Rapid amplification of cDNA ends
સી. ડી. એન. એ. એન્ડનું ઝડપી વિસ્તરણ (આર. એ. સી. ઈ.) એ મોલેક્યુલર બાયોલોજીમાં કોષની અંદર જોવા મળતા આર. એન. એ. ટ્રાન્સક્રિપ્ટનો સંપૂર્ણ લંબાઈ ક્રમ મેળવવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી એક તકનીક છે. આર. એ. સી. ઈ. ના પરિણામે રસના આર. એન. એ. ક્રમની સી. ડી. એન. એ. નકલનું ઉત્પાદન થાય છે, જે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન દ્વારા ઉત્પન્ન થાય છે, ત્યારબાદ સી. ડી. એન. એ. નકલોનું પી. સી. આર. વિસ્તરણ થાય છે (જુઓ આર. ટી.-પી. સી. આર.). વિસ્તૃત cDNA નકલો પછી અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે અને, જો પૂરતી લાંબી હોય, તો એક અનન્ય જીનોમિક પ્રદેશમાં નકશો બનાવવો જોઈએ. આર. એ. સી. ઇ. ને સામાન્ય રીતે મૂળભૂત રીતે વ્યક્તિગત આર. એન. એ. અણુઓના અનુક્રમ પહેલાં ક્લોનિંગ દ્વારા અનુસરવામાં આવે છે. વધુ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ વિકલ્પ જે નવીન ટ્રાન્સક્રિપ્ટ માળખાઓની ઓળખ માટે ઉપયોગી છે, તે આગામી પેઢીની અનુક્રમણિકા તકનીકો દ્વારા RACE-ઉત્પાદનોને અનુક્રમિત કરવાનું છે. પ્રક્રિયા આર. એ. સી. ઇ. આર. એન. એ. ના 5 'અંત (5' આર. એ. સી. ઇ.-પી. સી. આર.) અથવા 3 'અંત (3' આર. એ. સી. ઇ.-પી. સી. આર.) સુધી ટ્રાન્સક્રિપ્ટની અંદરના નાના જાણીતા ક્રમમાંથી આર. એન. એ. ટ્રાન્સક્રિપ્ટનો ક્રમ પ્રદાન કરી શકે છે. આ તકનીકને કેટલીકવાર એકતરફી પી. સી. આર. અથવા એન્કર પી. સી. આર. કહેવામાં આવે છે. આર. એ. સી. ઈ. માં પ્રથમ પગલું એ છે કે આર. એન. એ. ટ્રાન્સક્રિપ્ટના પ્રદેશની સી. ડી. એન. એ. નકલ બનાવવા માટે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનનો ઉપયોગ કરવો. આ પ્રક્રિયામાં, લખાણના કેન્દ્રમાંથી જાણીતા ક્રમનો ઉપયોગ કરીને લખાણના અજ્ઞાત અંતિમ ભાગની નકલ કરવામાં આવે છે. નકલ કરેલ પ્રદેશ 5 'અથવા 3' ના છેડે જાણીતા ક્રમ દ્વારા બંધાયેલો છે. 5 'અથવા 3' જાતિઓ માટેના પ્રોટોકોલ સહેજ અલગ છે. 5 'આર. એ. સી. ઇ.-પી. સી. આર. એન્ટી-સેન્સ (રિવર્સ) ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રાઇમરનો ઉપયોગ કરીને સી. ડી. એન. એ. સંશ્લેષણ (અથવા રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન) પ્રતિક્રિયાના પ્રથમ રાઉન્ડ માટે નમૂના તરીકે એમ. આર. એન. એ. નો ઉપયોગ કરવાનું શરૂ કરે છે જે રસના જનીનની મધ્યમાં જાણીતા ક્રમને ઓળખે છે; પ્રાઇમરને જનીન વિશિષ્ટ પ્રાઇમર (જી. એસ. પી.) કહેવામાં આવે છે. પ્રાઇમર એમ. આર. એન. એ. સાથે જોડાય છે, અને એન્ઝાઇમ રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ ચોક્કસ સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ સી. ડી. એન. એ. ઉત્પાદન પેદા કરવા માટે પ્રાઇમરના 3 'છેડે બેઝ જોડી ઉમેરે છે; આ એમ. આર. એન. એ. નું વિપરીત પૂરક છે. સી. ડી. એન. એ. સંશ્લેષણ પછી, એન્ઝાઇમ ટર્મિનલ ડીઓક્સિન્યુક્લિયોટિડિલ ટ્રાન્સફર (ટી. ડી. ટી.) નો ઉપયોગ સી. ડી. એન. એ. ના 3 'છેડે સમાન ન્યુક્લિયોટાઇડ્સની દોરી ઉમેરવા માટે થાય છે, જેને હોમોપોલિમરિક પૂંછડી તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. (ડી નોવો સી. ડી. એન. એ. સંશ્લેષણના પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ માટે 3 '-ટર્મિનલ ક્રમ ઉમેરવાની કેટલીક અન્ય રીતો છે જે હોમોપોલિમેરિક ટેલિંગ કરતાં વધુ કાર્યક્ષમ છે, પરંતુ પદ્ધતિનો અર્થ સમાન રહે છે). ત્યારબાદ પી. સી. આર. હાથ ધરવામાં આવે છે, જે બીજા એન્ટી-સેન્સ જનીન સ્પેસિફિક પ્રાઇમર (જી. એસ. પી. 2) નો ઉપયોગ કરે છે જે જાણીતા ક્રમ સાથે જોડાય છે, અને એક સેન્સ (ફોરવર્ડ) યુનિવર્સલ પ્રાઇમર (યુપી) જે હોમોપોલિમરિક પૂંછડીને સી. ડી. એન. એ. ના 3 'છેડા સાથે જોડે છે જેથી સી. ડી. એન. એ. ઉત્પાદનને 5' છેડાથી વિસ્તૃત કરી શકાય. 3 'આર. એ. સી. ઇ.-પી. સી. આર. કુદરતી પોલીએ પૂંછડીનો ઉપયોગ કરે છે જે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન દરમિયાન પ્રાઇમિંગ માટે તમામ યુકેરીયોટિક એમ. આર. એન. એ. ના 3' છેડે અસ્તિત્વ ધરાવે છે, તેથી આ પદ્ધતિમાં ટી. ડી. ટી. દ્વારા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ ઉમેરવાની જરૂર નથી. સી. ડી. એન. એ. ઓલિગો-ડી. ટી.-એડેપ્ટર પ્રાઇમર (ડીઓક્સી-થાઇમિન ન્યુક્લિયોટાઇડ્સના ટૂંકા ક્રમ સાથેનું પ્રાઇમર) નો ઉપયોગ કરીને ઉત્પન્ન થાય છે જે પોલીએ સ્ટ્રેચને પૂરક બનાવે છે અને દરેક સી. ડી. એન. એ. ના 5 'છેડે એક વિશેષ એડેપ્ટર ક્રમ ઉમેરે છે. ત્યારબાદ પી. સી. આર. નો ઉપયોગ સેન્સ જી. એસ. પી. નો ઉપયોગ કરીને જાણીતા પ્રદેશમાંથી 3 'સી. ડી. એન. એ. ને વધારવા માટે થાય છે, અને એડેપ્ટર ક્રમના પૂરક એન્ટી-સેન્સ પ્રાઇમરનો ઉપયોગ થાય છે. RACE-અનુક્રમણિકા RACE દ્વારા પેદા થતા cDNA અણુઓને ઉચ્ચ-થ્રુપુટ અનુક્રમણિકા તકનીકો (જેને RACE-SEQ પણ કહેવાય છે) નો ઉપયોગ કરીને અનુક્રમિત કરી શકાય છે. મોલેક્યુલર ક્લોનિંગ સાથે RACE ટુકડાઓના પરંપરાગત લાક્ષણિકતાઓની સરખામણીમાં RACE ટુકડાઓનું હાઇ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ લાક્ષણિકતા ખૂબ જ સમય-કાર્યક્ષમ, વધુ સંવેદનશીલ, ઓછું ખર્ચાળ અને તકનીકી રીતે શક્ય છે. ઇતિહાસ અને ઉપયોગો RACE નો ઉપયોગ RNA અણુઓના અજ્ઞાત 5 '(5'-RACE) અથવા 3 '(3'-RACE) ભાગોને વધારવા માટે થઈ શકે છે જ્યાં RNA ક્રમનો ભાગ જનીન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર દ્વારા જાણીતો અને લક્ષિત હોય છે. આ વિસ્તૃત RACE ઉત્પાદનોની લાક્ષણિકતા માટે ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ સાથે જોડાઈને, કોઈપણ પ્રકારના કોડિંગ અથવા બિન-કોડિંગ RNA-અણુઓની લાક્ષણિકતા માટે અભિગમ લાગુ કરવો શક્ય છે. ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ સાથે RACE ને જોડવાનો વિચાર સૌપ્રથમ 2009 માં ડીપ-RACE તરીકે રજૂ કરવામાં આવ્યો હતો જેથી એક જ કોષ-રેખામાં 17 જનીનોના ટ્રાન્સક્રિપ્શન સ્ટાર્ટ સાઇટ્સ (TSS) નું મેપિંગ કરી શકાય. ઉદાહરણ તરીકે, 2014ના એક અભ્યાસમાં કૃત્રિમ એસ. આઈ. આર. એન. એ. દ્વારા નિર્દેશિત લક્ષ્ય આર. એન. એ. ના ક્લેવેજ સાઇટ્સનો સચોટ નકશો બનાવવા માટે, આ અભિગમને સૌપ્રથમ આર. એ. સી. ઈ.-સેક નામ આપવામાં આવ્યું હતું. વધુમાં, આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કોલોરેક્ટલ કેન્સરમાં નવલકથા લખાણોના સંપૂર્ણ લંબાઈના અજ્ઞાત ભાગો અને ફ્યુઝન લખાણોને દર્શાવવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. એલ. એન. સી. આર. એન. એ. ના અજ્ઞાત ટ્રાન્સક્રિપ્ટ માળખાને લાક્ષણિકતા આપવાના લક્ષ્યવાળા અન્ય એક અભ્યાસમાં, આર. એ. સી. ઈ. નો ઉપયોગ અર્ધ-લાંબા 454 ક્રમ સાથે કરવામાં આવ્યો હતો. મોલેક્યુલર ક્લોનિંગઃ એ લેબોરેટરી મેન્યુઅલ (આવૃત્તિઓ. સેમ્બ્રૂક, જે. ) પ્રકરણ 8 પ્રોટોકોલ 9,854 − 8.60 (કોલ્ડ સ્પ્રિંગ હાર્બર લેબોરેટરી પ્રેસ, કોલ્ડ સ્પ્રિંગ હાર્બર, ન્યૂ યોર્ક, યુએસએ, 2001) પ્રિન્સિપલ્સ ઓફ જીન મેનિપ્યુલેશન એન્ડ જીનોમિક્સ, એસ. બી. પ્રિમરોઝ અને આર. એમ. ટ્વિમેન, બ્લેકવેલ પબ્લિશિંગ, 2006 (7મી આવૃત્તિ. ), પૃષ્ઠો 111-12. બાહ્ય કડીઓ બ્લોગ લેખ RACE-SEQ બાયોકેમિસ્ટ્રી ડિટેક્શન પદ્ધતિઓ આનુવંશિક મેપિંગ આનુવંશિક તકનીકો મોલેક્યુલર બાયોલોજી વિશે