Primer walking
પ્રાઇમર વૉકિંગ એ એક તકનીક છે જેનો ઉપયોગ જનીન (દા. ત., રોગ જનીન) ને તેના જાણીતા નજીકના માર્કર્સ (દા. ત., જાણીતા જનીન) માંથી ક્લોન કરવા માટે થાય છે. પરિણામે, તે નાના ફેરફારો સાથે છોડ, ફૂગ અને સસ્તન પ્રાણીઓમાં ક્લોનિંગ અને અનુક્રમણિકાના પ્રયત્નોમાં કાર્યરત છે. આ તકનીક, જેને "નિર્દેશિત અનુક્રમણિકા" તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, તે ક્યાં તો સંદર્ભ ક્રમ (અનુક્રમ પુષ્ટિ સેવા) પર આધારિત જાણીતા પ્લાઝમિડ અથવા પી. સી. આર. ઉત્પાદનના સંદર્ભ ક્રમની પુષ્ટિ કરવા અથવા સંપૂર્ણ પ્લાઝમિડ અથવા પી. સી. આર. ઉત્પાદનના અજ્ઞાત ક્રમને શોધવા માટે સેન્ગર અનુક્રમણિકા પ્રતિક્રિયાઓની શ્રેણીનો ઉપયોગ કરે છે. પ્રાઇમર વૉકિંગઃ ડીએનએ સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિ પ્રાઇમર વૉકિંગ એ 1.3-7.0 kb શ્રેણી સુધી ડીએનએનો ક્રમ નક્કી કરવાની એક પદ્ધતિ છે જ્યારે રંગસૂત્ર વૉકિંગનો ઉપયોગ જનીનની પહેલેથી જ જાણીતી સિક્વન્સના ક્લોન બનાવવા માટે થાય છે. સાંકળ સમાપ્તિ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને ખૂબ લાંબા ટુકડાઓને એક જ અનુક્રમમાં અનુક્રમિત કરી શકાતા નથી. આ પદ્ધતિ લાંબા ક્રમને કેટલાક સળંગ ટૂંકા ક્રમમાં વિભાજિત કરીને કામ કરે છે. રસ ધરાવતું ડીએનએ પ્લાઝમિડ ઇન્સર્ટ, પી. સી. આર. ઉત્પાદન અથવા જીનોમનું અનુક્રમણ કરતી વખતે અંતરનું પ્રતિનિધિત્વ કરતો ટુકડો હોઈ શકે છે. "પ્રાઇમર વૉકિંગ" શબ્દનો ઉપયોગ થાય છે જ્યાં મુખ્ય ઉદ્દેશ જીનોમને અનુક્રમિત કરવાનો હોય છે. જ્યારે ક્રમ જાણીતો હોય પરંતુ જનીનનું કોઈ ક્લોન ન હોય ત્યારે તેના બદલે "રંગસૂત્ર ચાલવું" શબ્દનો ઉપયોગ થાય છે. ઉદાહરણ તરીકે, રોગ માટેનું જનીન ચોક્કસ માર્કર જેમ કે ક્રમ પર આર. એફ. એલ. પી. ની નજીક સ્થિત હોઈ શકે છે. રંગસૂત્ર ચાલવું એ એક એવી તકનીક છે જેનો ઉપયોગ જનીન (દા. ત., રોગ જનીન) ને તેના જાણીતા નજીકના માર્કર્સ (દા. ત., જાણીતા જનીન) થી ક્લોન કરવા માટે થાય છે અને તેથી તેનો ઉપયોગ છોડ, ફૂગ અને પ્રાણીઓમાં ક્લોનિંગ અને સિક્વન્સિંગ પ્રોજેક્ટ્સમાં મધ્યમ ફેરફારોમાં થાય છે. બીજી રીતે કહીએ તો, તેનો ઉપયોગ મેપ કરવા માટે જનીનની નજીક અસ્તિત્વમાં રહેલા ચોક્કસ ક્રમને શોધવા, અલગ કરવા અને ક્લોન કરવા માટે થાય છે. મોટા ટુકડાઓના પુસ્તકાલયો, મુખ્યત્વે બેક્ટેરિયલ કૃત્રિમ રંગસૂત્ર પુસ્તકાલયો, મોટે ભાગે જીનોમિક પ્રોજેક્ટ્સમાં ઉપયોગમાં લેવાય છે. ઇચ્છિત વસાહતને ઓળખવા અને ચોક્કસ ક્લોન પસંદ કરવા માટે પુસ્તકાલયની ઇચ્છિત તપાસ સાથે પ્રથમ તપાસ કરવામાં આવે છે. સ્ક્રીનીંગ કર્યા પછી, ક્લોનને પ્રોબ સાથે ઓવરલેપ કરવામાં આવે છે અને ઓવરલેપિંગ ટુકડાઓને મેપ કરવામાં આવે છે. આ ટુકડાઓનો ઉપયોગ પછી અન્ય ક્લોનને ઓળખવા માટે નવી તપાસ (ક્લોનના 3′ અથવા 5′ છેડાઓમાંથી મેળવેલા ટૂંકા ડીએનએ ટુકડાઓ) તરીકે થાય છે. લાઇબ્રેરીમાં આશરે 96 ક્લોન હોય છે અને દરેક ક્લોનમાં એક અલગ ઇન્સર્ટ હોય છે. પ્રોબ એક λ1 અને λ2 ને ઓળખે છે કારણ કે તે તેમને ઓવરલેપ કરે છે. λ2 ક્લોનમાંથી મેળવેલ પ્રોબ 2 નો ઉપયોગ λ3 ને ઓળખવા માટે થાય છે, અને તેથી વધુ. ક્લોનની દિશા ક્લોનના પ્રતિબંધ મેપિંગ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે. આમ, જનીનની નજીકમાં હાજર નવા રંગસૂત્રોના પ્રદેશોને ઓળખી શકાય છે. રંગસૂત્ર ચાલવામાં સમય લાગે છે, અને રંગસૂત્ર ઉતરાણ એ જનીન ઓળખ માટેની પસંદગીની પદ્ધતિ છે. આ પદ્ધતિ માટે માર્કરની શોધ જરૂરી છે જે મ્યુટન્ટ લોકસ સાથે નિશ્ચિતપણે સંબંધિત છે. આ ટુકડાને પહેલા ક્રમબદ્ધ કરવામાં આવે છે જાણે કે તે ટૂંકો ટુકડો હોય. ક્રમ દરેક છેડેથી યુનિવર્સલ પ્રાઈમર્સ અથવા ખાસ ડિઝાઇનનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે. આ પ્રથમ 1000 કે તેથી વધુ પાયાને ઓળખવા જોઈએ. રસના વિસ્તારને સંપૂર્ણપણે ક્રમબદ્ધ કરવા માટે, સંલગ્ન ક્રમની માહિતી મેળવવા માટે નવા પ્રાઇમરની રચના અને સંશ્લેષણ (જાણીતા ક્રમના અંતિમ 20 પાયાના પૂરક) જરૂરી છે. પ્રાઇમર વૉકિંગ વિરુદ્ધ શોટગન સિક્વન્સિંગ પ્રાઇમર વૉકિંગ એ નિર્દેશિત સિક્વન્સિંગનું ઉદાહરણ છે કારણ કે પ્રાઇમર ચોક્કસ દિશામાં સિક્વન્સિંગને માર્ગદર્શન આપવા માટે ડીએનએના જાણીતા પ્રદેશમાંથી ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યું છે. નિર્દેશિત સિક્વન્સિંગથી વિપરીત, ડીએનએનું શોટગન સિક્વન્સિંગ વધુ ઝડપી સિક્વન્સિંગ વ્યૂહરચના છે. જીનોમ સિક્વન્સિંગની "જૂના સમય" ની એક તકનીક છે. અનુક્રમણિકા માટેની અંતર્ગત પદ્ધતિ એ સેંગર સાંકળ સમાપ્તિ પદ્ધતિ છે જે 100 અને 1000 બેઝપેર્સ (ઉપયોગમાં લેવાતા સાધનોના આધારે) વચ્ચેની લંબાઈ વાંચી શકે છે. આનો અર્થ એ છે કે તમારે લાંબા ડીએનએ પરમાણુઓને તોડવા પડશે, ક્લોન કરવા પડશે અને ત્યારબાદ તેમને ક્રમબદ્ધ કરવા પડશે. બે પદ્ધતિઓ શક્ય છે. પ્રથમને રંગસૂત્ર (અથવા પ્રાઇમર) ચાલવું કહેવામાં આવે છે અને પ્રથમ ટુકડાને અનુક્રમિત કરવાથી શરૂ થાય છે. ક્રમના આગામી (સંલગ્ન) ભાગને પછી પ્રાઇમરનો ઉપયોગ કરીને અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે જે પ્રથમ ક્રમના વાંચન વગેરેના અંત માટે પૂરક છે. આ તકનીકને વધુ એસેમ્બલ કરવાની જરૂર નથી, પરંતુ તમારે ઘણાં પ્રાઈમરની જરૂર છે અને તે પ્રમાણમાં ધીમું છે. આ સમસ્યાને દૂર કરવા માટે શોટગન સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિ વિકસાવવામાં આવી હતી. અહીં ડીએનએને વિવિધ ટુકડાઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે (બધા એક જ જગ્યાએ તૂટેલા નથી), ક્લોનિંગ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા વેક્ટર માટે વિશિષ્ટ પ્રાઈમર્સ સાથે ક્લોન અને અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે. આ ઓવરલેપિંગ સિક્વન્સ તરફ દોરી જાય છે જેને પછી કમ્પ્યુટર પર એક ક્રમમાં એસેમ્બલ કરવું પડે છે. આ પદ્ધતિ અનુક્રમણિકાને સમાંતર બનાવવાની મંજૂરી આપે છે (તમે એક જ સમયે ઘણી અનુક્રમણિકા પ્રતિક્રિયાઓ તૈયાર કરી શકો છો અને તેને ચલાવી શકો છો) જે પ્રક્રિયાને વધુ ઝડપી બનાવે છે અને અનુક્રમ ચોક્કસ પ્રાઇમરની જરૂરિયાતને પણ ટાળે છે. પડકાર એ છે કે ક્રમને તેમના ક્રમમાં ગોઠવવો, કારણ કે અહીં ઓવરલેપ્સ એટલા સ્પષ્ટ નથી. આ સમસ્યાને ઉકેલવા માટે, પ્રથમ મુસદ્દો તૈયાર કરવામાં આવે છે અને પછી પ્રાઇમર વૉકિંગ જેવી અન્ય તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને નિર્ણાયક પ્રદેશોને ફરીથી અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે. પ્રક્રિયા એકંદર પ્રક્રિયા નીચે મુજબ છેઃ એક પ્રાઇમર કે જે ડીએનએની શરૂઆતને ક્રમ સાથે મેળ ખાય છે તેનો ઉપયોગ અજ્ઞાત ક્રમને અડીને આવેલા ટૂંકા ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ કરવા માટે થાય છે, જે પ્રાઇમરથી શરૂ થાય છે (જુઓ પીસીઆર). નવા ટૂંકા ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડને સાંકળ સમાપ્તિ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે. અનુક્રમિત સ્ટ્રાન્ડના અંતનો ઉપયોગ લાંબા ડીએનએ ક્રમના આગલા ભાગ માટે પ્રાઇમર તરીકે થાય છે, તેથી શબ્દ "વૉકિંગ". આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ સમગ્ર રંગસૂત્રોને ક્રમબદ્ધ કરવા માટે થઈ શકે છે (તેથી "રંગસૂત્ર ચાલવું"). પ્રાઇમર વૉકિંગ એ શોટગન સિક્વન્સિંગના વિકાસ માટેનો આધાર પણ હતો, જે ખાસ પસંદ કરેલાઓને બદલે રેન્ડમ પ્રાઇમરનો ઉપયોગ કરે છે. ક્રોમોજોમ જમ્પિંગ ક્રોમોજોમ લેન્ડિંગ શોટગન સિક્વન્સિંગ પણ જુઓ-એક વૈકલ્પિક પદ્ધતિ, જેમાં સતત સબ-સ્ટ્રેન્ડ્સને બદલે રેન્ડમનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. સંદર્ભો ડીએનએ મોલેક્યુલર બાયોલોજી