Second-harmonic imaging microscopy
સેકન્ડ-હાર્મોનિક ઇમેજિંગ માઇક્રોસ્કોપી (SHIM) સેકન્ડ-હાર્મોનિક જનરેશન (SHG) તરીકે ઓળખાતી બિનરેખીય ઓપ્ટિકલ અસર પર આધારિત છે. કોષ અને પેશીઓની રચના અને કાર્યના વિઝ્યુલાઇઝેશન માટે SHIM ને એક વ્યવહારુ માઇક્રોસ્કોપ ઇમેજિંગ કોન્ટ્રાસ્ટ મિકેનિઝમ તરીકે સ્થાપિત કરવામાં આવ્યું છે. સેકન્ડ-હાર્મોનિક માઇક્રોસ્કોપ ઘટના પ્રકાશમાંથી સેકન્ડ-હાર્મોનિક પ્રકાશ ઉત્પન્ન કરવાની નમૂનાની ક્ષમતામાં વિવિધતાઓથી વિરોધાભાસ મેળવે છે જ્યારે પરંપરાગત ઓપ્ટિકલ માઇક્રોસ્કોપ નમૂનાની ઓપ્ટિકલ ઘનતા, પાથની લંબાઈ અથવા રીફ્રેક્ટિવ ઇન્ડેક્સમાં ભિન્નતા શોધીને તેની વિપરીતતા મેળવે છે. એસએચજીને બિનકેન્દ્રસમમિત પરમાણુ માળખા સાથેની સામગ્રીમાંથી પસાર થતા તીવ્ર લેસર પ્રકાશની જરૂર પડે છે, ક્યાં તો અંતર્ગત અથવા બાહ્ય રીતે પ્રેરિત, ઉદાહરણ તરીકે વિદ્યુત ક્ષેત્ર દ્વારા. એસએચજી સામગ્રીમાંથી નીકળતો સેકન્ડ-હાર્મોનિક પ્રકાશ એ સામગ્રીમાં પ્રવેશતા પ્રકાશની તરંગલંબાઇ (આવર્તન બમણી) નો બરાબર અડધો ભાગ છે. જ્યારે બે-ફોટોન-ઉત્તેજિત પ્રતિદીપ્તિ (ટી. પી. ઇ. એફ.) પણ બે ફોટોન પ્રક્રિયા છે, ત્યારે ટી. પી. ઇ. એફ. ઉત્તેજિત અવસ્થામાં છૂટછાટ દરમિયાન થોડી ઊર્જા ગુમાવે છે, જ્યારે એસએચજી ઊર્જા સંરક્ષણ છે. લાક્ષણિક રીતે, અકાર્બનિક સ્ફટિકનો ઉપયોગ લિથિયમ નિયોબેટ (LiNbO3), પોટેશિયમ ટાઇટેનાઇલ ફોસ્ફેટ (KTP = KTiOપીઓ4) અને લિથિયમ ટ્રાઇબોરેટ (LBO = LiB3O5) જેવા SHG પ્રકાશ ઉત્પન્ન કરવા માટે થાય છે. એસ. એચ. જી. ને ઘટના પ્રકાશની આવર્તન બમણી કરવા માટે ચોક્કસ પરમાણુ દિશા ધરાવતી સામગ્રીની જરૂર હોય છે, તેમ છતાં કેટલીક જૈવિક સામગ્રી અત્યંત ધ્રુવીકરણક્ષમ હોઈ શકે છે, અને વાજબી ક્રમમાં, મોટા બિન-કેન્દ્રસમમિત માળખામાં ભેગા થઈ શકે છે. જ્યારે કોલેજન, માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ અને સ્નાયુ માયોસિન જેવી કેટલીક જૈવિક સામગ્રીઓ એસએચજી સંકેતો ઉત્પન્ન કરી શકે છે, ત્યારે પાણી પણ ઓર્ડર થઈ શકે છે અને અમુક પરિસ્થિતિઓમાં સેકન્ડ-હાર્મોનિક સંકેત ઉત્પન્ન કરી શકે છે, જે એસએચ માઇક્રોસ્કોપીને કોઈપણ લેબલિંગ પરમાણુઓ વિના સપાટીની ક્ષમતાની છબી બનાવવાની મંજૂરી આપે છે. એસએચજી પેટર્ન મુખ્યત્વે તબક્કાની મેળ ખાતી સ્થિતિ દ્વારા નક્કી થાય છે. એસએચજી ઇમેજિંગ સિસ્ટમ માટેના સામાન્ય સેટઅપમાં ઉત્તેજના સ્રોત તરીકે ટાઇટેનિયમ નીલમ મોડ-લૉક લેસર સાથે લેસર સ્કેનિંગ માઇક્રોસ્કોપ હશે. એસએચજી સંકેત આગળની દિશામાં પ્રસારિત થાય છે. જો કે, કેટલાક પ્રયોગોએ દર્શાવ્યું છે કે SHG ઉત્પાદિત સંકેતની તરંગલંબાઇના લગભગ દસમા ક્રમની વસ્તુઓ લગભગ સમાન આગળ અને પાછળના સંકેતો ઉત્પન્ન કરશે. લાભો શીમ જીવંત કોષ અને પેશીઓના ઇમેજિંગ માટે ઘણા ફાયદા પ્રદાન કરે છે. એસ. એચ. જી. માં ફ્લોરોસન્સ માઇક્રોસ્કોપી જેવી અન્ય તકનીકોની જેમ અણુઓના ઉત્તેજનાનો સમાવેશ થતો નથી, તેથી અણુઓને ફોટોટોક્સિસિટી અથવા ફોટોબિલીચિંગની અસરો સહન કરવી જોઈએ નહીં. ઉપરાંત, ઘણા જૈવિક માળખાઓ મજબૂત એસએચજી સંકેતો ઉત્પન્ન કરે છે, તેથી બાહ્ય તપાસવાળા અણુઓનું લેબલિંગ જરૂરી નથી જે જૈવિક પ્રણાલીના કાર્યોની રીતને પણ બદલી શકે છે. ઘટના પ્રકાશ માટે નજીકના ઇન્ફ્રારેડ તરંગલંબાઇનો ઉપયોગ કરીને, SHIM જાડા પેશીઓમાં ઊંડાણમાં ઇમેજિંગ કરીને નમુનાઓની ત્રિ-પરિમાણીય છબીઓ બનાવવાની ક્ષમતા ધરાવે છે. બે-ફોટોન ફ્લોરોસન્સ (2PEF) સાથે તફાવત અને પૂરકતા બે-ફોટોન ફ્લોરોસન્સ (2PEF) એ SHG થી ખૂબ જ અલગ પ્રક્રિયા છેઃ તેમાં ઉચ્ચ ઉર્જા સ્તરો સુધી ઇલેક્ટ્રોનની ઉત્તેજના અને ફોટોન ઉત્સર્જન દ્વારા અનુગામી ડી-ઉત્તેજનાનો સમાવેશ થાય છે (SHG થી વિપરીત, જો કે તે 2-ફોટોન પ્રક્રિયા પણ છે). આમ, 2PEF એક બિન-સુસંગત પ્રક્રિયા છે, અવકાશી રીતે (ઉત્સર્જિત આઇસોટ્રોપિક રીતે) અને અસ્થાયી રીતે (વ્યાપક, નમૂના-આધારિત વર્ણપટ). તે એસએચજીથી વિપરીત ચોક્કસ માળખા માટે પણ ચોક્કસ નથી. તેથી તેને મલ્ટીફોટોન ઇમેજિંગમાં એસએચજી સાથે જોડી શકાય છે, જેથી કેટલાક અણુઓ પ્રગટ થાય છે જે ઓટોફ્લોરોસેન્સ ઉત્પન્ન કરે છે, જેમ કે પેશીઓમાં ઇલાસ્ટિન (જ્યારે એસએચજી કોલેજન અથવા માયોસિન દર્શાવે છે). એસએચજીનો ઉપયોગ ઇમેજિંગ માટે કરવામાં આવ્યો તે પહેલાનો ઇતિહાસ, એસએચજીનું પ્રથમ પ્રદર્શન 1961માં પી. એ. ફ્રેન્કેન, જી. વેઇનરીચ, સી. ડબલ્યુ. પીટર્સ અને એ. ઇ. હિલ દ્વારા મિશિગન યુનિવર્સિટી, એન આર્બર ખાતે ક્વાર્ટઝ નમૂનાનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું. 1968માં, ઇન્ટરફેસોમાંથી એસએચજીની શોધ બ્લોમબર્ગન દ્વારા કરવામાં આવી હતી અને ત્યારથી તેનો ઉપયોગ સપાટીઓની લાક્ષણિકતા અને ઇન્ટરફેસ ગતિશીલતાની તપાસ માટે એક સાધન તરીકે કરવામાં આવે છે. 1971માં, ફાઇન અને હેન્સેને જૈવિક પેશીઓના નમૂનાઓમાંથી એસએચજીના પ્રથમ નિરીક્ષણની જાણ કરી હતી. 1974માં, હેલવર્થ અને ક્રિસ્ટેનસેને સૌપ્રથમ પોલિક્રિસ્ટલાઇન ઝેડએનસીમાંથી એસએચજી સંકેતોના ઇમેજિંગ દ્વારા એસએચજી અને માઇક્રોસ્કોપીના એકીકરણની જાણ કરી હતી. 1977માં, કોલિન શેપર્ડે સ્કેનીંગ ઓપ્ટિકલ માઇક્રોસ્કોપ સાથે વિવિધ એસએચજી સ્ફટિકોની છબી બનાવી હતી. ઉંદરની પૂંછડીના કંડરામાં કોલેજન રેસાની દિશાનો અભ્યાસ કરવા માટે 1986માં ફ્રોન્ડ અને ડ્યુશ દ્વારા પ્રથમ જૈવિક ઇમેજિંગ પ્રયોગો કરવામાં આવ્યા હતા. 1993માં, લુઇસે વિદ્યુત ક્ષેત્રોમાં સ્ટાયરિલ રંગોના બીજા-હાર્મોનિક પ્રતિભાવની તપાસ કરી હતી. તેમણે જીવંત કોષોના ઇમેજિંગ પર પણ કામ દર્શાવ્યું હતું. 2006 માં, ગોરો મિઝુતાની જૂથે બિન-સ્કેનીંગ એસએચજી માઇક્રોસ્કોપ વિકસાવ્યું હતું જે મોટા નમૂનાઓના નિરીક્ષણ માટે જરૂરી સમયને નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડે છે, ભલે બે-ફોટોન વાઇડ-ફિલ્ડ માઇક્રોસ્કોપ 1996 માં પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યો હોય અને એસએચજીને શોધવા માટે તેનો ઉપયોગ કરી શકાયો હોત. નોન-સ્કેનિંગ એસએચજી માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ પ્લાન્ટ સ્ટાર્ચ, મેગામોલેક્યુલ, સ્પાઈડર સિલ્ક વગેરેના નિરીક્ષણ માટે કરવામાં આવ્યો હતો. 2010માં એસએચજીને વિવો ઇમેજિંગમાં આખા પ્રાણી સુધી વિસ્તારવામાં આવ્યું હતું. 2019 માં, એસ. એચ. જી. ની અરજીઓ વિસ્તૃત થઈ જ્યારે તેને જંતુનાશકોની અસરકારકતાનું મૂલ્યાંકન કરવાની રીત પ્રદાન કરવા માટે સીધી પાંદડાની સપાટી પર પસંદગીયુક્ત ઇમેજિંગ એગ્રોકેમિકલ્સના ઉપયોગ પર લાગુ કરવામાં આવી. માત્રાત્મક માપ ઓરિએન્ટેશનલ અનિસોટ્રોપી એસએચજી ધ્રુવીકરણ અનિસોટ્રોપીનો ઉપયોગ પેશીઓમાં પ્રોટીનની ગોઠવણીની દિશા અને ડિગ્રી નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે કારણ કે એસએચજી સંકેતોમાં સારી રીતે વ્યાખ્યાયિત ધ્રુવીકરણ હોય છે. અનિસોટ્રોપી સમીકરણનો ઉપયોગ કરીનેઃ અને સમાંતર અને લંબરૂપ દિશામાં ધ્રુવીકરણની તીવ્રતા પ્રાપ્ત કરીને. ઊંચું મૂલ્ય એનિસોટ્રોપિક અભિગમ સૂચવે છે જ્યારે નીચું મૂલ્ય આઇસોટ્રોપિક માળખું સૂચવે છે. કેમ્પેગ્નોલા અને લોઉ દ્વારા કરવામાં આવેલા કાર્યમાં, એવું જાણવા મળ્યું હતું કે કોલેજન તંતુઓ મૂલ્ય સાથે સારી રીતે સંરેખિત માળખા બનાવે છે. પછાત એસએચજી એસએચજી એક સુસંગત પ્રક્રિયા (અવકાશી અને અસ્થાયી) હોવાથી આગળ વધે છે, તે ઉત્તેજનાની દિશા પર માહિતી રાખે છે અને આઇસોટ્રોપિક રીતે ઉત્સર્જિત થતું નથી. તે મુખ્યત્વે આગળની દિશામાં (ઉત્તેજના જેવી જ) ઉત્સર્જિત થાય છે, પરંતુ તબક્કાની મેળ ખાતી સ્થિતિને આધારે પાછળની દિશામાં પણ ઉત્સર્જિત થઈ શકે છે. ખરેખર, સુસંગતતા લંબાઈ કે જેનાથી આગળ સિગ્નલનું રૂપાંતર ઘટે છે તે છેઃ આગળ માટે, પરંતુ પછાત માટે જેમ કે>>. તેથી, જાડા માળખાઓ પ્રાધાન્યમાં આગળના ભાગમાં અને પાતળા માળખાઓ પછાત ભાગમાં દેખાશેઃ કારણ કે એસએચજી રૂપાંતર બિનરેખીય પરિવર્તકોની સંખ્યાના વર્ગ પર પ્રથમ અંદાજ પર આધાર રાખે છે, જો જાડા માળખાઓ દ્વારા ઉત્સર્જિત થાય તો સંકેત વધારે હશે, આમ આગળની દિશામાં સંકેત પછાત કરતાં વધારે હશે. જો કે, પેશીઓ પેદા થયેલા પ્રકાશને વેરવિખેર કરી શકે છે, અને એસએચજીના આગળના ભાગને પાછળની દિશામાં પાછું-પ્રતિબિંબિત કરી શકાય છે. પછી, ફોરવર્ડ-ઓવર-બેકવર્ડ રેશિયો F/B ની ગણતરી કરી શકાય છે, અને તે SHG કન્વર્ટર્સ (સામાન્ય રીતે કોલેજન ફાઇબ્રિલ્સ) ના વૈશ્વિક કદ અને ગોઠવણીનું મેટ્રિક છે. તે પણ દર્શાવી શકાય છે કે સ્કેટરરનો આઉટ-ઓફ-પ્લેન ખૂણો જેટલો ઊંચો હોય છે, તેટલો તેનો એફ/બી ગુણોત્તર ઊંચો હોય છે (અંજીર જુઓ. 2. 14). ધ્રુવીકરણ-ઉકેલાયેલ એસએચજી ધ્રુવીકરણના ફાયદાઓને સ્ટોલર એટ અલ દ્વારા 2002માં એસએચજી સાથે જોડવામાં આવ્યા હતા. પોલરીમેટ્રી પરમાણુ સ્તરે દિશા અને ક્રમને માપી શકે છે, અને એસએચજી સાથે જોડાઈને તે કોલેજન જેવી ચોક્કસ રચનાઓની વિશિષ્ટતા સાથે આમ કરી શકે છેઃ ધ્રુવીકરણ-ઉકેલાયેલ એસએચજી માઇક્રોસ્કોપી (પી-એસએચજી) આમ એસએચજી માઇક્રોસ્કોપીનું વિસ્તરણ છે. પી-એસએચજી અન્ય અનિસોટ્રોપી પરિમાણને આ રીતે વ્યાખ્યાયિત કરે છેઃ જે, આરની જેમ, છબીમાં લેવાયેલી રચનાની મુખ્ય દિશા અને અવ્યવસ્થાનું માપ છે. તે ઘણીવાર લાંબા નળાકાર તંતુઓ (જેમ કે કોલેજન) માં કરવામાં આવે છે, તેથી આ અનિસોટ્રોપી ઘણીવાર સમાન હોય છે, જ્યાં બિનરેખીય સંવેદનશીલતા ટેન્સર અને X ફિલામેન્ટની દિશા (અથવા રચનાની મુખ્ય દિશા), Y થી X અને Z ઉત્તેજના પ્રકાશનો પ્રસાર છે. છબીના સમતલ XY માં તંતુઓની દિશા φ પણ FFT વિશ્લેષણ દ્વારા p-SHG માંથી કાઢી શકાય છે, અને નકશામાં મૂકી શકાય છે. ફાઇબ્રોસિસ ક્વોન્ટાઇઝેશન કોલેજન (ચોક્કસ કેસ, પરંતુ એસએચજી માઇક્રોસ્કોપીમાં વ્યાપકપણે અભ્યાસ કરાયેલ), વિવિધ સ્વરૂપોમાં અસ્તિત્વ ધરાવે છેઃ 28 વિવિધ પ્રકારો, જેમાંથી 5 ફાઇબ્રિલર છે. એક પડકાર એ છે કે પેશીઓમાં ફાઇબ્રિલર કોલેજનની માત્રા નક્કી કરવી અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવું, જેથી તેની ઉત્ક્રાંતિ અને અન્ય બિન-કોલેજન સામગ્રી સાથેના સંબંધને જોઈ શકાય. તે માટે, એસએચજી તરંગલંબાઇ પર અસ્તિત્વમાં રહેલા અવશેષ પ્રતિદીપ્તિ અથવા ઘોંઘાટની થોડી માત્રાને દૂર કરવા માટે એસએચજી માઇક્રોસ્કોપી છબીને સુધારવી પડશે. તે પછી, છબીની અંદર કોલેજનને માપવા માટે માસ્ક લાગુ કરી શકાય છે. અન્ય ક્વોન્ટાઇઝેશન તકનીકોમાં, તે ખૂબ જ જટિલ હોવા છતાં કદાચ સૌથી વધુ વિશિષ્ટતા, પ્રજનનક્ષમતા અને લાગુ પડતી હોય છે. અન્ય તેનો ઉપયોગ એ સાબિત કરવા માટે પણ કરવામાં આવ્યો છે કે બેકપ્રોપેગેટિંગ એક્શન પોટેન્શિયલ વોલ્ટેજ એટેન્યુએશન વિના ડેંડ્રાઇટિક સ્પાઇન્સ પર આક્રમણ કરે છે, જે લાંબા ગાળાના પોટેન્શિયેશન પર ભાવિ કાર્ય માટે એક મજબૂત આધાર સ્થાપિત કરે છે. અહીં તેનો ઉપયોગ એ હતો કે તે પ્રમાણભૂત બે-ફોટોન માઇક્રોસ્કોપી સાથે અપ્રાપ્ય ચોકસાઈ સાથે નાના ડેંડ્રાઇટિક સ્પાઇન્સમાં વોલ્ટેજને સચોટ રીતે માપવાનો માર્ગ પ્રદાન કરે છે. દરમિયાન, એસએચજી ઇમેજિંગ-માર્ગદર્શિત ફોટોડાયનેમિક ઉપચારને સક્ષમ કરવા માટે નજીકના ઇન્ફ્રારેડ પ્રકાશને દૃશ્યમાન પ્રકાશમાં અસરકારક રીતે રૂપાંતરિત કરી શકે છે, જે પ્રવેશની ઊંડાઈની મર્યાદાઓને પાર કરે છે. એસએચજી માઇક્રોસ્કોપી અને તેના વિસ્તરણની છબી બનાવી શકાય તેવી સામગ્રીનો ઉપયોગ વિવિધ પેશીઓનો અભ્યાસ કરવા માટે થઈ શકે છેઃ કેટલીક ઉદાહરણ છબીઓ નીચેની આકૃતિમાં નોંધવામાં આવી છેઃ બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સની અંદર કોલેજન મુખ્ય ઉપયોગ રહે છે. તે કંડરા, ચામડી, હાડકાં, કોર્નિયા, એઓર્ટા, ફેસીયા, કોમલાસ્થિ, મેનિસ્કસ, ઇન્ટરવર્ટેબ્રલ ડિસ્કમાં જોવા મળે છે. માયોસિનને હાડપિંજરના સ્નાયુ અથવા કાર્ડિયાક સ્નાયુમાં પણ જોઈ શકાય છે. ટી. એચ. જી. માઇક્રોસ્કોપી સાથે જોડાણ થર્ડ-હાર્મોનિક જનરેશન (ટી. એચ. જી.) માઇક્રોસ્કોપી એસએચજી માઇક્રોસ્કોપી માટે પૂરક હોઈ શકે છે, કારણ કે તે ત્રાંસા ઇન્ટરફેસો માટે સંવેદનશીલ છે, અને ત્રીજા ક્રમની બિનરેખીય સંવેદનશીલતા કાર્યક્રમો કેન્સરની પ્રગતિ, ગાંઠની લાક્ષણિકતા મેમોગ્રાફિક ઘનતા કોલેજન ઘનતા સાથે સંકળાયેલી છે, આમ એસએચજીનો ઉપયોગ સ્તન કેન્સરને ઓળખવા માટે થઈ શકે છે. એસ. એચ. જી. ને સામાન્ય રીતે અન્ય બિનરેખીય તકનીકો જેમ કે કોહેરન્ટ એન્ટી-સ્ટોક્સ રમન સ્કેટરિંગ અથવા ટુ-ફોટોન એક્સાઇટેશન માઇક્રોસ્કોપી સાથે જોડવામાં આવે છે, જે મલ્ટિપોટોન માઇક્રોસ્કોપી (અથવા ટોમોગ્રાફી) તરીકે ઓળખાતી નિયમિતતાના ભાગ રૂપે છે જે બિન-આક્રમક અને ઝડપી ઇન વિવો હિસ્ટોલોજી પ્રદાન કરે છે. સ્તન કેન્સર આગળ અને પાછળની એસએચજી છબીઓની સરખામણી કોલેજનની માઇક્રોસ્ટ્રક્ચર વિશે સમજ આપે છે, જે પોતે ગાંઠના ગ્રેડ અને તબક્કા સાથે સંબંધિત છે, અને સ્તનમાં તેની પ્રગતિ. એસએચજી અને 2પીઇએફની સરખામણી ગાંઠોમાં કોલેજન અભિગમમાં ફેરફાર પણ બતાવી શકે છે. જો એસએચજી માઇક્રોસ્કોપીએ સ્તન કેન્સર સંશોધનમાં ઘણું યોગદાન આપ્યું હોય, તો પણ તે હજુ સુધી હોસ્પિટલોમાં અથવા સામાન્ય રીતે આ પેથોલોજીના નિદાન માટે વિશ્વસનીય તકનીક તરીકે સ્થાપિત થઈ નથી. અંડાશયના કેન્સર સ્વસ્થ અંડાશય એસએચજીમાં એક સમાન ઉપકલા સ્તર અને તેમના સ્ટ્રોમામાં સુવ્યવસ્થિત કોલેજન હાજર હોય છે, જ્યારે અસામાન્ય અંડાશય મોટા કોષો અને બદલાયેલ કોલેજન માળખા સાથે ઉપકલા દર્શાવે છે. આર ગુણોત્તરનો ઉપયોગ એ બતાવવા માટે પણ થાય છે કે સામાન્ય પેશીઓની સરખામણીમાં કેન્સર માટે તંતુઓનું સંરેખણ થોડું વધારે છે. ત્વચા કેન્સર એસએચજી, ફરીથી, 2પીઇએફ સાથે જોડાઈને ગુણોત્તરની ગણતરી કરવા માટે વપરાય છેઃ જ્યાં એસએચજી (રેસ્પ. ટી. પી. ઇ. એફ.) એ એસએચજી (આર. એસ. પી.) માં થ્રેશોલ્ડ પિક્સેલ્સની સંખ્યા છે. 2PEF) છબી, એક ઉચ્ચ MFSI જેનો અર્થ થાય છે શુદ્ધ SHG છબી (કોઈ ફ્લોરોસન્સ વિના). સૌથી વધુ એમ. એફ. એસ. આઈ. કેન્સરગ્રસ્ત પેશીઓમાં જોવા મળે છે, જે સામાન્ય પેશીઓથી અલગ પાડવા માટે વિપરીત સ્થિતિ પ્રદાન કરે છે. એસએચજીને થર્ડ-હાર્મોનિક જનરેશન (ટીએચજી) સાથે પણ જોડવામાં આવ્યું હતું, જે દર્શાવે છે કે ગાંઠોમાં પછાત ટીએચજી વધારે છે. સ્વાદુપિંડનું કેન્સર સ્વાદુપિંડના કેન્સરમાં કોલેજન અલ્ટ્રાસ્ટ્રક્ચરમાં ફેરફારોની મલ્ટીફોટોન ફ્લોરોસન્સ અને ધ્રુવીકરણ-ઉકેલાયેલા SHIM દ્વારા તપાસ કરી શકાય છે. ફેફસાં, કોલોનિક, એસોફેજલ સ્ટ્રોમા અને સર્વાઇકલ કેન્સરના અભ્યાસ માટે અન્ય કેન્સર એસએચજી માઇક્રોસ્કોપીની જાણ કરવામાં આવી હતી. પેથોલોજી શોધ સંસ્થામાં ફેરફારો અથવા કોલેજન ફાઇબ્રિલ્સની ધ્રુવીયતા પેથોલોજીના સંકેતો હોઈ શકે છે. ખાસ કરીને, કોલેજન રેસાની અનિસોટ્રોપિક સંરેખણ ત્વચામાં પેથોલોજીકલ ડાઘથી તંદુરસ્ત ત્વચાના ભેદભાવને મંજૂરી આપે છે. ઉપરાંત, અસ્થિવા જેવા કોમલાસ્થિમાં પેથોલોજીની ધ્રુવીકરણ-ઉકેલાયેલ એસએચજી માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા તપાસ કરી શકાય છે. શીમને પાછળથી ફાઇબ્રો-કાર્ટિલેજ (મેનિસ્કસ) સુધી લંબાવવામાં આવ્યું હતું. ટીશ્યુ એન્જિનિયરિંગ એસએચજીની ચોક્કસ અણુઓની છબી લેવાની ક્ષમતા માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને ચોક્કસ પેશીની રચનાને એક સમયે એક સામગ્રી અને વિવિધ સ્કેલ પર (મેક્રોથી માઇક્રો સુધી) જાહેર કરી શકે છે. દાખલા તરીકે, કોલેજન (પ્રકાર I) ખાસ કરીને કોષોના બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સ (ઇસીએમ) માંથી લેવામાં આવે છે, અથવા જ્યારે તે પેશીઓમાં સ્કેફોલ્ડ અથવા સંયુક્ત સામગ્રી તરીકે કામ કરે છે. એસએચજી રેશમમાં ફાઇબ્રોઇન, સ્નાયુઓમાં માયોસિન અને બાયોસિન્થેટાઇઝ્ડ સેલ્યુલોઝ પણ દર્શાવે છે. આ તમામ ઇમેજિંગ ક્ષમતાનો ઉપયોગ પેશીઓના ચોક્કસ બિંદુઓને લક્ષ્ય બનાવીને કૃત્રિમ પેશીઓની રચના કરવા માટે થઈ શકે છેઃ એસએચજી ખરેખર અમુક દિશાઓ અને સામગ્રીની માત્રા અને ગોઠવણીને માત્રાત્મક રીતે માપી શકે છે. ઉપરાંત, એસએચજી અન્ય મલ્ટીફોટોન તકનીકો સાથે જોડાઈને એન્જિનિયર્ડ પેશીઓના વિકાસ પર નજર રાખી શકે છે, જ્યારે નમૂના પ્રમાણમાં પાતળા હોય છે. અલબત્ત, આખરે તેનો ઉપયોગ બનાવટી પેશીઓના ગુણવત્તા નિયંત્રણ તરીકે થઈ શકે છે. આંખની સપાટી પર આંખના કોર્નિયાની રચના, પૂરતા પ્રમાણમાં ગાઢ કોલેજનના સ્વ-સંગઠન ગુણધર્મોને કારણે, કોલેજનની પ્લાયવુડ જેવી રચનાથી બનેલી હોવાનું માનવામાં આવે છે. તેમ છતાં, લેમેલામાં કોલેજનની દિશા હજુ પણ આ પેશીઓમાં ચર્ચા હેઠળ છે. કોલેજનના આકારશાસ્ત્રીય ફેરફારોને જાહેર કરવા માટે એસએચજી દ્વારા કેરાટોકોનસ કોર્નિયાની છબી પણ લઈ શકાય છે. થર્ડ-હાર્મોનિક જનરેશન (ટીએચજી) માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કોર્નિયાની છબી બનાવવા માટે પણ થાય છે, જે એસએચજી સિગ્નલના પૂરક છે કારણ કે આ પેશીઓમાં ટીએચજી અને એસએચજી મેક્સિમા ઘણીવાર અલગ અલગ સ્થળોએ હોય છે. સેકન્ડ-હાર્મોનિક પેઢી બિનરેખીય ઓપ્ટિક્સ બે-ફોટોન ઉત્તેજના માઇક્રોસ્કોપી સ્ત્રોતો સંદર્ભો માઇક્રોસ્કોપી સેલ ઇમેજિંગ લેબોરેટરી સાધનો ઓપ્ટિકલ માઇક્રોસ્કોપી પણ જુઓ.