Nuclear magnetic resonance spectroscopy of nucleic acids
ન્યુક્લિક એસિડ એન. એમ. આર. એ ડીએનએ અથવા આરએનએ જેવા ન્યુક્લિક એસિડના અણુઓની રચના અને ગતિશીલતા વિશે માહિતી મેળવવા માટે ન્યુક્લિયર મેગ્નેટિક રેઝોનન્સ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ છે. તે 100 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ સુધીના અણુઓ માટે ઉપયોગી છે, અને 2003 સુધીમાં, તમામ જાણીતા આર. એન. એ. માળખાઓમાંથી લગભગ અડધા એન. એમ. આર. સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા. એન. એમ. આર. ને એક્સ-રે ક્રિસ્ટલોગ્રાફી પર ફાયદા છે, જે ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન ન્યુક્લિક એસિડ માળખું નક્કી કરવા માટેની અન્ય પદ્ધતિ છે, જેમાં અણુઓ સ્ફટિક જાળીને બદલે તેમની કુદરતી દ્રાવણ સ્થિતિમાં જોવા મળે છે જે અણુના માળખાકીય ગુણધર્મોને અસર કરી શકે છે. એન. એમ. આર. સાથે ગતિશીલતાની તપાસ કરવી પણ શક્ય છે. આ સ્ફટિકશાસ્ત્ર કરતાં સહેજ ઓછી સચોટ અને વિગતવાર માળખાઓની કિંમત પર આવે છે. ન્યુક્લિક એસિડ એન. એમ. આર. પ્રોટીન એન. એમ. આર. જેવી જ તકનીકોનો ઉપયોગ કરે છે, પરંતુ તેમાં ઘણા તફાવતો છે. ન્યુક્લિક એસિડમાં હાઇડ્રોજન અણુઓની ઓછી ટકાવારી હોય છે, જે અણુઓ સામાન્ય રીતે એન. એમ. આર. માં જોવા મળે છે, અને કારણ કે ન્યુક્લિક એસિડ ડબલ હેલિસીસ સખત અને આશરે રેખીય હોય છે, તેઓ "લાંબા અંતર" સહસંબંધ આપવા માટે પોતાને પાછળ વાળતા નથી. ન્યુક્લિક એસિડમાં પ્રોટીન કરતાં નાની શ્રેણીમાં વહેંચાયેલ પડઘો હોય છે, જે સ્પેક્ટ્રાને સંભવિત રીતે વધુ ગીચ બનાવે છે અને તેનું અર્થઘટન કરવું મુશ્કેલ બનાવે છે. પ્રાયોગિક પદ્ધતિઓ દ્વિ-પરિમાણીય એન. એમ. આર. પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ લગભગ હંમેશા ન્યુક્લિક એસિડ સાથે થાય છે. તેમાં થ્રુ-બોન્ડ ન્યુક્લિયર કપ્લિંગ્સ શોધવા માટે કોરિલેશન સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (COSY) અને ટોટલ કોહેરેન્સ ટ્રાન્સફર સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (TOCSY) અને અવકાશમાં એકબીજાની નજીક હોય તેવા કેન્દ્રક વચ્ચેના કપ્લિંગ્સને શોધવા માટે ન્યુક્લિયર ઓવરહાઉઝર ઇફેક્ટ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (NOESY) નો સમાવેશ થાય છે. સામાન્ય રીતે ન્યુક્લિક એસિડ સાથે કરવામાં આવતા એન. એમ. આર. ના પ્રકારો 1 એચ. એન. એમ. આર., 13 સી. એન. એમ. આર., 15 એન. એન. એમ. આર. અને 31 પી. એન. એમ. આર. છે. જો 2 '-ફ્લુઓરો-2'-ડિઓક્સીએડેનોસિન જેવા બિન-કુદરતી ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને ન્યુક્લિક એસિડ સ્ટ્રાન્ડમાં સામેલ કરવામાં આવે તો 19એફ એન. એમ. આર. પણ ઉપયોગી છે, કારણ કે કુદરતી ન્યુક્લિક એસિડમાં કોઈ ફ્લોરિન પરમાણુ હોતા નથી. 1H અને 31P લગભગ 100% કુદરતી વિપુલતા ધરાવે છે, જ્યારે 13C અને 15N ઓછી કુદરતી વિપુલતા ધરાવે છે. આ પછીના બે કેન્દ્રક માટે, અણુઓની અંદર ઇચ્છિત અણુઓને સમસ્થાનિક રીતે સમૃદ્ધ કરવાની ક્ષમતા છે, ક્યાં તો સમાન રીતે અથવા સ્થળ-વિશિષ્ટ રીતે. સમસ્થાનિક રીતે સમૃદ્ધ વાતાવરણમાં ઉગાડવામાં આવતા બેક્ટેરિયામાંથી મેળવેલા ડી. એન. ટી. પી. અથવા એન. ટી. પી. નો ઉપયોગ કરીને પોલિમરેઝ સાંકળ પ્રતિક્રિયા કરીને, 13સી અને/અથવા 15એનમાં સમાન રીતે સમૃદ્ધ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ બાયોકેમિકલ પદ્ધતિઓ દ્વારા મેળવી શકાય છે. સ્થળ-વિશિષ્ટ આઇસોટોપ સંવર્ધન લેબલ થયેલ ન્યુક્લિયોસાઇડ ફોસ્ફોરામિડાઇટ મોનોમર અને સંપૂર્ણ સ્ટ્રાન્ડના રાસાયણિક સંશ્લેષણ દ્વારા થવું આવશ્યક છે; જો કે આ સંશ્લેષણ કરવું મુશ્કેલ અને ખર્ચાળ છે. કારણ કે ન્યુક્લિક એસિડમાં પ્રમાણમાં મોટી સંખ્યામાં પ્રોટોન હોય છે જે દ્રાવક-વિનિમયક્ષમ હોય છે, ન્યુક્લિક એસિડ એન. એમ. આર. સામાન્ય રીતે ડી 2 ઓ દ્રાવકમાં કરવામાં આવતું નથી જે અન્ય પ્રકારના એન. એમ. આર. સાથે સામાન્ય છે. આનું કારણ એ છે કે દ્રાવકમાં ડ્યુટેરિયમ વિનિમયક્ષમ પ્રોટોનને બદલશે અને તેમના સંકેતને બુઝાવી દેશે. H2O નો ઉપયોગ દ્રાવક તરીકે થાય છે, અને અન્ય પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ મજબૂત દ્રાવક સંકેતને દૂર કરવા માટે થાય છે, જેમ કે સામાન્ય પલ્સ સિક્વન્સ ("પ્રીસેચ્યુરેશન") પહેલાં દ્રાવક સંકેતને સંતૃપ્ત કરવો, જે ન્યુક્લિક એસિડ પ્રોટોન સાથે સંતૃપ્ત દ્રાવક પ્રોટોનના વિનિમયને રોકવા માટે નીચા તાપમાને શ્રેષ્ઠ રીતે કામ કરે છે; અથવા માત્ર રસના ઉત્તેજક પ્રતિધ્વનિ ("પસંદગીયુક્ત ઉત્તેજના"), જે ટોચના કંપનવિસ્તારને વિકૃત કરવાની વધારાની, સંભવિત અનિચ્છનીય અસર ધરાવે છે. માળખું નિર્ધારણ વિનિમયક્ષમ અને બિન-વિનિમયક્ષમ પ્રોટોન સામાન્ય રીતે બે સ્વતંત્ર જૂથો તરીકે તેમના ચોક્કસ શિખરોને સોંપવામાં આવે છે. વિનિમયક્ષમ પ્રોટોન માટે, જે મોટાભાગના ભાગ માટે આધાર જોડીમાં સામેલ પ્રોટોન હોય છે, NOESY નો ઉપયોગ પડોશી પાયા વચ્ચે થ્રુ-સ્પેસ સહસંબંધ શોધવા માટે થઈ શકે છે, જેનાથી સમગ્ર ડુપ્લેક્સ પરમાણુને ક્રમિક ચાલ દ્વારા સોંપવામાં આવે છે. નોન-ચેન્જેબલ પ્રોટોન માટે, જેમાંથી ઘણા ન્યુક્લિક એસિડના ખાંડના ભાગ પર હોય છે, COSY અને TOCSY નો ઉપયોગ કપલ્ડ ન્યુક્લિયસની પ્રણાલીઓને ઓળખવા માટે થાય છે, જ્યારે NOESY નો ઉપયોગ ફરીથી ખાંડને આધાર સાથે અને દરેક આધારને તેના પડોશી આધાર સાથે સાંકળવા માટે થાય છે. ડુપ્લેક્સ ડીએનએ બિન-વિનિમયક્ષમ પ્રોટોન માટે આધાર પરના H6/H8 પ્રોટોન પડોશી પાયા પરના તેમના સમકક્ષો અને ખાંડ પરના H1 'પ્રોટોન સાથે સહસંબંધ ધરાવે છે, જે ક્રમિક ચાલવાની મંજૂરી આપે છે. આર. એન. એ. માટે, રાસાયણિક માળખું અને હેલિક્સ ભૂમિતિમાં તફાવત આ સોંપણીને વધુ તકનીકી રીતે મુશ્કેલ બનાવે છે, પરંતુ હજુ પણ શક્ય છે. બિન-ડબલ હેલિકલ ન્યુક્લિક એસિડ માળખાઓ માટે ક્રમિક ચાલવાની પદ્ધતિ શક્ય નથી, ન તો ઝેડ-ડીએનએ સ્વરૂપ માટે, જે પ્રતિધ્વનિઓની સોંપણીને વધુ મુશ્કેલ બનાવે છે. સ્પેક્ટ્રમમાંથી લેવામાં આવેલા પરિમાણો, મુખ્યત્વે નોઇસી ક્રોસ-શિખરો અને જોડાણ સ્થિરાંકોનો ઉપયોગ ગ્લાયકોસિડિક બોન્ડ એંગલ, ડાયહેડ્રલ એંગલ (કારપ્લસ સમીકરણનો ઉપયોગ કરીને) અને સુગર પકર કન્ફોર્મેશન જેવી સ્થાનિક માળખાકીય સુવિધાઓ નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે. ઇમિનો પ્રોટોન રેઝોનન્સની હાજરી અથવા ગેરહાજરી, અથવા હાઇડ્રોજન બોન્ડમાં 15N અણુઓ વચ્ચે જોડાણ, બેઝપેયરિંગની હાજરી અથવા ગેરહાજરી સૂચવે છે. મોટા પાયે માળખા માટે, આ સ્થાનિક પરિમાણોને અન્ય માળખાકીય ધારણાઓ અથવા નમૂનાઓ સાથે પૂરક બનાવવું આવશ્યક છે, કારણ કે બેવડા હેલિક્સને પસાર કરવામાં આવે ત્યારે ભૂલો વધે છે, અને પ્રોટીનથી વિપરીત, બેવડા હેલિક્સમાં કોમ્પેક્ટ આંતરિક ભાગ નથી અને તે તેના પર પાછું વળતું નથી. જો કે, લાંબા અંતરની દિશા માહિતી અવશેષ દ્વિધ્રુવીય જોડાણ પ્રયોગો દ્વારા એક માધ્યમમાં મેળવી શકાય છે જે ન્યુક્લિક એસિડના અણુઓ પર નબળી ગોઠવણી લાદે છે. તાજેતરમાં, ન્યુક્લિક એસિડના માળખાના નિર્ધારણ માટે સોલિડ-સ્ટેટ એન. એમ. આર. પદ્ધતિ રજૂ કરવામાં આવી છે. પ્રોટોકોલ બે અભિગમો સૂચવે છેઃ આર. એન. એ. નું ન્યુક્લિયોટાઇડ-પ્રકારનું પસંદગીયુક્ત લેબલિંગ અને હેટેરોન્યુક્લિયર સહસંબંધ પ્રયોગોનો ઉપયોગ. એન. એમ. આર. બેન્ટ હેલિસીસ, નોન-વોટસન-ક્રિક બેઝપેયરિંગ અને કોએક્સિયલ સ્ટેકિંગ જેવી બિન-માનક ભૂમિતિઓની તપાસ માટે પણ ઉપયોગી છે. તે કુદરતી આર. એન. એ. ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સની રચનાની તપાસ કરવામાં ખાસ કરીને ઉપયોગી રહ્યું છે, જે સ્ટેમ-લૂપ્સ અને સ્યુડોકનોટ્સ જેવી જટિલ રચનાઓને અપનાવવાનું વલણ ધરાવે છે. આર. એન. એ. અને ધાતુના આયનો વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની સંખ્યાબંધ પદ્ધતિઓ દ્વારા તપાસ કરી શકાય છે, જેમાં આયન બંધન પર રાસાયણિક પરિવર્તનમાં ફેરફારનું નિરીક્ષણ, પેરામેગ્નેટિક આયન પ્રજાતિઓ માટે રેખાને વિસ્તૃત કરવાનું નિરીક્ષણ અને ધાતુના આયનોની ઓર્ગેનોમેટાલિક નકલ માટે આંતરઆણ્વિક એન. ઓ. ઈ. સંપર્કોનું નિરીક્ષણ સામેલ છે. એન. એમ. આર. પ્રોટીન અથવા દવાઓ જેવા અન્ય અણુઓ સાથે ન્યુક્લિક એસિડના અણુઓના બંધનની તપાસ કરવા માટે પણ ઉપયોગી છે. આ રાસાયણિક-શિફ્ટ મેપિંગ દ્વારા કરી શકાય છે, જે જુએ છે કે અન્ય પરમાણુના બંધન પર કયા પડઘા સ્થાનાંતરિત થાય છે, અથવા ક્રોસ-સેચ્યુરેશન પ્રયોગો દ્વારા જ્યાં બંધનકર્તા અણુઓમાંથી એક પસંદગીયુક્ત રીતે સંતૃપ્ત થાય છે અને, જો બંધાયેલ હોય, તો સંતૃપ્તિ સંકુલમાં અન્ય અણુમાં સ્થાનાંતરિત થાય છે. ડુપ્લેક્સ-સિંગલ સ્ટ્રાન્ડ ઇક્વિલિબ્રિયા જેવા ગતિશીલ ગુણધર્મો અને ડુપ્લેક્સ સાથે અન્ય અણુઓના બંધન દર પણ સ્પિન-જાળી છૂટછાટ સમય T1 પર તેની અસર દ્વારા નક્કી કરી શકાય છે, પરંતુ આ પદ્ધતિઓ 104-108 s−1 ના મધ્યવર્તી દર પ્રત્યે અસંવેદનશીલ છે, જેની સોલિડ-સ્ટેટ એન. એમ. આર. જેવી અન્ય પદ્ધતિઓ સાથે તપાસ કરવી આવશ્યક છે. ન્યુક્લીક એસિડ ડબલ હેલિક્સના યાંત્રિક ગુણધર્મોની ગતિશીલતા જેમ કે બેન્ડિંગ અને ટ્વિસ્ટિંગનો પણ એન. એમ. આર. નો ઉપયોગ કરીને અભ્યાસ કરી શકાય છે. પલ્સ્ડ ફિલ્ડ ગ્રેડિયન્ટ એન. એમ. આર. પ્રયોગોનો ઉપયોગ પ્રસરણ સ્થિરાંકોને માપવા માટે થઈ શકે છે. ઇતિહાસ ન્યુક્લિક એસિડ એન. એમ. આર. અભ્યાસો 1971 ની શરૂઆતમાં કરવામાં આવ્યા હતા, અને બેઝ પેરિંગ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની તપાસ કરવા માટે લો-ફિલ્ડ ઇમિનો પ્રોટોન રેઝોનન્સનો ઉપયોગ કરવા પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું હતું. આ પ્રારંભિક અભ્યાસોએ ટી. આર. એન. એ. પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું કારણ કે આ ન્યુક્લિક એસિડ તે સમયે ઉપલબ્ધ એકમાત્ર નમૂનાઓ હતા જે એન. એમ. આર. સ્પેક્ટ્રલ લાઇન-પહોળાઈ વ્યવહારુ હતી તેટલું ઓછું પરમાણુ વજન ધરાવતા હતા. અભ્યાસમાં નીચા ક્ષેત્રના પ્રોટોન પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરવામાં આવ્યું કારણ કે તે એકમાત્ર પ્રોટોન હતા જે તે સમયે ઉપલબ્ધ શ્રેષ્ઠ સ્પેક્ટ્રોમીટરનો ઉપયોગ કરીને જલીય દ્રાવણમાં વિશ્વસનીય રીતે જોઇ શકાય છે. તે ઝડપથી સમજાયું કે નિમ્ન-ક્ષેત્રના ઇમિનો પ્રોટોનનું સ્પેક્ટ્રા દ્રાવણમાં ટી. આર. એન. એ. ની તૃતીય માળખાને સંકેતો પૂરા પાડે છે. ડબલ-હેલિકલ ડીએનએનું પ્રથમ એન. એમ. આર. સ્પેક્ટ્રમ 1977માં કૃત્રિમ, 30-બેઝ-જોડી ડબલ હેલિક્સનો ઉપયોગ કરીને પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યું હતું. મૂળ ડીએનએમાં ગંભીર રેખા-વિસ્તરણને દૂર કરવા માટે, ડબલ-હેલિકલ ડીએનએની દ્રઢતા લંબાઈ વિશે જાણવા માટે સંપૂર્ણ-અધોગતિગ્રસ્ત કુદરતી ડીએનએ તૈયાર કરવામાં આવ્યું હતું અને તેનો અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો હતો. તે જ સમયે, ડબલ હેલિક્સની લવચીકતાની વધુ સમજ મેળવવા માટે ન્યુક્લિયોસોમ કોર કણોનો અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો હતો. પ્રતિબંધ ઉત્સેચકો સાથે બનેલા સમાન નીચા પરમાણુ વજનના મૂળ-અનુક્રમ ડીએનએ માટે નોંધાયેલ પ્રથમ એન. એમ. આર. સ્પેક્ટ્રા 1981 માં નોંધવામાં આવ્યો હતો. આ કાર્ય ઉચ્ચ ક્ષેત્ર પર મેળવેલા ન્યુક્લિક એસિડ એન. એમ. આર. સ્પેક્ટ્રાનો પ્રથમ અહેવાલ પણ હતો. 1982માં દ્વિ-પરિમાણીય એન. એમ. આર. અભ્યાસોની જાણ થવાની શરૂઆત થઈ અને પછી, ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ સંશ્લેષણ અને વધુ સુસંસ્કૃત સાધનસામગ્રીના આગમન સાથે, 1983થી શરૂ થતા ઘણા વિગતવાર માળખાકીય અભ્યાસોની જાણ કરવામાં આવી હતી. સંદર્ભો ન્યુક્લિયર મેગ્નેટિક રેઝોનન્સ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી ન્યુક્લિક એસિડ બાયોફિઝિક્સ