Immunofluorescence
ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સ એ એક તકનીક છે જેનો ઉપયોગ ફ્લોરોસન્સ માઇક્રોસ્કોપ સાથે પ્રકાશ માઇક્રોસ્કોપી માટે થાય છે અને તેનો ઉપયોગ મુખ્યત્વે જૈવિક નમૂનાઓ પર થાય છે. આ તકનીક કોષની અંદર ચોક્કસ બાયોમોલેક્યુલ લક્ષ્યો માટે ફ્લોરોસન્ટ રંગોને લક્ષ્ય બનાવવા માટે તેમના એન્ટિજેન માટે એન્ટિબોડીઝની ચોક્કસતાનો ઉપયોગ કરે છે, અને તેથી નમૂના દ્વારા લક્ષ્ય પરમાણુના વિતરણની કલ્પના કરવાની મંજૂરી આપે છે. એન્ટિબોડી એન્ટિજેન પર જે ચોક્કસ વિસ્તારને ઓળખે છે તેને એપિટોપ કહેવામાં આવે છે. એપિટોપ મેપિંગમાં પ્રયાસો કરવામાં આવ્યા છે કારણ કે ઘણા એન્ટિબોડીઝ સમાન એપિટોપને બાંધી શકે છે અને એન્ટિબોડીઝ વચ્ચેના બંધનનું સ્તર જે સમાન એપિટોપને ઓળખે છે તે બદલાઈ શકે છે. વધુમાં, એન્ટિબોડી સાથે ફ્લોરોફોરનું બંધન એન્ટિબોડીની રોગપ્રતિકારક વિશિષ્ટતા અથવા તેના એન્ટિજેનની બંધન ક્ષમતામાં દખલ કરી શકતું નથી. ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સ એ ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગ (પ્રોટીનને ડાઘવા માટે એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ) નું વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતું ઉદાહરણ છે અને તે ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી (પેશીઓમાં એન્ટિબોડી-એન્ટિજેન સંબંધનો ઉપયોગ) નું ચોક્કસ ઉદાહરણ છે. આ તકનીક મુખ્યત્વે એન્ટિબોડીઝના સ્થાનની કલ્પના કરવા માટે ફ્લોરોફોર્સનો ઉપયોગ કરે છે. ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સનો ઉપયોગ પેશી વિભાગો, સંવર્ધિત કોષ રેખાઓ અથવા વ્યક્તિગત કોષો પર થઈ શકે છે, અને તેનો ઉપયોગ પ્રોટીન, ગ્લાયકેન્સ અને નાના જૈવિક અને બિન-જૈવિક અણુઓના વિતરણનું વિશ્લેષણ કરવા માટે થઈ શકે છે. આ તકનીકનો ઉપયોગ મધ્યવર્તી કદના તંતુઓ જેવી રચનાઓની કલ્પના કરવા માટે પણ થઈ શકે છે. જો કોષ પટલની ટોપોલોજી હજુ નક્કી કરવામાં આવી નથી, તો રચનાઓ નક્કી કરવા માટે પ્રોટીનમાં એપિટોપ નિવેશનો ઉપયોગ ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સ સાથે થઈ શકે છે. ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સનો ઉપયોગ ડીએનએ મિથાઇલેશનના સ્તરો અને સ્થાનિકીકરણ પેટર્નની સમજ મેળવવા માટે "અર્ધ-માત્રાત્મક" પદ્ધતિ તરીકે પણ થઈ શકે છે કારણ કે તે સાચી માત્રાત્મક પદ્ધતિઓ કરતાં વધુ સમય લેતી પદ્ધતિ છે અને મિથાઇલેશનના સ્તરોના વિશ્લેષણમાં થોડી વ્યક્તિલક્ષીતા છે. ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સનો ઉપયોગ ફ્લોરોસન્ટ સ્ટેનિંગની અન્ય બિન-એન્ટિબોડી પદ્ધતિઓ સાથે સંયોજનમાં થઈ શકે છે, ઉદાહરણ તરીકે, ડીએનએ લેબલ કરવા માટે ડીએપીઆઈનો ઉપયોગ. ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સ નમૂનાઓના વિશ્લેષણ માટે કેટલીક માઇક્રોસ્કોપ ડિઝાઇનનો ઉપયોગ કરી શકાય છે; સૌથી સરળ એપિફ્લોરેસેન્સ માઇક્રોસ્કોપ છે, અને કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપનો પણ વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે. વિવિધ સુપર-રિઝોલ્યુશન માઇક્રોસ્કોપ ડિઝાઇનનો પણ ઉપયોગ કરી શકાય છે જે ખૂબ ઊંચા રિઝોલ્યુશનમાં સક્ષમ છે. પ્રકાર ફ્લોરોસન્સની તૈયારી ફ્લોરોક્રોમ-લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝ બનાવવા માટે, ફ્લોરોક્રોમને એન્ટિબોડી સાથે સંયોજિત ("ટેગ") કરવું આવશ્યક છે. તેવી જ રીતે, ફ્લોરોસન્ટ એન્ટિજેન તકનીક તરીકે ઓળખાતી તકનીકમાં ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ સાથે એન્ટિજેનને એન્ટિબોડી સાથે પણ જોડી શકાય છે. સ્ટેનિંગ પ્રક્રિયાઓ કોષરસમાં નિશ્ચિત એન્ટિજેન અથવા જીવંત કોષો પર કોષ સપાટીના એન્ટિજેન્સ બંને પર લાગુ થઈ શકે છે, જેને "મેમ્બ્રેન ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સ" કહેવાય છે. એન્ટીબોડી-એન્ટિજેન સંકુલના પૂરકને ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ સાથે લેબલ કરવું પણ શક્ય છે. ફ્લોરોસન્સ પ્રોબ્સ જે તત્વ સાથે જોડાયેલા છે તે ઉપરાંત, ઇમ્યુનોફ્લોરેસન્સ તકનીકોના બે સામાન્ય વર્ગો છેઃ પ્રાથમિક અને માધ્યમિક. નીચેના વર્ણનો મુખ્યત્વે સંયુગ્મિત એન્ટિબોડીઝની દ્રષ્ટિએ આ વર્ગો પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરશે. ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ તકનીકોના બે વર્ગો છે, પ્રાથમિક (અથવા પ્રત્યક્ષ) અને ગૌણ (અથવા પરોક્ષ). પ્રાથમિક (સીધા) પ્રાથમિક (સીધા) ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ એક જ, પ્રાથમિક એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરે છે, જે રાસાયણિક રીતે ફ્લોરોફોર સાથે જોડાયેલી હોય છે. પ્રાથમિક એન્ટિબોડી લક્ષ્ય પરમાણુ (એન્ટિજેન) ને ઓળખે છે અને એપિટોપ તરીકે ઓળખાતા ચોક્કસ પ્રદેશ સાથે જોડાય છે. આ એક એવી પ્રક્રિયા દ્વારા પરિપૂર્ણ થાય છે જે અનુકૂલનશીલ રોગપ્રતિકારક શક્તિ સાથે જીવતંત્રના રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવમાં હેરફેર કરે છે. જોડાયેલ ફ્લોરોફોરને ફ્લોરોસન્ટ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા શોધી શકાય છે, જે, ઉપયોગમાં લેવાતા સંદેશવાહક પર આધાર રાખીને, એકવાર ઉત્તેજિત થયા પછી પ્રકાશની ચોક્કસ તરંગલંબાઇનું ઉત્સર્જન કરશે. ડાયરેક્ટ ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ, જોકે કંઈક અંશે ઓછું સામાન્ય છે, તે ગૌણ (પરોક્ષ) પ્રક્રિયા કરતાં નોંધપાત્ર ફાયદા ધરાવે છે. એન્ટીબોડી સાથે સંદેશવાહકનું સીધું જોડાણ પ્રક્રિયામાં પગલાંની સંખ્યાને ઘટાડે છે, સમયની બચત કરે છે અને બિન-વિશિષ્ટ પૃષ્ઠભૂમિ સંકેતને ઘટાડે છે. આ સમગ્ર પ્રક્રિયા દરમિયાન એન્ટિબોડી ક્રોસ-રિએક્ટિવિટી અને સંભવિત ભૂલોની શક્યતાને પણ મર્યાદિત કરે છે. જો કે, આ પદ્ધતિમાં કેટલાક ગેરફાયદા છે. પ્રાથમિક એન્ટિબોડી સાથે બંધાયેલા ફ્લોરોસન્ટ અણુઓની સંખ્યા મર્યાદિત હોવાથી, સીધી ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ પરોક્ષ ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ કરતાં નોંધપાત્ર રીતે ઓછી સંવેદનશીલ હોય છે અને ખોટા નકારાત્મક પરિણામોમાં પરિણમી શકે છે. ડાયરેક્ટ ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ માટે વધુ પ્રાથમિક એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરવાની પણ જરૂર પડે છે, જે અત્યંત ખર્ચાળ હોય છે, કેટલીકવાર $400.00/mL સુધી ચાલે છે. સેકન્ડરી (પરોક્ષ) સેકન્ડરી (પરોક્ષ) ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ બે એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરે છે; લેબલ વગરની પ્રથમ (પ્રાથમિક) એન્ટિબોડી ખાસ કરીને લક્ષ્ય પરમાણુને જોડે છે, અને સેકન્ડરી એન્ટિબોડી, જે ફ્લોરોફોર વહન કરે છે, પ્રાથમિક એન્ટિબોડીને ઓળખે છે અને તેની સાથે જોડાય છે. બહુવિધ ગૌણ એન્ટિબોડીઝ એક પ્રાથમિક એન્ટિબોડીને બાંધી શકે છે. આ પ્રતિજન ફ્લોરોફોર અણુઓની સંખ્યામાં વધારો કરીને સંકેત વૃદ્ધિ પ્રદાન કરે છે. આ પ્રોટોકોલ ઉપરના પ્રાથમિક (અથવા સીધા) પ્રોટોકોલ કરતાં વધુ જટિલ અને સમય માંગી લે તેવું છે, પરંતુ વધુ લવચીકતાને મંજૂરી આપે છે કારણ કે આપેલ પ્રાથમિક એન્ટિબોડી માટે વિવિધ ગૌણ એન્ટિબોડીઝ અને શોધ તકનીકોનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. આ પ્રોટોકોલ શક્ય છે કારણ કે એન્ટિબોડીમાં બે ભાગો હોય છે, એક ચલ પ્રદેશ (જે એન્ટિજેનને ઓળખે છે) અને સતત પ્રદેશ (જે એન્ટિબોડી મોલેક્યુલનું માળખું બનાવે છે). એ સમજવું અગત્યનું છે કે આ વિભાજન કૃત્રિમ છે અને વાસ્તવમાં એન્ટિબોડી પરમાણુ ચાર પોલિપેપ્ટાઇડ સાંકળો છેઃ બે ભારે સાંકળો અને બે હળવી સાંકળો. એક સંશોધક ઘણા પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ પેદા કરી શકે છે જે વિવિધ એન્ટિજેન્સ (વિવિધ ચલ પ્રદેશો ધરાવે છે) ને ઓળખે છે, પરંતુ બધા એક જ સ્થિર વિસ્તાર ધરાવે છે. તેથી આ તમામ એન્ટિબોડીઝને એક ગૌણ એન્ટિબોડી દ્વારા ઓળખી શકાય છે. આ સીધા જ ફ્લોરોફોર વહન કરવા માટે પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝમાં ફેરફાર કરવાનો ખર્ચ બચાવે છે. વિવિધ સ્થિર પ્રદેશો સાથેના વિવિધ પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ સામાન્ય રીતે વિવિધ પ્રજાતિઓમાં એન્ટિબોડીઝને વધારીને ઉત્પન્ન થાય છે. ઉદાહરણ તરીકે, સંશોધક બકરીમાં પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ બનાવી શકે છે જે ઘણા એન્ટિજેન્સને ઓળખે છે, અને પછી રંગ-જોડી સસલાના ગૌણ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરે છે જે બકરીના એન્ટિબોડીઝ સ્થિર પ્રદેશ ("સસલા વિરોધી બકરી" એન્ટિબોડીઝ) ને ઓળખે છે. ત્યારબાદ સંશોધક ઉંદરમાં પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝનો બીજો સમૂહ બનાવી શકે છે જેને અલગ "ગધેડા વિરોધી ઉંદર" ગૌણ એન્ટિબોડી દ્વારા ઓળખી શકાય છે. આ બહુવિધ પ્રયોગોમાં મુશ્કેલ-થી-બનાવવા માટે રંગ-જોડી એન્ટિબોડીઝનો ફરીથી ઉપયોગ કરવાની મંજૂરી આપે છે. મર્યાદાઓ મોટાભાગની ફ્લોરોસન્સ તકનીકોની જેમ, ઇમ્યુનોફ્લોરોસન્સની નોંધપાત્ર સમસ્યા ફોટોબ્લીચિંગ છે. ફોટોબ્લીચિંગને કારણે થતી પ્રવૃત્તિના નુકસાનને પ્રકાશના સંપર્કની તીવ્રતા અથવા સમયગાળાને ઘટાડીને અથવા મર્યાદિત કરીને, ફ્લોરોફોર્સની સાંદ્રતામાં વધારો કરીને અથવા વધુ મજબૂત ફ્લોરોફોર્સનો ઉપયોગ કરીને નિયંત્રિત કરી શકાય છે જે વિરંજન માટે ઓછા સંવેદનશીલ હોય છે (દા. ત., એલેક્સા ફ્લોર, સેટા ફ્લોર અથવા ડાયલાઈટ ફ્લોર). આ તકનીકમાંથી ઊભી થઈ શકે તેવી કેટલીક સમસ્યાઓમાં ઓટોફ્લોરોસન્સ, બાહ્ય અનિચ્છનીય ચોક્કસ ફ્લોરોસન્સ અને બિન-વિશિષ્ટ ફ્લોરોસન્સનો સમાવેશ થાય છે. ઓટોફ્લોરોસેન્સમાં નમૂનાની પેશીઓ અથવા કોષમાંથી જ ઉત્સર્જિત ફ્લોરોસન્સનો સમાવેશ થાય છે. જ્યારે લક્ષિત એન્ટિજેન અશુદ્ધ હોય અને તેમાં એન્ટિજેનિક અશુદ્ધિઓ હોય ત્યારે બાહ્ય અનિચ્છનીય ચોક્કસ ફ્લોરોસન્સ થાય છે. બિન-વિશિષ્ટ ફ્લોરોસન્સમાં ફ્લોરોફોર, અયોગ્ય ફિક્સેશન અથવા સૂકવેલા નમૂનાને કારણે પ્રોબની વિશિષ્ટતાની ખોટનો સમાવેશ થાય છે. જ્યારે કોષની અંદરની રચનાઓની કલ્પના કરવાની હોય ત્યારે ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સ માત્ર નિશ્ચિત (એટલે કે, મૃત) કોષો સુધી મર્યાદિત હોય છે કારણ કે ફ્લોરોસન્ટ લેબલ સાથે પ્રતિક્રિયા કરતી વખતે એન્ટિબોડીઝ કોષ પટલમાં પ્રવેશતા નથી. એન્ટિજેનિક સામગ્રીને કોષની અંદર તેના કુદરતી સ્થાનિકીકરણના સ્થળ પર નિશ્ચિતપણે નિશ્ચિત કરવી આવશ્યક છે. વિવોમાં કેન્સરના કોષોને રંગવા માટે સઘન એન્ટિબોડીઝ પણ ખૂબ મોટી હોઈ શકે છે. તેમનું કદ ગાંઠના ધીમા પ્રવેશ અને લાંબા ફરતા અર્ધ-જીવનમાં પરિણમે છે. આ મર્યાદાની આસપાસ જવા માટે ડાયાબોડીઝના ઉપયોગની તપાસ માટે સંશોધન કરવામાં આવ્યું છે. સુપરનેટન્ટમાં અથવા કોષ પટલની બહારના પ્રોટીન એન્ટિબોડીઝ દ્વારા બંધાયેલા હોઈ શકે છે; આ જીવંત કોષોને રંગીન બનાવવાની મંજૂરી આપે છે. ઉપયોગમાં લેવાતા ફિક્સેટિવના આધારે, રસના પ્રોટીન ક્રોસ-લિંક્ડ બની શકે છે અને આ બિન-વિશિષ્ટ બંધનને કારણે ખોટા હકારાત્મક અથવા ખોટા નકારાત્મક સંકેતોમાં પરિણમી શકે છે. એક વૈકલ્પિક અભિગમ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન ડોમેન્સ ધરાવતા રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીનનો ઉપયોગ કરવાનો છે, દા. ત., ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (જીએફપી). આવા "ટેગ કરેલા" પ્રોટીનનો ઉપયોગ જીવંત કોષોમાં તેમના સ્થાનિકીકરણના નિર્ધારણને મંજૂરી આપે છે. જો કે આ ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સનો એક ભવ્ય વિકલ્પ લાગે છે, તેમ છતાં કોષોને જી. એફ. પી.-ટેગથી સંક્રમિત અથવા સંક્રમિત કરવા પડે છે, અને પરિણામે તેઓ ઓછામાં ઓછા એસ1 અથવા તેનાથી ઉપરના સજીવો બની જાય છે જેને પ્રયોગશાળામાં કડક સુરક્ષા ધોરણોની જરૂર હોય છે. આ તકનીકમાં કોષોની આનુવંશિક માહિતીમાં ફેરફારનો સમાવેશ થાય છે. પ્રગતિ આ પદ્ધતિમાં ઘણા સુધારા ફ્લોરોસન્ટ માઇક્રોસ્કોપ અને ફ્લોરોફોર્સના સુધારામાં છે. સુપર-રિઝોલ્યુશન પદ્ધતિઓ સામાન્ય રીતે એબ્બે મર્યાદા (તેની તરંગલંબાઇને કારણે પ્રકાશ પર મૂકવામાં આવેલી મર્યાદા) ની નીચે રિઝોલ્યુશન ઉત્પન્ન કરવાની માઇક્રોસ્કોપની ક્ષમતાનો સંદર્ભ આપે છે. આ વિવર્તન મર્યાદા બાજુની દિશામાં લગભગ 200-300 nm અને અક્ષીય દિશામાં 500-700 nm છે. આ મર્યાદા કોષની કેટલીક રચનાઓ કરતાં તુલનાત્મક અથવા મોટી છે, અને પરિણામે, આ મર્યાદા વૈજ્ઞાનિકોને તેમની રચનામાં વિગતો નક્કી કરવામાં અટકાવે છે. ફ્લોરોસન્સમાં સુપર-રિઝોલ્યુશન, વધુ સ્પષ્ટ રીતે, નજીકના સ્પેક્ટ્રલી સમાન ફ્લોરોફોર્સના એક સાથે ફ્લોરોસન્સને રોકવા માટે માઇક્રોસ્કોપની ક્ષમતાનો ઉલ્લેખ કરે છે. આ પ્રક્રિયા માઇક્રોસ્કોપના બિંદુ-પ્રસાર કાર્યને અસરકારક રીતે તીક્ષ્ણ બનાવે છે. તાજેતરમાં વિકસિત સુપર-રિઝોલ્યુશન ફ્લોરોસન્ટ માઇક્રોસ્કોપ પદ્ધતિઓના ઉદાહરણોમાં સ્ટિમ્યુલેટેડ એમિશન ડિપ્લીશન (STED) માઇક્રોસ્કોપી, સેચ્યુરેટેડ સ્ટ્રક્ચર્ડ-ઇલ્યૂમિનેશન માઇક્રોસ્કોપી (SSIM), ફ્લોરોસન્સ ફોટોએક્ટિવેશન લોકલાઇઝેશન માઇક્રોસ્કોપી (FPALM) અને સ્ટોકેસ્ટિક ઓપ્ટિકલ રિકન્સ્ટ્રક્શન માઇક્રોસ્કોપી (STORM) નો સમાવેશ થાય છે. નોંધપાત્ર લોકો કોર્નેલિયા મિશેલ ડાઉન્સ (1892-1987), માઇક્રોબાયોલોજિસ્ટ અને પત્રકાર ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ સાથે ત્વચાની સ્થિતિઓ પણ જુઓ ઇમ્યુનોકેમિસ્ટ્રી પેચિંગ અને કેપિંગ સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ બર્મિંગહામ યુનિવર્સિટી ખાતે ઓટોઇમ્યુન રોગો સાથે સંકળાયેલી છબીઓ ડેવિડસન કોલેજમાં ઇમ્યુનોલોજિક પરીક્ષણો જૈવિક તકનીકો અને સાધનો પેથોલોજી એનાટોમિકલ પેથોલોજી જીવન વિજ્ઞાન ઉદ્યોગ બાયોકેમિસ્ટ્રી માટે રીએજન્ટ્સ