Massive parallel sequencing
મેસિવ પેરેલલ સિક્વન્સિંગ અથવા મેસિવ પેરેલલ સિક્વન્સિંગ એ મેસિવ પેરેલલ પ્રોસેસિંગની વિભાવનાનો ઉપયોગ કરીને ડીએનએ સિક્વન્સિંગ માટેના ઘણા ઉચ્ચ-થ્રુપુટ અભિગમોમાંથી કોઈપણ છે; તેને નેક્સ્ટ-જનરેશન સિક્વન્સિંગ (એનજીએસ) અથવા સેકન્ડ જનરેશન સિક્વન્સિંગ પણ કહેવામાં આવે છે. આમાંની કેટલીક તકનીકો 1993 અને 1998 ની વચ્ચે ઉભરી આવી હતી અને 2005 થી વ્યાવસાયિક રીતે ઉપલબ્ધ છે. આ તકનીકો ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ રન દીઠ 1 મિલિયનથી 43 અબજ ટૂંકા રીડ્સ (દરેક 50 થી 400 બેઝ) ના ક્રમ માટે લઘુચિત્ર અને સમાંતર પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ કરે છે. ઘણા એન. જી. એસ. પ્લેટફોર્મ ઇજનેરી રૂપરેખાંકનો અને અનુક્રમણિકા રસાયણશાસ્ત્રમાં અલગ પડે છે. તેઓ ફ્લો સેલમાં અવકાશી રીતે અલગ, ક્લોનલી એમ્પ્લિફાઇડ ડીએનએ નમૂનાઓ અથવા સિંગલ ડીએનએ અણુઓ દ્વારા વિશાળ સમાંતર અનુક્રમણિકાના તકનીકી નમૂનાને શેર કરે છે. આ ડિઝાઇન સેંગર સિક્વન્સિંગથી ખૂબ જ અલગ છે-જેને કેશિલરી સિક્વન્સિંગ અથવા પ્રથમ પેઢીના સિક્વન્સિંગ તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે-જે વ્યક્તિગત સિક્વન્સિંગ પ્રતિક્રિયાઓમાં ઉત્પાદિત સાંકળ-સમાપ્તિ ઉત્પાદનોના ઇલેક્ટ્રોફોરેટિક વિભાજન પર આધારિત છે. આ પદ્ધતિ ક્રમબદ્ધતાને મોટા પાયે પૂર્ણ કરવાની મંજૂરી આપે છે. વ્યાવસાયિક રીતે ઉપલબ્ધ એન. જી. એસ. પ્લેટફોર્મ સાથે એન. જી. એસ. પ્લેટફોર્મનું ડી. એન. એ. અનુક્રમણિકા સામાન્ય રીતે નીચેના પગલાંઓ સાથે હાથ ધરવામાં આવે છે. પ્રથમ, ડીએનએ સિક્વન્સિંગ લાઈબ્રેરીઓ પીસીઆર ઇન વિટ્રો દ્વારા ક્લોનલ એમ્પ્લીફિકેશન દ્વારા પેદા થાય છે. બીજું, ડીએનએ સંશ્લેષણ દ્વારા અનુક્રમિત થાય છે, જેમ કે ડીએનએ ક્રમ સાંકળ-સમાપ્તિ રસાયણશાસ્ત્રને બદલે પૂરક સ્ટ્રાન્ડમાં ન્યુક્લિયોટાઇડ્સના ઉમેરા દ્વારા નક્કી થાય છે. ત્રીજું, અવકાશી રીતે અલગ, વિસ્તૃત ડીએનએ નમૂનાઓ ભૌતિક વિભાજન પગલાની જરૂરિયાત વિના મોટા પ્રમાણમાં સમાંતર રીતે એક સાથે અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે. મોટાભાગના એન. જી. એસ. પ્લેટફોર્મમાં આ પગલાંઓનું પાલન કરવામાં આવે છે, પરંતુ દરેક એક અલગ વ્યૂહરચનાનો ઉપયોગ કરે છે. અનુક્રમણિકા પ્રતિક્રિયાઓનું એન. જી. એસ. સમાંતરકરણ એક જ સાધનમાં ચાલતા ન્યુક્લિયોટાઇડ ક્રમના ગીગાબેઝના સેંકડો મેગાબેઝ પેદા કરે છે. આનાથી ઉપલબ્ધ અનુક્રમ માહિતીમાં ભારે વધારો થયો છે અને બાયોમેડિકલ વિજ્ઞાનમાં મૂળભૂત રીતે જીનોમ અનુક્રમણિકા અભિગમમાં ફેરફાર થયો છે. નવી ઊભરતી એન. જી. એસ. તકનીકો અને ઉપકરણોએ જીનોમ અનુક્રમણિકા દીઠ 1000 ડોલરની નજીક અનુક્રમણિકાના ખર્ચમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કરવામાં વધુ યોગદાન આપ્યું છે. 2014 સુધીમાં, મોટા પાયે સમાંતર અનુક્રમણિકા પ્લેટફોર્મ વ્યાવસાયિક રીતે ઉપલબ્ધ છે અને તેમની વિશેષતાઓનો સારાંશ કોષ્ટકમાં આપવામાં આવ્યો છે. જેમ જેમ એન. જી. એસ. તકનીકોની ગતિ ઝડપથી આગળ વધી રહી છે તેમ તેમ તકનીકી વિશિષ્ટતાઓ અને કિંમતોમાં ફેરફાર થઈ રહ્યો છે. સિંગલ-એન્ડ સિક્વન્સિંગ માટે રન ટાઇમ અને ગીગાબેઝ (જી. બી.) આઉટપુટ નોંધવામાં આવે છે. પેઅર્ડ-એન્ડ સિક્વન્સિંગ કરતી વખતે રન ટાઇમ અને આઉટપુટ લગભગ બમણા થાય છે. ‡ રોશ 454 અને હેલિકોસ બાયોસાયન્સ પ્લેટફોર્મ માટે સરેરાશ વાંચન લંબાઈ. એન. જી. એસ. માટે નમૂના તૈયાર કરવાની પદ્ધતિઓ એન. જી. એસ. પ્રતિક્રિયાઓ માટે નમૂનાઓ તૈયાર કરવા માટે બે પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ થાય છેઃ એક ડીએનએ પરમાણુઓમાંથી ઉદ્ભવતા વિસ્તૃત નમૂનાઓ અને એક ડીએનએ પરમાણુ નમૂનાઓ. ઇમેજિંગ સિસ્ટમ્સ માટે કે જે સિંગલ ફ્લોરોસન્સ ઇવેન્ટ્સને શોધી શકતી નથી, ડીએનએ નમૂનાઓનું એમ્પ્લીફિકેશન જરૂરી છે. ત્રણ સૌથી સામાન્ય એમ્પ્લીફિકેશન પદ્ધતિઓ ઇમલ્શન પી. સી. આર. (ઈ. એમ. પી. સી. આર.), રોલિંગ સર્કલ અને સોલિડ-ફેઝ એમ્પ્લીફિકેશન છે. નમૂનાઓનું અંતિમ વિતરણ અવકાશી રીતે અવ્યવસ્થિત અથવા ગ્રીડ પર હોઈ શકે છે. ઇમલ્શન પી. સી. આર. ઇમલ્શન પી. સી. આર. પદ્ધતિઓમાં, ડીએનએ લાઇબ્રેરી સૌપ્રથમ જીનોમિક ડીએનએના રેન્ડમ ફ્રેગમેન્ટેશન દ્વારા પેદા થાય છે. સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટુકડાઓ (નમૂનાઓ) એડેપ્ટર અથવા લિંકર્સ સાથે મણકાની સપાટી સાથે જોડાયેલા હોય છે, અને એક મણકો ડીએનએ લાઇબ્રેરીમાંથી એક જ ડીએનએ ટુકડા સાથે જોડાયેલ હોય છે. મણકાની સપાટીમાં ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રોબ્સ હોય છે, જેમાં અનુક્રમ હોય છે, જે ડીએનએના ટુકડાઓને બાંધતા એડેપ્ટરના પૂરક હોય છે. પછી મણકાને પાણી-તેલના પ્રવાહી મિશ્રણના ટીપાંમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે. જલીય જળ-તેલના પ્રવાહી મિશ્રણમાં, એક મણકાને પકડનારા દરેક ટીપાં એ પી. સી. આર. માઇક્રો રિએક્ટર છે જે એક જ ડીએનએ નમૂનાની વિસ્તૃત નકલો ઉત્પન્ન કરે છે. ગ્રીડેડ રોલિંગ સર્કલ નેનોબોલ્સ દ્રાવણમાં રોલિંગ સર્કલ એમ્પ્લીફિકેશન દ્વારા સિંગલ ડીએનએ અણુઓની વસ્તીનું વિસ્તરણ પછી સ્થિર થવા માટે ડીએનએ કરતા નાના કદના ફોલ્લીઓના ગ્રીડ પર કેપ્ચર કરવામાં આવે છે. ડીએનએ કોલોની જનરેશન (બ્રિજ એમ્પ્લીફિકેશન) ફોરવર્ડ અને રિવર્સ પ્રાઈમર્સ ફ્લો સેલમાં સ્લાઇડ સાથે ઉચ્ચ ઘનતા પર સહસંયોજક રીતે જોડાયેલા હોય છે. આધાર પરના નમૂના સાથે પ્રાઇમરનો ગુણોત્તર વિસ્તૃત ક્લસ્ટરોની સપાટીની ઘનતાને વ્યાખ્યાયિત કરે છે. ફ્લો સેલ પોલિમરેઝ-આધારિત વિસ્તરણ માટે રીએજન્ટ્સના સંપર્કમાં આવે છે, અને પ્રાઇમિંગ સપાટી પર પૂરક ઓલિગો માટે લિગેટેડ ટુકડો "બ્રિજ" ના મુક્ત/દૂરના અંત તરીકે થાય છે. પુનરાવર્તિત વિકૃતીકરણ અને વિસ્તરણના પરિણામે પ્રવાહ કોષની સપાટી પર લાખો અલગ-અલગ સ્થળોએ ડીએનએના ટુકડાઓનું સ્થાનિક વિસ્તરણ થાય છે. સોલિડ-ફેઝ એમ્પ્લીફિકેશન 100-200 મિલિયન અવકાશી રીતે અલગ ટેમ્પલેટ ક્લસ્ટર્સ ઉત્પન્ન કરે છે, જે મુક્ત છેડા પૂરા પાડે છે, જેમાં યુનિવર્સલ સિક્વન્સિંગ પ્રાઇમર પછી સિક્વન્સિંગ પ્રતિક્રિયા શરૂ કરવા માટે સંકરણ કરવામાં આવે છે. આ ટેકનોલોજી 1997માં ગ્લેક્સો-વેલકમની જીનીવા બાયોમેડિકલ રિસર્ચ ઇન્સ્ટિટ્યૂટ (જી. બી. આર. આઈ.) પાસેથી પેટન્ટ માટે પાસ્કલ મેયર, એરિક કાવાશિમા અને લોરેન્ટ ફરીનેલ્લી દ્વારા દાખલ કરવામાં આવી હતી અને 1998માં પ્રથમ વખત જાહેરમાં રજૂ કરવામાં આવી હતી. 1994માં ક્રિસ એડમ્સ અને સ્ટીવ ક્રોને ચર્ચ અને મિત્રા દ્વારા 1997માં ક્લોનલ એમ્પ્લીફિકેશન માટે સ્વીકારવામાં આવેલી "બ્રિજ એમ્પ્લીફિકેશન" નામની સમાન, પરંતુ બિન-ક્લોનલ, સપાટી એમ્પ્લીફિકેશન પદ્ધતિ પર પેટન્ટ દાખલ કરી હતી. સિંગલ-મોલેક્યુલ ટેમ્પલેટો ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશનની જરૂર હોય તેવા પ્રોટોકોલ ઘણીવાર અમલમાં મૂકવા માટે બોજારૂપ હોય છે અને અનુક્રમણિકા ભૂલો રજૂ કરી શકે છે. સિંગલ-મોલેક્યુલ નમૂનાઓની તૈયારી વધુ સીધી છે અને તેને પી. સી. આર. ની જરૂર નથી, જે વિસ્તૃત નમૂનાઓમાં ભૂલો દાખલ કરી શકે છે. એટી-સમૃદ્ધ અને જીસી-સમૃદ્ધ લક્ષ્ય સિક્વન્સ ઘણીવાર એમ્પ્લીફિકેશન પૂર્વગ્રહ દર્શાવે છે, જે જીનોમ સંરેખણ અને એસેમ્બલીઓમાં તેમની ઓછી રજૂઆતમાં પરિણમે છે. એક પરમાણુ નમૂનાઓ સામાન્ય રીતે ઓછામાં ઓછા ત્રણ જુદા જુદા અભિગમોમાંથી એકનો ઉપયોગ કરીને નક્કર આધાર પર સ્થિર થાય છે. પ્રથમ અભિગમમાં, અવકાશી રીતે વિતરિત વ્યક્તિગત પ્રાઇમર પરમાણુઓ ઘન આધાર સાથે સહસંયોજક રીતે જોડાયેલા હોય છે. નમૂના, જે પ્રારંભિક સામગ્રીને અવ્યવસ્થિત રીતે નાના કદમાં વિભાજીત કરીને તૈયાર કરવામાં આવે છે (ઉદાહરણ તરીકે, ~ 200-250 bp) અને ટુકડાના છેડા પર સામાન્ય એડેપ્ટરો ઉમેરીને, પછી સ્થિર પ્રાઇમરમાં સંકરણ કરવામાં આવે છે. બીજા અભિગમમાં, અવકાશી રીતે વિતરિત સિંગલ-મોલેક્યુલ નમૂનાઓ સ્થિર પ્રાઇમરમાંથી સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ, સિંગલ-મોલેક્યુલ નમૂનાઓને પ્રાથમિક અને વિસ્તૃત કરીને નક્કર આધાર સાથે સહસંયોજક રીતે જોડાયેલા હોય છે. એક સામાન્ય પ્રાઇમર પછી નમૂનામાં સંકરણ કરવામાં આવે છે. કોઈપણ અભિગમમાં, ડીએનએ પોલિમરેઝ એન. જી. એસ. પ્રતિક્રિયા શરૂ કરવા માટે સ્થિર પ્રાથમિક નમૂના રૂપરેખાંકન સાથે જોડાઈ શકે છે. ઉપરોક્ત બંને અભિગમોનો ઉપયોગ હેલિકોસ બાયોસાયન્સ દ્વારા કરવામાં આવે છે. ત્રીજા અભિગમમાં, અવકાશી રીતે વિતરિત સિંગલ પોલિમરેઝ પરમાણુઓ નક્કર આધાર સાથે જોડાયેલા હોય છે, જેની સાથે પ્રાથમિક નમૂના પરમાણુ બંધાયેલ હોય છે. આ અભિગમનો ઉપયોગ પેસિફિક બાયોસાયન્સ દ્વારા કરવામાં આવે છે. મોટા ડીએનએ અણુઓ (હજારો બેઝ જોડીઓ સુધી) નો ઉપયોગ આ તકનીક સાથે કરી શકાય છે અને, પ્રથમ બે અભિગમોથી વિપરીત, ત્રીજા અભિગમનો ઉપયોગ વાસ્તવિક-સમયની પદ્ધતિઓ સાથે કરી શકાય છે, પરિણામે સંભવિત રીતે લાંબા સમય સુધી વાંચી શકાય છે. અનુક્રમ અભિગમ સંશ્લેષણ દ્વારા અનુક્રમ સંશ્લેષણ (એસ. બી. એસ.) દ્વારા અનુક્રમિક અનુક્રમણિકાનો ઉદ્દેશ ડીએનએ પોલિમરેઝ દ્વારા ન્યુક્લિયોટાઇડના સમાવેશને શોધીને ડીએનએ નમૂનાનું અનુક્રમ નક્કી કરવાનો છે. એન્જિનિયર્ડ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ ડીએનએના એક જ સ્ટ્રાન્ડની નકલનું સંશ્લેષણ કરવા માટે થાય છે અને દરેક ન્યુક્લિયોટાઇડના સમાવેશ પર દેખરેખ રાખવામાં આવે છે. સંશ્લેષણ દ્વારા અનુક્રમણિકાનો સિદ્ધાંત સૌપ્રથમ 1993માં વર્ણવવામાં આવ્યો હતો અને કેટલાક વર્ષો પછી તેમાં સુધારાઓ પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યા હતા. મુખ્ય ભાગો એસ. બી. એસ. ના તમામ મૂર્ત સ્વરૂપો માટે ખૂબ સમાન છે અને તેમાં (1) અનુગામી સંકેતને વધારવા અને નક્કર આધાર સાથે અનુક્રમિત કરવા માટે ડીએનએને જોડવા માટે ડીએનએનું વિસ્તરણ, (2) નક્કર આધાર પર સિંગલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએની પેઢી, (3) એન્જિનિયર્ડ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરીને ન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો સમાવેશ અને (4) ન્યુક્લિયોટાઇડના સમાવેશની શોધનો સમાવેશ થાય છે. પછી 3-4 પગલાંઓનું પુનરાવર્તન કરવામાં આવે છે અને પગલું 4 માં મેળવેલા સંકેતોમાંથી ક્રમ એકત્ર કરવામાં આવે છે. સિક્વન્સિંગ-બાય-સિન્થેસિસના આ સિદ્ધાંતનો ઉપયોગ 454, પેકબાયો, આયનટોરેન્ટ, ઈલુમિના અને એમજીઆઈ સહિત લગભગ તમામ મોટા સમાંતર સિક્વન્સિંગ સાધનો માટે કરવામાં આવ્યો છે. પાયરોસીક્વેન્સિંગ પાયરોસીક્વેન્સિંગના સિદ્ધાંતને સૌપ્રથમ 1993 માં 3 'થી 5' એક્સોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ (પ્રૂફ-રીડિંગ) અને ફાયરફ્લાય લ્યુસિફેરેઝનો ઉપયોગ કરીને લ્યુમિનેસન્સ રીઅલ-ટાઇમ ડિટેક્શનનો અભાવ ધરાવતા એન્જિનિયર્ડ ડીએનએ પોલિમરેઝ સાથે નક્કર આધારને જોડીને વર્ણવવામાં આવ્યો હતો. સંશ્લેષણ દ્વારા અનુક્રમણિકાની તમામ મુખ્ય વિભાવનાઓ રજૂ કરવામાં આવી હતી, જેમાં (1) અનુગામી સંકેતને વધારવા અને નક્કર આધાર સાથે અનુક્રમિત (નમૂના) થવા માટે ડીએનએને જોડવા માટે ડીએનએનું વિસ્તરણ, (2) નક્કર આધાર પર સિંગલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએની પેઢી (3) એન્જિનિયર્ડ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરીને ન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો સમાવેશ અને (4) વાસ્તવિક સમયમાં પ્રકાશની શોધ દ્વારા સમાવિષ્ટ ન્યુક્લિયોટાઇડની શોધનો સમાવેશ થાય છે. અનુવર્તી લેખમાં, ખ્યાલને વધુ વિકસાવવામાં આવ્યો હતો અને 1998 માં, એક લેખ પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યો હતો જેમાં લેખકોએ દર્શાવ્યું હતું કે બિન-સમાવિષ્ટ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને ચોથા એન્ઝાઇમ (એપિરેઝ) સાથે દૂર કરી શકાય છે, જે બિન-સમાવિષ્ટ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને ધોવાની જરૂર વગર સંશ્લેષણ દ્વારા અનુક્રમણિકા કરવાની મંજૂરી આપે છે. રિવર્સિબલ ટર્મિનેટર રસાયણશાસ્ત્ર દ્વારા ક્રમ આ અભિગમ ચક્રીય પદ્ધતિમાં રિવર્સિબલ ટર્મિનેટર-બાઉન્ડ ડી. એન. ટી. પી. નો ઉપયોગ કરે છે જેમાં ન્યુક્લિયોટાઇડનો સમાવેશ, ફ્લોરોસન્સ ઇમેજિંગ અને ક્લેવેજનો સમાવેશ થાય છે. ફ્લોરોસેન્ટલી-લેબલવાળા ટર્મિનેટરની છબી બનાવવામાં આવે છે કારણ કે દરેક ડી. એન. ટી. પી. ઉમેરવામાં આવે છે અને પછી આગામી પાયાના સમાવેશને મંજૂરી આપવા માટે વિભાજીત કરવામાં આવે છે. આ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ રાસાયણિક રીતે અવરોધિત છે જેથી દરેક સંયોજન એક અનન્ય ઘટના છે. ઇમેજિંગ પગલું દરેક પાયાના સમાવેશના પગલાને અનુસરે છે, પછી ડીએનએ પોલિમરેઝ દ્વારા આગામી સમાવેશ માટે દરેક સ્ટ્રાન્ડ તૈયાર કરવા માટે અવરોધિત જૂથને રાસાયણિક રીતે દૂર કરવામાં આવે છે. વપરાશકર્તા-નિર્ધારિત સાધન સેટિંગ્સ દ્વારા નિર્ધારિત ચોક્કસ સંખ્યામાં ચક્ર માટે પગલાંઓની આ શ્રેણી ચાલુ રહે છે. 3 'અવરોધક જૂથોની મૂળ કલ્પના એન્ઝાઇમેટિક અથવા રાસાયણિક રિવર્સલ તરીકે કરવામાં આવી હતી રાસાયણિક પદ્ધતિ સોલેક્સા અને ઈલુમિના મશીનો માટેનો આધાર રહી છે. રિવર્સિબલ ટર્મિનેટર રસાયણશાસ્ત્ર દ્વારા અનુક્રમ ચાર રંગનું ચક્ર હોઈ શકે છે જેમ કે ઈલુમિના/સોલેક્સા દ્વારા ઉપયોગમાં લેવાય છે, અથવા એક રંગનું ચક્ર હોઈ શકે છે જેમ કે હેલિકોસ બાયોસાયન્સ દ્વારા ઉપયોગમાં લેવાય છે. હેલિકોસ બાયોસાયન્સેસે "વર્ચ્યુઅલ ટર્મિનેટર" નો ઉપયોગ કર્યો હતો, જે બીજા ન્યુક્લિયોસાઇડ એનાલોગ સાથે અવરોધિત ટર્મિનેટર છે જે અવરોધક તરીકે કામ કરે છે. આ ટર્મિનેટરમાં જૂથોને સમાપ્ત કરવા અથવા અટકાવવા માટે યોગ્ય ફેરફારો છે જેથી એક જ આધાર ઉમેરા પછી ડીએનએ સંશ્લેષણ સમાપ્ત થાય. આ અભિગમમાં, અનુક્રમ વિસ્તરણ પ્રતિક્રિયા પોલિમરેઝ દ્વારા નહીં પરંતુ ડીએનએ લિગેઝ અને એક-બેઝ-એન્કોડેડ પ્રોબ્સ અથવા બે-બેઝ-એન્કોડેડ પ્રોબ્સ દ્વારા હાથ ધરવામાં આવે છે. તેના સૌથી સરળ સ્વરૂપમાં, ફ્લોરોસેન્ટલી લેબલ થયેલ પ્રોબ પ્રાથમિક નમૂનાને અડીને તેના પૂરક ક્રમમાં સંકરણ કરે છે. ત્યારબાદ ડાઈ-લેબલ્ડ પ્રોબને પ્રાઇમરમાં જોડવા માટે ડીએનએ લિગેઝ ઉમેરવામાં આવે છે. બિન-લીગેટેડ ચકાસણીઓ ધોવાઇ જાય છે, ત્યારબાદ લીગેટેડ તપાસની ઓળખ નક્કી કરવા માટે ફ્લોરોસન્સ ઇમેજિંગ કરવામાં આવે છે. ફ્લોરોસન્ટ રંગને દૂર કરવા માટે ક્લેવેબલ પ્રોબ્સનો ઉપયોગ કરીને અને અનુગામી બંધન ચક્ર (સાંકળવાળા બંધન) માટે 5′-PO4 જૂથને પુનર્જીવિત કરીને અથવા નમૂનામાં નવા પ્રાઇમરને દૂર કરીને અને સંકરણ કરીને આ ચક્રનું પુનરાવર્તન કરી શકાય છે. ફોસ્ફોલિંક્ડ ફ્લોરોસન્ટ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ અથવા રીઅલ-ટાઇમ સિક્વન્સિંગ પેસિફિક બાયોસાયન્સિસ હાલમાં આ પદ્ધતિનું નેતૃત્વ કરી રહ્યું છે. રીઅલ-ટાઇમ સિક્વન્સિંગની પદ્ધતિમાં ડીએનએ સંશ્લેષણ દરમિયાન ડાઈ-લેબલવાળા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સના સતત સમાવેશની ઇમેજિંગનો સમાવેશ થાય છેઃ સિંગલ ડીએનએ પોલિમરેઝ પરમાણુઓ વ્યક્તિગત ઝીરો-મોડ વેવગાઇડ ડિટેક્ટર્સ (ઝેડએમડબલ્યુ ડિટેક્ટર્સ) ની નીચેની સપાટી સાથે જોડાયેલા હોય છે જે ક્રમની માહિતી મેળવી શકે છે જ્યારે ફોસ્ફોલિંક્ડ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને વધતી જતી પ્રાઇમર સ્ટ્રાન્ડમાં સામેલ કરવામાં આવે છે. પેસિફિક બાયોસાયન્સ એક અનન્ય ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે જે ફોસ્ફોલિંક્ડ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને વધુ સારી રીતે સમાવિષ્ટ કરે છે અને બંધ ગોળાકાર નમૂનાઓના અનુક્રમને સક્ષમ કરે છે. જ્યારે સિંગલ-રીડ ચોકસાઈ 87 ટકા છે, ત્યારે બહુ-કિલોબેઝ રીડ લંબાઈ સાથે સર્વસંમતિની ચોકસાઈ 99.999% પર દર્શાવવામાં આવી છે. 2015 માં, પેસિફિક બાયોસાયન્સેસે સિક્વલ સિસ્ટમ નામનું નવું સિક્વન્સિંગ ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ બહાર પાડ્યું, જે લગભગ 6.5-fold ક્ષમતામાં વધારો કરે છે. ક્લિનિકલ મેટાજેનૉમિક સિક્વન્સિંગ ફર્સ્ટ જનરેશન સિક્વન્સિંગ થર્ડ જનરેશન આરએનએ વેલોસિટી રેફરન્સ ડીએનએ સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિઓ પણ જુઓ.