Bicinchoninic acid assay
બાયસિન્કોનિક એસિડ એસે (બીસીએ એસે), જેને સ્મિથ એસે તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, તેના શોધક, પિયર્સ કેમિકલ કંપનીમાં પોલ કે. સ્મિથ પછી, જે હવે થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિકનો ભાગ છે, તે લોરી પ્રોટીન એસે, બ્રેડફોર્ડ પ્રોટીન એસે અથવા બાયુરેટ રીએજન્ટની જેમ દ્રાવણમાં પ્રોટીનની કુલ સાંદ્રતા (0.5 મિલીગ્રામ/એમએલથી 1.5 મિલીગ્રામ/એમએલ) નક્કી કરવા માટે બાયોકેમિકલ એસે છે. પ્રોટીનની કુલ સાંદ્રતા પ્રોટીનની સાંદ્રતાના પ્રમાણમાં નમૂનાના દ્રાવણના લીલાથી જાંબલી રંગના પરિવર્તન દ્વારા પ્રદર્શિત થાય છે, જેને પછી કલરમેટ્રિક તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને માપી શકાય છે. બીસીએ પરીક્ષણને 1989માં પિયર્સ કેમિકલ કંપની દ્વારા પેટન્ટ કરવામાં આવ્યું હતું અને પેટન્ટની મુદત 2006માં સમાપ્ત થઈ ગઈ હતી. એક સ્ટોક BCA દ્રાવણમાં pH 11.25 સાથે અત્યંત આલ્કલાઇન દ્રાવણમાં નીચેના ઘટકો હોય છેઃ બાયસિન્કોનિનિક એસિડ, સોડિયમ કાર્બોનેટ, સોડિયમ બાયકાર્બોનેટ, સોડિયમ ટાર્ટ્રેટ અને કોપર (II) સલ્ફેટ પેન્ટાહાઇડ્રેટ. બી. સી. એ. પરીક્ષણ મુખ્યત્વે બે પ્રતિક્રિયાઓ પર આધારિત છે. પ્રથમ, પ્રોટીનમાં પેપ્ટાઇડ બંધ તાંબાના (II) સલ્ફેટમાંથી Cu2 + આયનોને ઘટાડીને Cu1 + (તાપમાન આધારિત પ્રતિક્રિયા) કરે છે. ક્યુ2 + નું ઘટેલું પ્રમાણ દ્રાવણમાં હાજર પ્રોટીનની માત્રાના પ્રમાણમાં હોય છે. આગળ, દરેક ક્યુ1 + આયન સાથે બાયસિન્કોનિક એસિડના બે અણુઓ ચીલેટ થાય છે, જે જાંબલી રંગનું સંકુલ બનાવે છે જે 562 એનએમની તરંગલંબાઇ પર પ્રકાશને મજબૂત રીતે શોષી લે છે. બાયસિન્કોનિનિક એસિડ ક્યુ1 + સંકુલ પ્રોટીનના નમૂનાઓમાં સિસ્ટીન/સિસ્ટીન, ટાયરોસિન અને ટ્રિપ્ટોફન બાજુની સાંકળોની હાજરી દ્વારા પ્રભાવિત થાય છે. ઊંચા તાપમાને (37 થી 60 ડિગ્રી સેલ્સિયસ), પેપ્ટાઇડ બંધ પ્રતિક્રિયા સંકુલની રચનામાં મદદ કરે છે. અસમાન એમિનો એસિડ રચનાને કારણે થતા તફાવતોને ઘટાડતી વખતે ઉચ્ચ તાપમાને બી. સી. એ. પરીક્ષણની ભલામણ પરીક્ષણની સંવેદનશીલતા વધારવાના માર્ગ તરીકે કરવામાં આવે છે. દ્રાવણમાં હાજર પ્રોટીનની માત્રાને શોષણ વર્ણપટને માપીને અને જાણીતા સાંદ્રતાના પ્રોટીન દ્રાવણ સાથે સરખામણી કરીને માપી શકાય છે. મર્યાદાઓ બી. સી. એ. પરીક્ષણ મોટા ભાગે રિડ્યુસિંગ એજન્ટ્સ અને મેટલ ચેલેટર્સ સાથે અસંગત છે, જો કે ટ્રેસ જથ્થાને સહન કરી શકાય છે. બી. સી. એ. પરીક્ષણ સામાન્ય પટલ લિપિડ્સ અને ફોસ્ફોલિપિડ્સને પણ પ્રતિસાદ આપે છે. મૂલ્યાંકનના પ્રકાર બી. સી. એ. પરીક્ષણના કેટલાક વૈકલ્પિક પ્રકારો છેઃ મૂળ બી. સી. એ. પરીક્ષણ સ્મિથ દ્વારા વર્ણવ્યા મુજબ, મૂળ બી. સી. એ. પરીક્ષણ બે-ઘટક પ્રોટોકોલ છે. બે રીએજન્ટ્સ "ઓરડાના તાપમાને અનિશ્ચિત સમય માટે સ્થિર" છે. આધુનિક (સંભવિત ચોક્કસ અથવા અત્યંત સમાન) ફોર્મ્યુલેશન ઓછામાં ઓછા બે વ્યાપારી વિક્રેતાઓ પાસેથી ઉપલબ્ધ છે. બી. સી. એ. વર્કિંગ સોલ્યુશન રીએજન્ટ એ અને રીએજન્ટ બી ને 50:1 ગુણોત્તરમાં ભેળવીને ઉત્પન્ન થાય છે, અને તે સાપ્તાહિક (તે સાધારણ રીતે સ્થિર હોય છે) અથવા જરૂરિયાત મુજબ તૈયાર કરી શકાય છે. રીએજન્ટ એ 1 ટકા ડબલ્યુ/વી બી. સી. એ.-ના 2 (CAS: 979-88-4) 2 ટકા ડબલ્યુ/વી. Na2CO3·H2O (CAS: 5968-11-6) 0.16% ડબલ્યુ/વી. ના 2 ટાર્ટ્રેટ (CAS: 868-18-8) 4 ટકા ડબલ્યુ/વી. NaOH (CAS: 1310-73-2) 0.95% ડબલ્યુ/વી. NaHCO3 (CAS: 144-55-8) 50 ટકા NaOH અથવા ઘન NaHCO3 ઉમેરો જેથી પી. એચ. ને 11.25 માં સમાયોજિત કરી શકાય. નોંધપાત્ર રીતે, સ્મિથે ઇસાટિન અને એસિટોઇનની પિફિટ્ઝિંગર પ્રતિક્રિયા દ્વારા તેમના પોતાના બી. સી. એ. નું સંશ્લેષણ કર્યું હતું, જેમાં કે. ઓ. એચ. માટે NaOH ને બદલવામાં આવ્યું હતું, પરંતુ અન્યથા લેસીન અને હેન્ઝની કૃત્રિમ પદ્ધતિને અનુસરી હતી, કારણ કે તે સમયના વ્યાપારી વિક્રેતાઓ પાસેથી ઉપલબ્ધ બી. સી. એ. તેમના ઉપયોગ માટે ખૂબ અશુદ્ધ હતું. પરીક્ષણ માટે તેને પૂરતા પ્રમાણમાં શુદ્ધ કરવા માટે 70 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પાણીમાંથી તેમના સંશ્લેષિત બી. સી. એ. ના ઓછામાં ઓછા ત્રણ ક્રમિક પુનઃ સ્ફટિકીકરણની જરૂર હતી. રીએજન્ટ બી 4% ડબલ્યુ/વી ક્યુએસઓ 4·5એચ2ઓ માઇક્રો બીસીએ પરીક્ષણ (પાતળા ઉકેલો માટે) બીસીએ માઇક્રો બીસીએ પરીક્ષણ એ 3-ઘટક પ્રોટોકોલ છે જે બાયુરેટ પ્રતિક્રિયા, બીસીએ અને કોપર (II) રીએજન્ટ્સના કેન્દ્રિત સ્ટોકનો ઉપયોગ કરે છે. તે મૂળ બીસીએ પરીક્ષણની ~ 2-40 માઇક્રોગ્રામ/એમએલ વિરુદ્ધ 20-2000 માઇક્રોગ્રામ/એમએલની સુધારેલી સંવેદનશીલતાને મંજૂરી આપે છે. જો કે, તેમાં એક અલગ, અને સામાન્ય રીતે વધુ સંવેદનશીલ, બિન-પ્રોટીન ઘટકોની દખલગીરી હોય છે. માઇક્રો બી. સી. એ. પરીક્ષણ માટેની કિટ ઓછામાં ઓછા બે વ્યાપારી વિક્રેતાઓ પાસેથી ઉપલબ્ધ છે. નોંધપાત્ર રીતે, "માઇક્રો બી. સી. એ. રીએજન્ટ એન્ડ પ્રોટોકોલ" ની રચના અને ઉપયોગનું વર્ણન સ્મિથ દ્વારા મૂળ હસ્તપ્રતમાં કરવામાં આવ્યું હતું, અને આધુનિક કિટમાં ચોક્કસ અથવા અત્યંત સમાન રચનાનો સમાવેશ થાય છે. પ્રોટોકોલમાં માઇક્રો-રીએજન્ટ સી (એમસી) બનાવવા માટે માઇક્રો-રીએજન્ટ બી અને કોપર સોલ્યુશન 25:1 નું મિશ્રણ કરવામાં આવે છે, જે શેલ્ફ સ્થિર નથી અને તાજી તૈયાર થવી જોઈએ, અને પછી એમસી 1:1 ને માઇક્રો-રીએજન્ટ એ સાથે ભેળવીને અંતિમ (પણ અસ્થિર) પરીક્ષણ કાર્યકારી સોલ્યુશન ઉત્પન્ન કરવું જોઈએ. માઇક્રો-રીએજન્ટ એ, માઇક્રો-રીએજન્ટ બી અને કોપર સોલ્યુશન ઓરડાના તાપમાને અનિશ્ચિત સમય માટે સ્થિર રહે છે. માઇક્રો-રીએજન્ટ એ (એમએ) 8 ટકા ડબલ્યુ/વી ના2સીઓ3·એચ2ઓ (સીએએસઃ 5968-11-6) 1.6 ટકા ડબલ્યુ/વી ના2ઓએચ (સીએએસઃ 1310-73-2) 1.6 ટકા ડબલ્યુ/વી ના2 ટાર્ટ્રેટ (સીએએસઃ 868-18-8) (ઉપરના મૂળ બીસીએ પરીક્ષણમાં રીએજન્ટ એ તરીકે 10x સાંદ્રતા) પીએચને 11.25 માઇક્રો-રીએજન્ટ બી (એમબી) 4 ટકા ડબલ્યુ/વી બીસીએ-ના2 (સીએએસઃ 979-88-4) (ઉપરના મૂળ બીસીએ પરીક્ષણમાં રીએજન્ટ એ તરીકે 4x સાંદ્રતા) કોપર એસ જો કે આ ઘટાડતા એજન્ટો સાથે વધુ સુસંગતતાને મંજૂરી આપે છે, પરીક્ષણમાં અન્ય બિન-પ્રોટીન ઘટકોથી અલગ હસ્તક્ષેપ રૂપરેખા છે. રેપિડ ગોલ્ડ બી. સી. એ. આ પ્રકારનું બી. સી. એ. પરીક્ષણ માત્ર થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિકમાંથી જ ઉપલબ્ધ હોવાનું જણાય છે. અહેવાલ મુજબ તે "એક અનન્ય [માલિકીનું] કોપર ચેલેટર સાથે પરંપરાગત બી. સી. એ. પ્રોટીન એસે જેવી જ કોપર રિડક્શન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરે છે. ", જે 562 એનએમને બદલે 480 એનએમ પર શોષી લે છે. આ પ્રોપરાઇટર ચેલેટર અને અનુમાનિત ઓપ્ટિમાઇઝ્ડ બાયુરેટ રિએક્શન ફોર્મ્યુલેશન મૂળ બીસીએ એસેના 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ + ઇન્ક્યુબેશન વિના એસેને ઝડપી (<5 મિનિટ) પરિણામો પ્રદાન કરવાની મંજૂરી આપે છે. જો કે પરીક્ષણમાં અન્ય બિન-પ્રોટીન ઘટકોથી અલગ હસ્તક્ષેપ રૂપરેખા છે. પિયર્સ ક્વોન્ટિટેટિવ કલરિમેટ્રિક પેપ્ટાઇડ એસે (જે હવે થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિકની માલિકીની છે અને ઉપલબ્ધ છે) સમાન અથવા સમાન 480 એનએમ શોષી લેનાર માલિકીના કોપર ચેલેટર્સનો ઉપયોગ કરે છે. આ પણ જુઓ બાયુરેટ ટેસ્ટ બ્રેડફોર્ડ એસે કોલોઇડલ ગોલ્ડ પ્રોટીન એસે સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ ઓપનવેટવેર બીસીએ એસે રસાયણશાસ્ત્ર બાયોકેમિસ્ટ્રી પદ્ધતિઓ રાસાયણિક પરીક્ષણો ડીઃ બિસિનકોનિન્સૌર