Fiber photometry
ફાઇબર ફોટોમેટ્રી એ કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ તકનીક છે જે ન્યુરલ સર્કિટ્સનો અભ્યાસ કરવા માટે મગજના પ્રદેશ અથવા કાર્યાત્મક નેટવર્કની અંદર ચોક્કસ કોષ-પ્રકારોમાંથી 'બલ્ક' અથવા વસ્તી-સ્તરની કેલ્શિયમ (Ca2 +) પ્રવૃત્તિને મેળવે છે. વસ્તી-સ્તરની કેલ્શિયમ પ્રવૃત્તિને વર્તણૂકીય કાર્યો સાથે સહસંબંધિત કરી શકાય છે, જેમ કે અવકાશી શિક્ષણ, યાદશક્તિ અને લક્ષ્ય-નિર્દેશિત વર્તણૂકો. આ તકનીકમાં જીવંત પ્રાણીઓના મગજમાં ફાઈબર ઓપ્ટિક્સનું સર્જિકલ પ્રત્યારોપણ સામેલ છે. સંશોધકોને લાભ એ છે કે ઓપ્ટિકલ ફાઈબર ઇમ્પ્લાન્ટ કરવા માટે સરળ, ઓછી આક્રમક અને અન્ય કેલ્શિયમ પદ્ધતિઓ કરતાં ઓછી ખર્ચાળ છે, અને મિનિસ્કોપની તુલનામાં પ્રાણી પર ઓછું વજન અને તણાવ છે. તે બહુવિધ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા મગજના પ્રદેશોના ઇમેજિંગ અને અન્ય ન્યુરોસાયન્સ તકનીકો સાથે એકીકરણ માટે પણ પરવાનગી આપે છે. ફાઇબર ફોટોમેટ્રીની મર્યાદાઓ ઓછી સેલ્યુલર અને અવકાશી રીઝોલ્યુશન છે, અને હકીકત એ છે કે પ્રાણીઓને સુરક્ષિત રીતે સખત ફાઇબર બંડલ સાથે જોડવા જોઈએ, જે ઉંદર જેવા નાના સસ્તન પ્રાણીઓના કુદરતી વર્તનને અસર કરી શકે છે. તકનીકી વર્ણન ફાઇબર ફોટોમેટ્રી આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ કેલ્શિયમ સૂચકાંકો (GECI) ની અભિવ્યક્તિ પર આધાર રાખે છે, જેમ કે GCaMP અથવા RCaMP, જે અનુક્રમે ઉત્તેજક ચેતાકોષીય અને સંપૂર્ણ ચેતાકોષીય અભિવ્યક્તિ પ્રદાન કરતા Ca2 +/કેલ્મોડ્યુલિન-આધારિત પ્રોટીન કિનેઝ II (CaMCII) અને માનવ સિનેપ્સિન (hSyn) જેવા કોષ-વિશિષ્ટ પ્રવર્તકોનો ઉપયોગ કરીને ચોક્કસ કોષોને લક્ષિત કરી શકાય છે. આ પ્રવર્તકોનો ઉપયોગ ગ્લિયલ ફાઇબ્રિલરી એસિડિક પ્રોટીન (જી. એફ. એ. પી.) પ્રવર્તકનો ઉપયોગ કરીને વિવિધ ચેતાકોષીય પેટા પ્રકારો તેમજ બિન-ચેતાકોષીય કોષોને લક્ષ્ય બનાવવા માટે થઈ શકે છે, જે કેલ્શિયમની ગતિશીલતા દર્શાવે છે, જેમ કે એસ્ટ્રોસાઇટ્સ. ચેતાકોષો અને એસ્ટ્રોસાઇટ્સ બંનેમાં, ક્રિયા ક્ષમતાના સ્વરૂપમાં સેલ્યુલર પ્રવૃત્તિ, ચેતાપ્રેષકોના એક્સોસાયટોસિસ, સિનેપ્ટિક પ્લાસ્ટિસિટીમાં ફેરફારો અને જનીન ટ્રાન્સક્રિપ્શનને Ca2 + આયનોના પ્રવાહ સાથે જોડવામાં આવે છે. અંતઃકોશિક કેલ્શિયમના સ્તરોમાં આ પ્રવૃત્તિ-આધારિત ફેરફારોને કોષમાં GECI દાખલ કરીને મોનિટર કરી શકાય છે. આયનોના આ પ્રવાહને પગલે, GECI Ca2 + બંધન પર ફ્લોરોસન્સ કરે છે અને ફ્લોરોસન્સમાં ફેરફાર ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર કેલ્શિયમ ફેરફારોને પ્રમાણસર અનુરૂપ છે. ફાઇબર ફોટોમેટ્રી (અને અન્ય વિવો ઇમેજિંગ પદ્ધતિમાં) માટે સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા કેલ્શિયમ સૂચક GCaMP6 છે, જો કે વધારાના GECI અનન્ય ફ્લોરોસન્સ સ્પેક્ટ્રા, કાઇનેટિક્સ, સિગ્નલ-ટુ-ઘોંઘાટ ગુણોત્તર અને કેલ્શિયમ-સંવેદનશીલતા સાથે વિકસાવવામાં આવે છે. આ સંકેતો મગજમાં બે મુખ્ય રીતે વ્યક્ત કરી શકાય છેઃ વાયરલ અભિવ્યક્તિ અને ટ્રાન્સજેનિક માઉસ રેખાઓ. તાજેતરમાં, વિવિધ રાસાયણિક સંકેતોને માપવા માટે ઉપલબ્ધ સૂચકાંકોની સૂચિ વધી રહી છે, જેમ કે ડોપામાઇન સિગ્નલિંગ રેકોર્ડ કરવા માટે ડી. લાઇટ, અથવા ઉદાહરણ તરીકે, ઓરેક્સિન રેકોર્ડ કરવા માટે ઓક્સલાઇટ. જીસીએએમપી, આરસીએએમપી, ડીલાઈટ અને અન્ય સૂચકાંકો પ્રકાશ સ્રોત દ્વારા શ્રેષ્ઠ તરંગલંબાઇ પર ઉત્તેજિત થાય છે અને બદલામાં તેમનો પોતાનો પ્રકાશ બહાર કાઢે છે, જે સમયાંતરે કેલ્શિયમ અથવા ન્યુરોટ્રાન્સમીટર ગતિશીલતાને રેકોર્ડ કરવા માટે પરવાનગી આપે છે. ફાઇબર ફોટોમેટ્રી પ્રણાલીઓ પ્રકાશની ચોક્કસ ઉત્તેજના તરંગલંબાઇ પહોંચાડવા માટે રચાયેલ છે જે કેલ્શિયમ માટે વિશિષ્ટ છે (દા. ત. જીસીએએમપી) અથવા ન્યુરોટ્રાન્સમીટર સૂચક (દા. ત. ડી. લાઇટ). આ પ્રકાશ ઓપ્ટિકલ ફાઇબરથી ફાઇબર ઓપ્ટિક સુધી જાય છે જે મગજના પ્રદેશ અથવા રસના પ્રદેશોમાં રોપવામાં આવે છે. કેલ્શિયમ સૂચક એ છે કે જે કોષ-પ્રકારની ચોક્કસ રીતે વ્યક્ત થાય છે તે આ પ્રકાશ દ્વારા ઉત્તેજિત થાય છે અને બદલામાં, તેના પોતાના સંકેતને બહાર કાઢે છે જે તે જ ફાઇબરમાંથી પાછા પ્રવાસ કરે છે. આ એકત્રિત ઉત્સર્જન સંકેતો ડાયક્રોઇક મિરર દ્વારા સ્પેક્ટ્રલી-અલગ કરવામાં આવે છે, ફિલ્ટરમાંથી પસાર થાય છે અને ફોટોડિટેક્ટર, વૈજ્ઞાનિક કેમેરા અથવા પીએમટી પર કેન્દ્રિત થાય છે. એકત્રિત સંકેત પ્રારંભિક આધારરેખા (F) ની સરખામણીમાં પ્રતિદીપ્તિ (ΔF) માં ફેરફારને રજૂ કરે છે. બદલામાં, સંશોધકો કેલ્શિયમ ટ્રાન્ઝિઅન્ટ્સ (δF/F) ને અનુરૂપ સંકેતનું નિરીક્ષણ કરી શકે છે. આ સમય શ્રેણીની માહિતીનું વિશ્લેષણ પી. એમ. એ. ટી., પાયફોટોમેટ્રી અને જી. પી. પી. વાય. જેવી વિવિધ ઓપન-સોર્સ પાઈપલાઈનનો ઉપયોગ કરીને કરી શકાય છે. મહત્ત્વની વાત એ છે કે, સમસ્થાનિક સંકેતો કેલ્શિયમ-સ્વતંત્ર સંકેતો છે (એટલે કે. આશરે 405-415 nm) કે જે કેલ્શિયમ આધારિત તરંગલંબાઇ (એટલે કે. GCaMP માટે 470 nm). કારણ કે જીસીએએમપીમાં બે અવસ્થાઓ હોય છે, Ca2 + બાઉન્ડ અને અન-બાઉન્ડ, બે પ્રોટીન રચનાઓમાં અનન્ય ઉત્તેજના અને ઉત્સર્જન સ્પેક્ટ્રા હોય છે. ઉત્તેજનાની તરંગલંબાઇ કે જેના પર GCaMP એ Ca2 + સાથે અને વગર સમાન શોષણ ધરાવે છે તે આઇસોસ્બેસ્ટિક છે અને કેલ્શિયમ-સ્વતંત્ર ફ્લોરોસન્સ બેઝલાઇન નક્કી કરે છે. આ કેલ્શિયમ-સ્વતંત્ર સંકેતમાં પ્રાણીઓની ગતિ અને પેશીઓની ઓટોફ્લોરોસેન્સ પ્રતિબિંબિત થાય છે અને ફ્લોરોસન્સમાં સાચા ફેરફારને જાહેર કરવા માટે તેને બાદ કરી શકાય છે અથવા પાછો ખેંચી શકાય છે. આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ કેલ્શિયમ સૂચકાંકો (GECI) આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ કેલ્શિયમ સૂચકાંકો શું છે? આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ કેલ્શિયમ સૂચકાંકો (GECI) ની શ્રેષ્ઠ અભિવ્યક્તિ બે રીતે કરી શકાય છેઃ એડેનો-સંકળાયેલ વાયરલ વેક્ટર અને ટ્રાન્સજેનિક ઉંદર રેખાઓ. વાયરલ ઈન્જેક્શન માટે મગજના રસના વિસ્તારમાં GECI પ્રેરણા જરૂરી છે. આ વાયરસને અનુક્રમે ઉત્તેજક ચેતાકોષો અને એસ્ટ્રોસાઇટ્સને લક્ષ્ય બનાવવા માટે સી. એ. એમ. કે. આઈ. આઈ. અને જી. એફ. એ. પી. જેવા કોષ-વિશિષ્ટ પ્રવર્તકોના ઉપયોગ દ્વારા અનન્ય કોષ-પ્રકારોને સંક્રમિત કરવા માટે લક્ષિત કરી શકાય છે. આ ન્યુરલ પ્રવૃત્તિને ન્યુરોન્સ અથવા ગ્લિયલ કોશિકાઓની આનુવંશિક રીતે વ્યાખ્યાયિત પેટા વસ્તીમાંથી રોપાયેલા ઓપ્ટિકલ ફાઇબર દ્વારા રેકોર્ડ કરવાની મંજૂરી આપે છે. વાયરલ અભિવ્યક્તિને મગજમાં શ્રેષ્ઠ અભિવ્યક્તિ મેળવવા માટે મંદનની ટાઇટ્રેશનની જરૂર પડે છે, જે ચોક્કસ પ્રયોગો માટે ટ્રાન્સજેનિક ઉંદર રેખાઓનો ઉપયોગ કરવાને બદલે જરૂરી હોઈ શકે છે. જીઇસીઆઈની અભિવ્યક્તિ ટ્રાન્સજેનિક રેખાઓના ઉપયોગ દ્વારા પણ પૂર્ણ કરી શકાય છે જે સમગ્ર મગજમાં સર્વવ્યાપક અભિવ્યક્તિ માટે પરવાનગી આપે છે. ઉંદર અથવા ઉંદરના તાણના આધારે, અભિવ્યક્તિ મગજના પ્રદેશોમાં બદલાઈ શકે છે, જે રેકોર્ડિંગ દરમિયાન સંભવિત પડકારો ઉભા કરે છે. જીસીએએમપી શું છે? જીસીએએમપી એ આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ કેલ્શિયમ સૂચક (જીઈસીઆઈ) છે જેનો ઉપયોગ સામાન્ય રીતે બહુવિધ ઇમેજિંગ પદ્ધતિઓમાં થાય છે. જ્યારે સૂચક કેલ્શિયમ આયન (Ca2 +) સાથે બંધાયેલ હોય ત્યારે GCaMP ફ્લોરોસન્સ બહાર કાઢે છે. આ કેલ્શિયમ સંકેત ન્યુરલ રિસ્પોન્સ પેટર્ન, ન્યુરોટ્રાન્સમીટર રિલીઝ અને પટલની ઉત્તેજના સાથે સીધો જોડાયેલો છે. જીસીએએમપી અને તેના સમસ્થાનિક સંકેત માટે ઉત્તેજના તરંગલંબાઇ અનુક્રમે આશરે 470 એનએમ અને 415 એનએમ (વાદળી) છે. ધ્યેય સૂચકના મહત્તમ શોષણ અને સમસ્થાનિક બિંદુઓને ફોટો-ઉત્તેજિત કરવાનો છે. જીસીએએમપીનું સમસ્થાનિક બિંદુ કેલ્શિયમ-સ્વતંત્ર સંકેત છે, જે લગભગ 405-415 nm છે. આ કેલ્શિયમ આયનો સાથે બંધાયેલ અને બંધાયેલ ન હોય તેવી બે કાર્યાત્મક સ્થિતિઓ ધરાવતા જીસીએએમપીના આધારે નક્કી કરવામાં આવે છે. આ બંને રાજ્યોમાં અનન્ય પ્રોટીન ઉત્તેજના અને ઉત્સર્જન સ્પેક્ટ્રા છે. ઉત્તેજનાની તરંગલંબાઇ જ્યાં આ બે પ્રોટીન અવસ્થાઓ સમાન શોષણ ધરાવે છે તે આઇસોસ્બેસ્ટિક બિંદુ છે અને બેઝલાઇન ફ્લોરોસન્સ નક્કી કરે છે. આ કેલ્શિયમ-સ્વતંત્ર સંકેતમાં ગતિ અને ઓટોફ્લોરોસેન્સ પ્રતિબિંબિત થાય છે અને વર્તણૂકીય કાર્ય અથવા પ્રાયોગિક હેરફેર દરમિયાન સેલ્યુલર ફ્લોરોસન્સમાં સાચા ફેરફારને જાહેર કરવા માટે તેને બાદ કરી શકાય છે અથવા પાછો ખેંચી શકાય છે. જીસીએએમપીની ઉત્સર્જન તરંગલંબાઇ આશરે 525 એનએમ (લીલી) છે, જેનું વિશ્લેષણ કરી શકાય છે અને વર્તણૂકીય કાર્યો દરમિયાન સમયાંતરે સહસંબંધિત કરી શકાય છે. બહુવિધ-રંગીન ફાઇબર ફોટોમેટ્રી બહુવિધ કોષ પ્રકારોમાં એક સાથે કેલ્શિયમ ગતિશીલતાનું નિરીક્ષણ કરવા માટે, સંશોધકોએ એક જ મગજના પ્રદેશમાં બે અથવા વધુ GECI ને જોડ્યા છે. ઉદાહરણ તરીકે, એક સંશોધન જૂથે લીલા અને લાલ જીઇસીઆઇ, જીસીએએમપી6એફ અને જેઆરજીઇસીઓ1એમાંથી ફ્લોરોસન્સ નોંધ્યું હતું, જે મુક્ત રીતે વર્તતા ઉંદરમાં સ્ટ્રેટલ ડાયરેક્ટ-એન્ડ ઇનડાયરેક્ટ-પાથવે સ્પાઈની પ્રોજેક્શન ચેતાકોષોમાં અલગ રીતે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા હતા. અગાઉના અભ્યાસમાં બતાવ્યા પ્રમાણે, એક જ મગજના પ્રદેશમાં બહુવિધ GECI ની અભિવ્યક્તિ માત્ર ચેતાકોષોના બે સમૂહમાં જ કરી શકાતી નથી. બલ્ક કેલ્શિયમની આ એક સાથે રેકોર્ડિંગ બહુવિધ કોષ પ્રકારો સાથે પણ કરી શકાય છે, જેમ કે ચેતાકોષો અને એસ્ટ્રોસાઇટ્સ. આ કોષ પ્રકારો જી. એફ. એ. પી. અને એચ. સિન જેવા અનન્ય પ્રવર્તકોને વ્યક્ત કરે છે, અને જી. ઈ. સી. આઈ. ને ખાસ કરીને આ રીતે લક્ષિત કરી શકાય છે. અન્ય એક સંશોધન જૂથે એસ્ટ્રોસાઇટ-અને ચેતાકોષ-વિશિષ્ટ પ્રવર્તકોનો ઉપયોગ કરીને સફળ દ્વિ-રંગીન ફાઇબર ફોટોમેટ્રીનું પ્રદર્શન કર્યું હતું જ્યારે ઉંદર મુક્તપણે કાર્યકારી મેમરી કાર્ય (ટી-મેઝ) કરે છે. ઉપકરણો ફાઇબર ફોટોમેટ્રીનો ધ્યેય મગજના રસના પ્રદેશમાં કોષોની ચોક્કસ વસ્તીમાંથી જથ્થાબંધ કેલ્શિયમ સંકેતને ચોક્કસપણે પહોંચાડવાનો, બહાર કાઢવાનો અને રેકોર્ડ કરવાનો છે. સિગ્નલ સુધી પહોંચવા માટે, જીઇસીઆઈ અભિવ્યક્તિના સ્થળે ઓપ્ટિકલ કેનુલા/ફાઇબરને શસ્ત્રક્રિયા દ્વારા રોપવું આવશ્યક છે. આ ઓપ્ટિકલ ફાઇબર માત્ર વસ્તી-સ્તરના કેલ્શિયમ સંકેતને એકત્રિત કરી શકે છે, વ્યક્તિગત કોષ પ્રવૃત્તિને નહીં. વધુમાં, ઓપ્ટિકલ ફાઇબર ઊંડા અને છીછરા બંને મગજની રચનાઓમાંથી રેકોર્ડિંગને મંજૂરી આપે છે, અને GRIN લેન્સ અથવા કોર્ટિકલ વિંડોઝથી વિપરીત પેશીઓને નુકસાન ઘટાડે છે. જીસીએએમપી અનુક્રમે આશરે 470 એનએમ અને 530 એનએમ પર ચોક્કસ ઉત્તેજના અને ઉત્સર્જન સ્પેક્ટ્રા ધરાવે છે. જીઇસીઆઈને ઉત્તેજિત કરવા માટે જરૂરી ઓછી ઓપ્ટિકલ પાવરને કારણે એલઇડી પ્રકાશ સ્રોતો સૌથી વધુ પસંદ કરવામાં આવે છે. મગજથી ઇમેજિંગ ઉપકરણ સુધી દ્વિદિશામાં ઉત્તેજના અને ઉત્સર્જન સંકેતોના યોગ્ય પ્રસારણનું સંકલન દ્વિધ્રુવી અરીસાઓ અને ઉત્તેજના/ઉત્સર્જન ગાળકો દ્વારા કરવામાં આવે છે. ઇમેજિંગ ઉપકરણોના ત્રણ અલગ-અલગ પ્રકારો છેઃ ફોટોડિટેક્ટર્સ, ફોટોમલ્ટીપ્લાયર ટ્યુબ્સ (પીએમટી) અને સાયન્ટિફિક કેમેરા. એક જ મગજના પ્રદેશમાંથી સંકેત એકત્રિત કરતી વખતે, તેમના ઝડપી સંપાદન અને નીચા સંકેત-થી-અવાજ ગુણોત્તર (એસ. એન. આર.) ને કારણે ફોટોડિટેક્ટર અથવા પી. એમ. ટી. નો ઉપયોગ કરવો સામાન્ય છે. વૈકલ્પિક રીતે, મગજના બહુવિધ પ્રદેશોમાંથી એકત્રિત કરતી વખતે, વૈજ્ઞાનિક કેમેરા અથવા બહુવિધ ફોટોડિટેક્ટર્સ અથવા પીએમટીનો ઉપયોગ કરવો આવશ્યક છે. એકંદરે, આ સિસ્ટમ ઓપ્ટિકલ કેન્યુલા, પ્રકાશ સ્રોત અને ઇમેજિંગ ઉપકરણ વચ્ચે જોડાણ માટે પરવાનગી આપે છે. જીઇસીઆઇને ચોક્કસ પ્રકાશ વિતરણ ઓપ્ટિકલ કેનુલા/ફાઇબર દ્વારા સક્ષમ કરવામાં આવે છે અને રેકોર્ડિંગ દરમિયાન ઇમેજિંગ ઉપકરણ દ્વારા ઉત્સર્જન સંકેત એકત્રિત કરવામાં આવે છે. વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ ફાઇબર ફોટોમેટ્રી પ્રણાલીઓના કેટલાક ઉદાહરણોમાં ન્યુરોફોટોમેટ્રિક્સ, ઇન્સ્કોપિક્સ અને માઇટેક્સબાયો સામેલ છે. ફાયદા અને મર્યાદાઓ તમામ વૈજ્ઞાનિક પદ્ધતિઓમાં વિચારણાઓ હોય છે જેને ઉપયોગ કરતા પહેલા ધ્યાનમાં લેવી આવશ્યક છે. કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ માટે અન્ય તકનીકો કરતાં ફાઇબર ફોટોમેટ્રીના ઘણા ફાયદા છે, પરંતુ તે મર્યાદાઓ સાથે આવે છે. લાભો પ્રયોગશાળાઓમાં એવા વ્યક્તિઓ માટે કે જેઓ તેમના પ્રયોગોમાં કેલ્શિયમ ઇમેજિંગને એકીકૃત કરવા માંગે છે પરંતુ હજુ સુધી આવું કરવા માટે નાણાકીય અથવા તકનીકી સંજોગો ન પણ હોય, ફાઇબર ફોટોમેટ્રી એ પ્રવેશનો ઓછો અવરોધ છે. ઓપ્ટિકલ રેસા રોપવા માટે સરળ હોય છે, ઓછા આક્રમક હોય છે અને એક અથવા બે ફોટોન ઇમેજિંગ જેવી અન્ય કેલ્શિયમ પદ્ધતિઓ કરતાં વધુ સસ્તી હોય છે. તે સમાંતર વર્તણૂકીય દાખલાઓ માટે સારું છે કારણ કે મિનિસ્કોપની તુલનામાં પ્રાણી પર ઓછું વજન અને તણાવ હોય છે. તે પ્રાણીની ગતિશીલતાને અન્ય પદ્ધતિઓ કરતાં નોંધપાત્ર રીતે ઓછી મર્યાદિત કરે છે, જે મોટા ઉંદરના નમૂનાઓમાં વધુ મુક્તપણે ચાલતા, કુદરતી વર્તણૂકોને મંજૂરી આપે છે. તે એક બહુમુખી તકનીક છે, જે બહુવિધ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા મગજના પ્રદેશોના ઇમેજિંગ અને ઓપ્ટોજેનેટિક્સ, ઇલેક્ટ્રોફિઝિયોલોજી અને વધુ સિસ્ટમ-સ્તરની ન્યુરોસાયન્સ તકનીકો સાથે એકીકરણ માટે પરવાનગી આપે છે. તાજેતરમાં, આ તકનીકને ન્યુરોટ્રાન્સમીટર પ્રવૃત્તિ અથવા પીએચ ફેરફારો માટે અન્ય ફ્લોરોસન્ટ સૂચકાંકો સાથે જોડી શકાય છે. મર્યાદાઓ પ્રયોગોનું આયોજન કરતી વખતે ફાઇબર ફોટોમેટ્રીની મુખ્ય મર્યાદાને ધ્યાનમાં લેવી મહત્વપૂર્ણ છેઃ નીચા સેલ્યુલર અને અવકાશી રીઝોલ્યુશન. ઓપ્ટિકલ રિઝોલ્યુશનનો આ અભાવ દૃશ્ય ક્ષેત્રની અંદર પ્રવૃત્તિના એકત્રીકરણના સંગ્રહને આભારી હોઈ શકે છે, જે ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલમાં માત્ર 'જથ્થાબંધ' ફેરફારોને મંજૂરી આપે છે. જો કે ઓપ્ટિકલ કેન્યુલાનું કદ અન્ય કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ પદ્ધતિઓમાં ઉપયોગમાં લેવાતી તકનીક કરતાં ઘણું નાનું હોય છે, જેમ કે એક અને બે-ફોટોન માઇક્રોસ્કોપી, પ્રાણીઓને સુરક્ષિત રીતે સખત ફાઇબર બંડલ સાથે જોડવા જોઈએ. આ કુદરતી વર્તણૂક અને ઉંદર જેવા નાના સસ્તન પ્રાણીઓની વર્તણૂકને મર્યાદિત કરી શકે છે. અન્ય પદ્ધતિઓ સાથે સંકલન ઓપ્ટોજેનેટિક્સ અને DREADD ફાઇબર ફોટોમેટ્રીને ન્યુરલ પ્રવૃત્તિ અને વર્તન વચ્ચે કારણભૂત કડી દોરવા માટે સેલ્યુલર હેરફેર સાથે સંકલિત કરી શકાય છે. મગજમાં નિર્ધારિત કોષ પ્રકારો અને અંદાજોનું લક્ષિત મોડ્યુલેશન ઓપ્ટોજેનેટિક્સ અથવા ડિઝાઇનર રિસેપ્ટર્સ એક્સક્લુસિવલી એક્ટિવેટેડ બાય ડિઝાઇનર ડ્રગ્સ (DREADDs) નો ઉપયોગ કરીને પૂર્ણ કરી શકાય છે. આ પદ્ધતિ અન્ય પરિબળોની સાથે પ્રાયોગિક ડિઝાઇન માટે જરૂરી અસ્થાયી ચોકસાઈના આધારે પસંદ કરવામાં આવે છે. ઓપ્ટોજેનેટિક્સ ઉચ્ચ અસ્થાયી ચોકસાઇ સાથે ચોક્કસ કોષ-પ્રકારમાં હેરફેર કરવાની મંજૂરી આપે છે. ક્લોઝેપિન-એન-ઓક્સાઇડ (સી. એન. ઓ.) અથવા ડેસ્ક્લોરોક્લોઝેપિન (ડી. સી. ઝેડ.) જેવા લિગાન્ડના ફાર્માકોકાઇનેટિક્સને કારણે ડ્રેડ્સમાં ઘણી ઓછી અસ્થાયી ચોકસાઇ હોય છે. એ નોંધવું અગત્યનું છે કે એક સાથે ઓપ્ટિકલ રીડઆઉટ અને ઓપ્ટોજેનેટિક હેરફેર ઘણા સંભવિત મુદ્દાઓ સાથે આવે છે જેની નીચે ચર્ચા કરવામાં આવી છે. વિવો ઇલેક્ટ્રોફિઝિયોલોજીમાં વધુમાં, ફાઇબર ફોટોમેટ્રીને એક જ પ્રાણીની અંદર વિવો ઇલેક્ટ્રોફિઝિયોલોજી સાથે જોડી શકાય છે. જ્યારે જોડવામાં આવે છે, ત્યારે ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ રેકોર્ડિંગ અને કેલ્શિયમ ઇમેજિંગના આ સંયોજનનો ઉપયોગ મુક્ત રીતે વર્તતા પ્રાણીઓના નમૂનાઓમાં ચેતાકોષીય ક્રિયા સંભવિતતાના ઉચ્ચ અસ્થાયી ચોકસાઇ સાથે કોષ-પ્રકારની ચોક્કસ પ્રવૃત્તિને અવલોકન કરવા માટે થઈ શકે છે. સંભવિત સમસ્યાઓ અને ઉકેલો સમાન ચેતાકોષોને ઓપ્ટોજેનેટિક પ્રોબ્સ અને કેલ્શિયમ સૂચકાંકોનું વિતરણ અને અભિવ્યક્તિ સમસ્યાઓ ઉભી કરી શકે છે. કેલ્શિયમ સૂચકાંકો અને હેરફેર ચેનલોમાં ઓવરલેપિંગ ઉત્તેજના સ્પેક્ટ્રમ હોઈ શકે છે, જેમ કે જીસીએએમપી અને ચેનલહોડોપ્સિન (સીએચઆર 2), જે બંને લગભગ 470 એનએમ પર ઉત્તેજનાની ટોચની તરંગલંબાઇ ધરાવે છે. કેલ્શિયમ સૂચકની ઉત્તેજના સંભવિત રીતે ઓપ્ટોજેનેટિક પ્રકાશ-સંવેદનશીલ આયન ચેનલને સક્રિય કરી શકે છે. કેલ્શિયમ સંકેતમાં માપેલા ફેરફારને કેલ્શિયમ અથવા ઓપ્ટોજેનેટિક-પ્રેરિત સંકેતમાં વાસ્તવિક ફેરફારોને સરળતાથી આભારી ન હોઈ શકે. આ સમસ્યાના ઉકેલોમાં તમારા ઓપ્ટોજેનેટિક પ્રોબ અથવા કેલ્શિયમ સૂચક સાથે બિન-ઓવરલેપિંગ ઉત્તેજના સ્પેક્ટ્રમ ધરાવતા સૂચકાંકોના સંયોજનનો સમાવેશ થાય છે. કેલ્શિયમ સૂચકાંકો (જીસીએએમપી, આરસીએએમપી) અને ઓપ્ટોજેનેટિક પ્રોબ્સ ફોર એક્સાઇટેશન (સીએચઆર2, ક્રિમસન) અને અવરોધ (ઈએનપીએચઆર, આર્ક, જોસ) આ માટેના વિકલ્પો છે. અન્ય કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ પદ્ધતિઓ મિનિસ્કોપ અને સિંગલ-ફોટોન ઇમેજિંગ મિનિસ્કોપ હેડ-માઉન્ટેડ, લઘુચિત્ર માઇક્રોસ્કોપ છે જે મુક્તપણે વર્તતા ઉંદર અને ઉંદરોમાં ન્યુરલ પ્રવૃત્તિની મોટી વસ્તીનું ઇમેજિંગ કરવાની મંજૂરી આપે છે. આ તેમના નાના કદને કારણે શક્ય છે, કારણ કે તેઓ માઉસ અથવા ઉંદર માટે વર્તનમાં મોટા પ્રમાણમાં દખલ કર્યા વિના સરળતાથી વહન કરવા માટે પૂરતા હળવા હોય છે. સંશોધકો ઇમ્પ્લાન્ટેડ ગ્રેડિયન્ટ-રીફ્રેક્ટિવ-ઇન્ડેક્સ (જીઆરઆઈએન) લેન્સ અથવા કોર્ટિકલ વિંડોઝ સાથે મિનિસ્કોપને જોડે છે જે ઊંડા અને સુપરફિસિયલ મગજની ઇમેજિંગને સક્ષમ કરે છે. આ પદ્ધતિ એક જ પ્રાણીની અંદર સેંકડો આનુવંશિક અને અવકાશી રીતે વ્યાખ્યાયિત કોષોની પ્રવૃત્તિ પર દેખરેખ રાખવા માટે આદર્શ છે. ફાઇબર ફોટોમેટ્રીની સરખામણીમાં, મિનિસ્કોપ ઉચ્ચ સેલ્યુલર રિઝોલ્યુશન સાથે ઇમેજિંગને મંજૂરી આપે છે, જે વ્યક્તિગત ચેતાકોષો અને બિન-ન્યુરોનલ કોષોમાં કેલ્શિયમમાં ફેરફારોને શોધી કાઢે છે. વધુમાં, આ પદ્ધતિ સમય જતાં પુનરાવર્તિત ઇમેજિંગને 'તંદુરસ્ત' થી પેથોલોજીકલ સ્થિતિઓ અથવા વર્તન દરમિયાનના ફેરફારોનું વિશ્લેષણ કરવા માટે સક્ષમ બનાવે છે. જો કે, ઇમેજિંગની આ પદ્ધતિ ઓછી સંવેદનશીલતા અને ઉચ્ચ ઘોંઘાટ ધરાવે છે, જે દ્વિ-ફોટોન જેવી અન્ય બહુ-ફોટોન પદ્ધતિઓની તુલનામાં ઓછી રીઝોલ્યુશન ઇમેજિંગ ઉત્પન્ન કરે છે. આ લઘુચિત્ર સૂક્ષ્મદર્શક દૂર-લાલ-સ્થાનાંતરિત સૂચકાંકોને શોધવાની તેમની ક્ષમતામાં મર્યાદિત છે જે અહીં ઓપ્ટોજેનેટિક્સ અને કેલ્શિયમ ઇમેજિંગના સંયોજન માટે જરૂરી હશે, જેમ કે ઉપર ચર્ચા કરવામાં આવી છે. બે-ફોટોન ઇમેજિંગ બે-ફોટોન ઇમેજિંગ એ બીજી કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ પદ્ધતિ છે જે સેલ્યુલર GECI ગતિશીલતામાં વધઘટને રેકોર્ડ કરે છે. તે મગજની સપાટીની નીચે 600-700 માઇક્રોન સુધી અત્યંત પ્રકાશ-સ્કેટરિંગ મગજની પેશીઓમાં પ્રવેશવાનો માર્ગ પ્રદાન કરે છે. અન્ય તકનીકોની સરખામણીમાં, દ્વિ-ફોટોન સારી રીતે વ્યાખ્યાયિત કેન્દ્રીય સમતલની અંદર ડેંડ્રાઇટ્સ અને એક્સોનલ બુટોન જેવા ઉચ્ચ સેલ્યુલર અને ઉપ-સેલ્યુલર અવકાશી રીઝોલ્યુશન પ્રદાન કરે છે. જો કે, ઓપ્ટિકલ કેન્યુલા અથવા માઇક્રો-એન્ડોસ્કોપની સહાય વિના, આ પદ્ધતિ વધુ સુપરફિસિયલ મગજના વિસ્તારો સુધી મર્યાદિત છે. આ પ્રકારના ઇમેજિંગ માટે એ પણ જરૂરી છે કે પ્રાણીઓ હેડ-ફિક્સ્ડ રહે, કેટલાક જટિલ વર્તણૂકીય કાર્યો માટે જરૂરી કુદરતી વર્તણૂકોને મર્યાદિત કરે. સંદર્ભો વિકિપીડિયા વિદ્યાર્થી કાર્યક્રમ કેલ્શિયમ ઇમેજિંગ ન્યુરોસાયન્સ