Electrophoretic mobility shift assay
ઇલેક્ટ્રોફોરેટિક મોબિલિટી શિફ્ટ એસે (ઇએમએસએ) અથવા મોબિલિટી શિફ્ટ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ, જેને જેલ શિફ્ટ એસે, જેલ મોબિલિટી શિફ્ટ એસે, બેન્ડ શિફ્ટ એસે અથવા જેલ રિટાર્ડેશન એસે તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, તે એક સામાન્ય એફિનિટી ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ તકનીક છે જેનો ઉપયોગ પ્રોટીન-ડીએનએ અથવા પ્રોટીન-આરએનએ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનો અભ્યાસ કરવા માટે થાય છે. આ પ્રક્રિયા નક્કી કરી શકે છે કે પ્રોટીન અથવા પ્રોટીનનું મિશ્રણ આપેલ ડીએનએ અથવા આરએનએ ક્રમ સાથે જોડાવા માટે સક્ષમ છે કે કેમ, અને કેટલીકવાર સૂચવી શકે છે કે બંધનકર્તા સંકુલમાં એક કરતાં વધુ પ્રોટીન પરમાણુ સામેલ છે કે કેમ. ટ્રાન્સક્રિપ્શનની શરૂઆત, ડીએનએ ગેંગ પ્રતિકૃતિ, ડીએનએ રિપેર અથવા આરએનએ પ્રક્રિયા અને પરિપક્વતાનો અભ્યાસ કરતી વખતે, તેમજ પૂર્વ-એમઆરએનએ સ્પ્લિસિંગનો અભ્યાસ કરતી વખતે જેલ શિફ્ટ એસેઝ ઘણીવાર ડીએનએઝ ફૂટપ્રિન્ટિંગ, પ્રાઇમર એક્સ્ટેંશન અને પ્રમોટર-પ્રોબ પ્રયોગો સાથે એક સાથે ઈન વિટ્રોમાં કરવામાં આવે છે. અગાઉના સાહિત્યમાં પૂર્વગામીઓ મળી શકે છે, તેમ છતાં મોટાભાગના વર્તમાન પરીક્ષણો ગાર્નર અને રેવઝિન અને ફ્રાઇડ અને ક્રોથર્સ દ્વારા વર્ણવવામાં આવેલી પદ્ધતિઓ પર આધારિત છે. સિદ્ધાંત મોબિલિટી શિફ્ટ એસે એ ટૂંકા ગાળા માટે (15 થી 20 સે. મી. જેલ માટે લગભગ 1.5-2 કલાક) પોલિઆક્રિલામાઇડ અથવા એગરોઝ જેલ પર પ્રોટીન-DNA અથવા પ્રોટીન-RNA મિશ્રણનું ઇલેક્ટ્રોફોરેટિક વિભાજન છે. જે ઝડપે વિવિધ અણુઓ (અને તેના સંયોજનો) જેલમાંથી પસાર થાય છે તે તેમના કદ અને ચાર્જ દ્વારા નક્કી થાય છે, અને ઓછા પ્રમાણમાં, તેમના આકાર દ્વારા (જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ જુઓ). કંટ્રોલ લેન (પ્રોટીન વિના ડીએનએ પ્રોબ) માં અનબાઉન્ડ ડીએનએ અથવા આરએનએ ટુકડાને અનુરૂપ એક જ બેન્ડ હશે. જો કે, એમ ધારીને કે પ્રોટીન ટુકડાને બાંધવા માટે સક્ષમ છે, પ્રોટીન સાથેની લેન જે હાજર હોય છે તેમાં અન્ય બેન્ડ હશે જે પ્રોટીન સાથે જોડાયેલા ન્યુક્લિક એસિડ પ્રોબના મોટા, ઓછા ગતિશીલ સંકુલને રજૂ કરે છે જે જેલ પર 'સ્થાનાંતરિત' થાય છે (કારણ કે તે વધુ ધીમેથી આગળ વધ્યું છે). યોગ્ય પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓમાં, ડીએનએ (અથવા આરએનએ) અને પ્રોટીન વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સ્થિર થાય છે અને જેલ પર અનબાઉન્ડ ન્યુક્લિક એસિડ સાથે બંધાયેલું પ્રમાણ મુક્ત અને બંધાયેલ પ્રોબ અણુઓના અપૂર્ણાંકને પ્રતિબિંબિત કરે છે કારણ કે બંધનકર્તા પ્રતિક્રિયા જેલમાં પ્રવેશ કરે છે. આ સ્થિરતા અંશતઃ "કેજિંગ અસર" ને કારણે છે, જેમાં પ્રોટીન, જેલ મેટ્રિક્સથી ઘેરાયેલું છે, તે ફરીથી જોડાય તે પહેલાં પ્રોબથી દૂર ફેલાવવામાં અસમર્થ છે. જો પ્રોટીન અને પ્રોબની પ્રારંભિક સાંદ્રતા જાણીતી હોય, અને જો સંકુલની સ્ટોઇકિયોમેટ્રી જાણીતી હોય, તો ન્યુક્લિક એસિડ ક્રમ માટે પ્રોટીનનું સ્પષ્ટ આકર્ષણ નક્કી કરી શકાય છે. જ્યાં સુધી જટિલ જેલની સ્થિતિમાં ખૂબ જ લાંબા સમય સુધી ટકી ન રહે, અથવા ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ દરમિયાન વિયોજનને ધ્યાનમાં લેવામાં ન આવે, ત્યાં સુધી મેળવેલ સંખ્યા એક સ્પષ્ટ Kd છે. જો પ્રોટીનની સાંદ્રતા જાણીતી ન હોય પરંતુ જટિલ સ્ટોઇકિયોમેટ્રી હોય, તો પ્રોટીનની સાંદ્રતા ડીએનએ પ્રોબની સાંદ્રતામાં વધારો કરીને નક્કી કરી શકાય છે જ્યાં સુધી વધુ વૃદ્ધિ પ્રોટીન બાઉન્ડના અપૂર્ણાંકમાં વધારો ન કરે. સમાન જેલ પર ચાલતા મુક્ત પ્રોબના પ્રમાણભૂત મંદન સમૂહની સરખામણીમાં, પ્રોટીનના મોલ્સની સંખ્યાની ગણતરી કરી શકાય છે. વિવિધતાઓ અને ઉમેરાઓ પ્રોટીનને ઓળખતી એન્ટિબોડી આ મિશ્રણમાં ઉમેરી શકાય છે જેથી વધુ પરિવર્તન સાથે વધુ મોટું સંકુલ બનાવી શકાય. આ પદ્ધતિને સુપરશિફ્ટ પરીક્ષણ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, અને તેનો ઉપયોગ પ્રોટીન-ન્યુક્લિક એસિડ સંકુલમાં હાજર પ્રોટીનને સ્પષ્ટ રીતે ઓળખવા માટે થાય છે. મોટેભાગે, બંધનકર્તા પ્રોટીન માટે સૌથી અનુકૂળ બંધનકર્તા ક્રમ નક્કી કરવા માટે હરીફ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ સાથે વધારાની લેન ચલાવવામાં આવે છે. નિર્ધારિત ક્રમના વિવિધ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો ઉપયોગ સ્પર્ધા દ્વારા ચોક્કસ બંધનકર્તા સ્થળની ઓળખની મંજૂરી આપે છે (આકૃતિમાં બતાવેલ નથી). સ્પર્ધા પરીક્ષણના પ્રકારો બંધનની વિશિષ્ટતાને માપવા માટે અને જોડાણ અને વિયોજન ગતિશાસ્ત્રના માપન માટે ઉપયોગી છે. આમ, ઇ. એમ. એસ. એ. નો ઉપયોગ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ માટે પસંદગી કરવા માટે સેલેક્સ પ્રયોગના ભાગ રૂપે પણ થઈ શકે છે જે વાસ્તવમાં આપેલ પ્રોટીનને બાંધે છે. એકવાર ડીએનએ-પ્રોટીન બંધન ઈન વિટ્રોમાં નક્કી થઈ જાય, પછી સંખ્યાબંધ અલ્ગોરિધમ્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળની ઓળખ માટેની શોધને સંકુચિત કરી શકે છે. રસના અનુલેખન પરિબળ માટે સર્વસંમતિ ક્રમ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ બંધન માટે સ્પર્ધા કરી શકશે, સ્થાનાંતરિત બેન્ડને દૂર કરશે અને સુપરશિફ્ટ દ્વારા તેની પુષ્ટિ કરવી આવશ્યક છે. જો અનુમાનિત સર્વસંમતિ ક્રમ બંધન માટે સ્પર્ધા કરવામાં નિષ્ફળ જાય, તો અનુલેખન પરિબળની ઓળખને મલ્ટિપ્લેક્સ્ડ કોમ્પિટિટર ઇ. એમ. એસ. એ. (એમ. સી.-ઇ. એમ. એસ. એ.) દ્વારા મદદ મળી શકે છે, જેમાં દરેક પ્રતિક્રિયામાં સર્વસંમતિ ક્રમના મોટા સમૂહને મલ્ટિપ્લેક્સ કરવામાં આવે છે, અને જ્યાં એક સમૂહ બંધન માટે સ્પર્ધા કરે છે, ત્યાં આ સમૂહમાંથી વ્યક્તિગત સર્વસંમતિ ક્રમ વધુ પ્રતિક્રિયામાં ચલાવવામાં આવે છે. વિઝ્યુલાઇઝેશન હેતુઓ માટે, ન્યુક્લિક એસિડના ટુકડાને સામાન્ય રીતે કિરણોત્સર્ગી, ફ્લોરોસન્ટ અથવા બાયોટિન લેબલ સાથે લેબલ કરવામાં આવે છે. પ્રમાણભૂત ઇથિડિયમ બ્રોમાઇડ સ્ટેનિંગ આ પદ્ધતિઓ કરતાં ઓછું સંવેદનશીલ હોય છે અને જો આ પ્રયોગોમાં નાના પ્રમાણમાં ન્યુક્લિક એસિડ અથવા સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ન્યુક્લિક એસિડ (ઓ) નો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો ન્યુક્લિક એસિડને શોધવા માટે સંવેદનશીલતાનો અભાવ હોઈ શકે છે. બાયોટિન લેબલનો ઉપયોગ કરતી વખતે, હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ જેવા એન્ઝાઇમ સાથે સંયોજિત સ્ટ્રેપ્ટાવિડિનનો ઉપયોગ ડીએનએ ટુકડાને શોધવા માટે થાય છે. જ્યારે આઇસોટોપિક ડીએનએ લેબલિંગ પ્રોટીન બંધનકર્તા આકર્ષણ પર ઓછી અથવા કોઈ અસર કરતું નથી, ત્યારે ફ્લુરોફોર્સ અથવા બાયોટિન સહિતના બિન-આઇસોટોપિક લેબલ્સનો ઉપયોગ રસના પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના આકર્ષણ અને/અથવા સ્ટોઇકિયોમેટ્રીને બદલી શકે છે. ફ્લોરોફોર-અથવા બાયોટિન-લેબલવાળા પ્રોબ અને સમાન ક્રમના લેબલ વગરના ડીએનએ વચ્ચેની સ્પર્ધાનો ઉપયોગ એ નક્કી કરવા માટે કરી શકાય છે કે લેબલ બંધનકર્તા આકર્ષણ અથવા સ્ટોઇકિયોમેટ્રીમાં ફેરફાર કરે છે કે કેમ. સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ કેમિલ્યુમિનેસેન્ટ જેલ શિફ્ટ પ્રોટોકોલ જિનેટિક્સ તકનીકો મોલેક્યુલર જિનેટિક્સ મોલેક્યુલર બાયોલોજી પ્રોટીન પદ્ધતિઓ પ્રોટિઓમિક્સ વિશ્લેષણાત્મક રસાયણશાસ્ત્ર પ્રયોગશાળા તકનીકો ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ જૈવિક તકનીકો અને સાધનો