Tandem affinity purification
ટેન્ડમ એફિનિટી પ્યુરિફિકેશન (ટી. એ. પી.) એ પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનો અભ્યાસ કરવા માટે રોગપ્રતિકારક શક્તિ આધારિત શુદ્ધિકરણ તકનીક છે. ધ્યેય એ છે કે કોષમાંથી માત્ર રસના પ્રોટીનને બહાર કાઢવું, જે તે અન્ય કોઈપણ પ્રોટીન સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે. ટી. એ. પી. બે પ્રકારના એગરોઝ મણકાનો ઉપયોગ કરે છે જે રસના પ્રોટીન સાથે જોડાય છે અને જેને સંલગ્ન સંકુલને ખલેલ પહોંચાડ્યા વિના, વિકૃત કર્યા વિના અથવા દૂષિત કર્યા વિના, સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા સેલ લાઇસેટથી અલગ કરી શકાય છે. રસના પ્રોટીનને મણકા સાથે બાંધવા માટે, તેને ડિઝાઇન કરેલા ટુકડા, ટી. એ. પી. ટેગ સાથે ટેગ કરવામાં આવે છે. મૂળ ટી. એ. પી. પદ્ધતિમાં અભ્યાસ હેઠળના પ્રોટીનના સી-ટર્મિનસમાં ટી. એ. પી. ટેગનું મિશ્રણ સામેલ છે. ટી. એ. પી. ટેગમાં ત્રણ ઘટકોનો સમાવેશ થાય છેઃ એક કેલમોડ્યુલિન બંધનકર્તા પેપ્ટાઇડ (સી. બી. પી.), ટી. ઈ. વી. પ્રોટીઝ ક્લેવેજ સાઇટ અને બે પ્રોટીન એ ડોમેન્સ, જે આઇ. જી. જી. (ટી. એ. પી. ટેગને એક પ્રકારનો એપિટોપ ટેગ બનાવે છે) સાથે ચુસ્ત રીતે જોડાય છે. ટી. એ. પી. સિદ્ધાંત પ્રથમ વખત પ્રકાશિત થયો ત્યારથી અન્ય ઘણા ટેગ/મણકા/ઇલુઅન્ટ સંયોજનો પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવ્યા છે. વેરિઅન્ટ ટેગ આ ટેગને સી-ટર્મિનલ ટી. એ. પી. ટેગ તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે કારણ કે એન-ટર્મિનલ વર્ઝન પણ ઉપલબ્ધ છે. જો કે, વર્ણવવાની પદ્ધતિ સી-ટર્મિનલ ટેગનો ઉપયોગ ધારે છે, જો કે પદ્ધતિ પાછળનો સિદ્ધાંત હજુ પણ સમાન છે. 1990 ના દાયકાના અંતમાં યુરોપિયન મોલેક્યુલર બાયોલોજી લેબોરેટરીમાં કામ કરતી એક સંશોધન ટીમ દ્વારા ઇતિહાસ ટી. એ. પી. ટેગિંગની શોધ કરવામાં આવી હતી (રિગાઉટ એટ અલ., 1999, પુઇગ એટ અલ., 2001) અને પ્રોટીઓમ સંશોધન માટે એક નવા સાધન તરીકે પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવી હતી. તેનો ઉપયોગ ટીમ દ્વારા કેટલાક પ્રોટીન સંકુલ (રિગાઉટ એટ અલ., 1999, કેસ્પરી એટ અલ.) ની લાક્ષણિકતા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. 1999, બોવેરેટ એટ અલ., 2000, પુઇગ એટ અલ., 2001). આ તકનીકનો પ્રથમ મોટા પાયે ઉપયોગ 2002 માં થયો હતો, જેમાં સંશોધન ટીમે પ્રોટિઓમિક્સ કંપની સેલઝોમના વૈજ્ઞાનિકો સાથે મળીને યીસ્ટના કોષમાં 230 થી વધુ મલ્ટી-પ્રોટીન સંકુલની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનો દ્રશ્ય નકશો વિકસાવવા માટે કામ કર્યું હતું. છોડમાં ટી. એ. પી. ટેગ તકનીકનો ઉપયોગ કરવાનો પ્રથમ સફળ અહેવાલ 2004 માં આવ્યો હતો (રોહિલ્લા એટ અલ., 2004,) પ્રક્રિયા એવી કેટલીક પદ્ધતિઓ છે જેમાં ફ્યુઝન પ્રોટીનને યજમાન કોષોમાં દાખલ કરી શકાય છે. જો યજમાન ખમીર હોય, તો પછી એક પદ્ધતિ પ્લાઝમિડનો ઉપયોગ હોઈ શકે છે જે આખરે યજમાનની અંદર ફ્યુઝન પ્રોટીનનું ભાષાંતર કરશે. જે પણ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવી રહ્યો છે, ફ્યુઝન પ્રોટીનની અભિવ્યક્તિને તેના કુદરતી સ્તરની શક્ય તેટલી નજીક જાળવવી વધુ સારી છે. એકવાર ફ્યુઝન પ્રોટીન યજમાનની અંદર અનુવાદિત થઈ જાય, તે અન્ય પ્રોટીન સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરશે, આદર્શ રીતે ટી. એ. પી. ટેગથી અપ્રભાવિત રીતે. ત્યારબાદ, ટેગ કરેલ પ્રોટીન (તેના બંધનકર્તા ભાગીદારો સાથે) એફિનિટી પસંદગી પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરીને પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવે છે. પ્રથમ પ્રકારના મણકાને ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન જી સાથે કોટેડ કરવામાં આવે છે, જે ટી. એ. પી. ટેગના સૌથી બહારના છેડા સાથે જોડાય છે. મણકા, રસના પ્રોટીન સાથે, સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા લાઇસેટથી અલગ પડે છે. પ્રોટીન પછી એન્ઝાઇમ (ટીઇવી પ્રોટીઝ) દ્વારા મણકામાંથી મુક્ત થાય છે જે મધ્યમાં ટીઇવી ક્લેવેજ સાઇટ પર ટેગને તોડે છે. શુદ્ધિકરણના આ પ્રથમ પગલા પછી, મુક્ત થયેલા પ્રોટીનમાં બીજા પ્રકારનો મણકો (કેલ્મોડ્યુલિન સાથે કોટેડ) ઉમેરવામાં આવે છે જે પ્રોટીન પર હજુ પણ ટી. એ. પી. ટેગના બાકીના ટુકડા સાથે ઉલટાવી શકાય તેવું રીતે જોડાય છે. મણકાને ફરીથી સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અલગ કરવામાં આવે છે, જે દૂષિત પદાર્થો તેમજ ટી. ઈ. વી. પ્રોટીઝને દૂર કરે છે. છેવટે, ઇ. જી. ટી. એ. દ્વારા મણકાને છોડવામાં આવે છે, જેમાં માત્ર રસના પ્રોટીન, તેના બંધાયેલા પ્રોટીન ભાગીદારો અને ટી. એ. પી. ટેગનો બાકીનો સી. બી. પી. ભાગ હોય છે. પછી પ્રોટીનના બંધનકર્તા ભાગીદારોને ઓળખવા માટે જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરીને મૂળ ઇલ્યુએટનું વિશ્લેષણ કરી શકાય છે. ફાયદા આ પદ્ધતિનો એક ફાયદો એ છે કે જટિલ રચનાના પૂર્વ જ્ઞાન વિના વિવોમાં માત્રાત્મક રીતે પ્રોટીન ભાગીદારોનું વાસ્તવિક નિર્ધારણ થઈ શકે છે. તે અમલમાં મૂકવા માટે પણ સરળ છે અને ઘણીવાર ઉચ્ચ ઉપજ પૂરી પાડે છે. પ્રોટીન પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના અભ્યાસમાં એક અવરોધ લક્ષ્ય પ્રોટીનનું દૂષણ છે, ખાસ કરીને જ્યારે આપણને તેની કોઈ પૂર્વ જાણકારી ન હોય. ટી. એ. પી. લક્ષિત પ્રોટીનને શુદ્ધ કરવા માટે અસરકારક અને અત્યંત ચોક્કસ માધ્યમ પ્રદાન કરે છે. સતત 2 એફિનિટી શુદ્ધિકરણ પછી, ઇલ્યુએટમાં અશુદ્ધિઓને જાળવી રાખવાની તક નોંધપાત્ર રીતે ઘટી જાય છે. ગેરફાયદા જો કે, એવી શક્યતા પણ છે કે પ્રોટીનમાં ઉમેરાયેલ ટેગ તેના ક્રિયાપ્રતિક્રિયા ભાગીદારો સાથે નવા પ્રોટીનના બંધનને અસ્પષ્ટ કરી શકે છે. વધુમાં, ટેગ પ્રોટીન અભિવ્યક્તિના સ્તરને પણ અસર કરી શકે છે. બીજી બાજુ, ટેગ એફિનિટી મણકાના પૂરતા પ્રમાણમાં સંપર્કમાં ન પણ આવી શકે, તેથી પરિણામો તિરાડ પડી શકે છે. ટી. ઈ. વી. પ્રોટીઝ દ્વારા પ્રોટીનના વિભાજનની શક્યતા પણ હોઈ શકે છે, જો કે ટી. ઈ. વી. પ્રોટીઝની ઉચ્ચ વિશિષ્ટતાને ધ્યાનમાં રાખીને આ વારંવાર થવાની શક્યતા નથી. અનુકૂળતા કારણ કે આ પદ્ધતિમાં ધોવાના ઓછામાં ઓછા 2 રાઉન્ડનો સમાવેશ થાય છે, તે યીસ્ટ ટુ-હાઇબ્રિડ પદ્ધતિથી વિપરીત અથવા ફોટો-રિએક્ટિવ એમિનો એસિડ એનાલોગ સાથે વિવો ક્રોસ-લિંકિંગમાં ક્ષણિક પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની તપાસ માટે યોગ્ય ન પણ હોઈ શકે. જો કે, તે સ્થિર પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનું પરીક્ષણ કરવા માટે એક સારી પદ્ધતિ છે અને પ્રોટીન સંકુલને કેટલી વાર શુદ્ધ કરવામાં આવે છે તેની સંખ્યાને નિયંત્રિત કરીને વિવિધ સ્તરની તપાસની મંજૂરી આપે છે. એપ્લિકેશન્સ 2002 માં, મલ્ટિપ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સની લાક્ષણિકતા દ્વારા યીસ્ટના પ્રોટિઓમિક્સનું વ્યવસ્થિત રીતે વિશ્લેષણ કરવા માટે મોટા પાયે અભિગમમાં માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી સાથે ટી. એ. પી. ટેગનો પ્રથમ ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. અભ્યાસમાં 491 સંકુલ બહાર આવ્યા હતા, જેમાંથી 257 સંપૂર્ણપણે નવા હતા. બાકીના અન્ય સંશોધનથી પરિચિત હતા, પરંતુ હવે તે બધામાં નવા ઘટકો હોવાનું જાણવા મળ્યું હતું. તેઓએ એક જટિલ નેટવર્કમાં કાર્યાત્મક રીતે તમામ પ્રોટીન ઘટકોને સંબંધિત એક નકશો તૈયાર કર્યો. અન્ય ઘણા પ્રોટિઓમિક વિશ્લેષણમાં પણ ટી. એ. પી. ટેગનો ઉપયોગ સામેલ છે. ઇ. એમ. બી. ઓ. (ડીઝીમ્બોવ્સ્કી, 2004) દ્વારા કરવામાં આવેલા સંશોધનમાં પરમાણુ પૂર્વ-એમ. આર. એન. એ. જાળવણી અને સ્પ્લિસિંગ માટે જરૂરી નવા સંકુલની ઓળખ કરવામાં આવી હતી. તેઓએ અન્ય 3 પેટા એકમો (સ્નૂ17પી, બડ13પી અને પી. એમ. એલ. 1પી) થી બનેલા નવતર ત્રિમાસિક સંકુલને શુદ્ધ કર્યું છે અને શોધી કાઢ્યું છે કે આ પેટા એકમો વ્યવહાર્યતા માટે જરૂરી નથી પરંતુ પૂર્વ-એમ. આર. એન. એ. ના કાર્યક્ષમ સ્પ્લિસિંગ (ઇન્ટ્રોન દૂર કરવા) માટે જરૂરી છે. 2006 માં, ફ્લેશર એટ અલ. યુકેરીયોટિક રિબોસોમલ સંકુલ સાથે સંકળાયેલ પ્રોટીનને વ્યવસ્થિત રીતે ઓળખવામાં આવે છે. તેમણે યીસ્ટ રાઇબોસોમલ સંકુલને ઓળખવા માટે બહુપક્ષીય માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી પ્રોટીઓમિક સ્ક્રીનનો ઉપયોગ કર્યો અને પછી આ તમામ પ્રોટીનને કાર્યાત્મક રીતે જોડવા માટે ટી. એ. પી. ટેગિંગનો ઉપયોગ કર્યો. અન્ય એપિટોપ-ટેગ સંયોજનો મલ્ટીપ્રોટીન સંકુલના ટેન્ડમ-એફિનિટી શુદ્ધિકરણનો સિદ્ધાંત રીગાઉટ એટ અલ દ્વારા મૂળ કાર્યમાં ઉપયોગમાં લેવાતા સી. બી. પી. અને પ્રોટીન એ ટેગના સંયોજન સુધી મર્યાદિત નથી. (1999). ઉદાહરણ તરીકે, નકટાનીના જૂથ દ્વારા સસ્તન પ્રાણીઓના કોષોમાંથી અસંખ્ય પ્રોટીન સંકુલને શુદ્ધ કરવા માટે 2000 થી ફ્લેગ-અને એચએ-ટેગ્સના સંયોજનનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. ટી. એ. પી. સિદ્ધાંત પ્રકાશિત થયો ત્યારથી અન્ય ઘણા ટેગ સંયોજનોની દરખાસ્ત કરવામાં આવી છે. સંદર્ભો બાયોકેમિકલ વિભાજન પ્રક્રિયાઓ પ્રોટીન-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પરીક્ષણો