક સમયના પીસીઆર અથવા આગામી પેઢીના ડીએનએ સિક્વન્સિંગ દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવે છે અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવે છે. પીઇએ વિસ્તરણ પ્રતિક્રિયામાંથી શોધી શકાય તેવા ડીએનએ ક્રમ પેદા કરવા માટે પ્રોટીન દીઠ બે યોગ્ય રીતે બંધાયેલા એન્ટિબોડીઝના સંયોજનની જરૂર પડે છે તેના કારણે એક સાથે ઘણા પ્રોટીન (કહેવાતા મલ્ટિપ્લેક્સિંગ) ની શોધને સક્ષમ કરે છે. માત્ર ક્રમની જ્ઞાનાત્મક જોડીઓ સાચા સંકેત તરીકે શોધાય છે, જે એક સમયે લગભગ 30 પ્રોટીન પર મર્યાદિત સોલિડ ફેઝ કેપ્ચર પદ્ધતિઓથી આગળ મલ્ટિપ્લેક્સિંગને સક્ષમ કરે છે. ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશન પાવર એક માઇક્રોલીટરની નીચે પણ મિનિટના નમૂનાના જથ્થાને સક્ષમ કરે છે. પીઇએનો ઉપયોગ 1000 થી વધુ સંશોધન પ્રકાશનોમાં કરવામાં આવ્યો છે. વિકાસ પીઇએ નિકટતા બંધન તપાસ (પીએલએ) માંથી મેળવવામાં આવે છે જે ડીએનએ પોલિમરેઝને બદલે નિકટતા તપાસના ક્રમને એકીકૃત કરવા માટે ડીએનએ લિગેઝ એન્ઝાઇમનો ઉપયોગ કરે છે. પી. એલ. એ. મલ્ટિપ્લેક્સિંગ માટે પણ યોગ્ય છે, પરંતુ સીરમ અને પ્લાઝ્મા નમૂનાઓના ઘટકોમાંથી લિગેઝ ઉત્સેચકોના એન્ઝાઇમેટિક નમૂના ચલ અવરોધથી પીડાય છે. ડીએનએ પોલિમરેઝ ઉત્સેચકો સમાન અવરોધ સહન કરતા નથી અને સહેલાઈથી મલ્ટિપ્લેક્સેબલ પણ છે અને 384 પ્રોટીન સુધી મલ્ટિપ્લેક્સ્ડ કરવામાં આવ્યા છે. પીઇએ કામગીરી તાપમાન પ્રત્યે સંવેદનશીલ હોય છે કારણ કે તે ડીએનએ સંકરણ આધારિત પ્રતિક્રિયા છે. તેથી ઓરડાના તાપમાને કોઈ પ્રવૃત્તિ વિના હાયપર-થર્મોસ્ટેબલ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ બેન્ચ ટોપ રિએક્શન એસેમ્બલીને ટેકો આપે છે. સંદર્ભો પ્રોટિઓમિક્સ બાયોકેમિસ્ટ્રી શોધ પદ્ધતિઓ