GAL4/UAS system
જીએએલ4-યુએએસ પ્રણાલી એ એક બાયોકેમિકલ પદ્ધતિ છે જેનો ઉપયોગ ફળની માખી જેવા સજીવોમાં જનીન અભિવ્યક્તિ અને કાર્યનો અભ્યાસ કરવા માટે થાય છે. તે 1988માં હિતોશી કાકીદાની અને માર્ક પટાશને અને નિકોલસ વેબસ્ટર અને પિયરે ચેમ્બોનની શોધ પર આધારિત છે કે યુએએસ સિક્વન્સ સાથે બંધાયેલ ગેલ 4 જનીન અભિવ્યક્તિને સક્રિય કરે છે. આ પદ્ધતિ 1993 માં એન્ડ્રીયા બ્રાન્ડ અને નોર્બર્ટ પેરીમોન દ્વારા માખીઓમાં રજૂ કરવામાં આવી હતી અને જનીનોની અભિવ્યક્તિનો અભ્યાસ કરવા માટે એક શક્તિશાળી તકનીક માનવામાં આવે છે. આ પ્રણાલીના બે ભાગો છેઃ ગેલ 4 જનીન, જે યીસ્ટ ટ્રાન્સક્રિપ્શન એક્ટિવેટર પ્રોટીન ગેલ 4 ને એન્કોડિંગ કરે છે, અને યુએએસ (અપસ્ટ્રીમ એક્ટિવેશન સિક્વન્સ), એક એન્હાન્સર કે જેની સાથે જીએએલ 4 ખાસ કરીને જનીન ટ્રાન્સક્રિપ્શનને સક્રિય કરવા માટે જોડાય છે. ગેલ4 પ્રણાલી જનીન અથવા પ્રોટીનને કયા કોષો વ્યક્ત કરે છે અને પ્રયોગ કરનાર આ જ્ઞાન સાથે શું કરવા માંગે છે તે વ્યાખ્યાયિત કરવાની સમસ્યાઓને અલગ કરવાની મંજૂરી આપે છે. આનુવંશિક વિજ્ઞાનીઓએ જી. એ. એલ. 4 રેખાઓ તરીકે ઓળખાતા પ્રતિકૃતિ સજીવો (સામાન્ય રીતે ફળની માખીઓ) ના આનુવંશિક પ્રકારો બનાવ્યા છે, જેમાંથી દરેક પ્રાણીની પેશીઓના અમુક ઉપગણમાં જી. એ. એલ. 4 વ્યક્ત કરે છે. ઉદાહરણ તરીકે, કેટલીક રેખાઓ GAL4 ને માત્ર સ્નાયુ કોશિકાઓમાં, અથવા માત્ર ચેતામાં, અથવા માત્ર એન્ટેનામાં, અને તેથી વધુ વ્યક્ત કરી શકે છે. ખાસ કરીને ફળની માખીઓ માટે, આવી હજારો રેખાઓ હોય છે, જેમાં સૌથી વધુ ઉપયોગી પ્રાણીના ખૂબ જ ચોક્કસ સબસેટમાં GAL4 વ્યક્ત કરે છે-કદાચ, ઉદાહરણ તરીકે, માત્ર તે ચેતાકોષો કે જે માખીના મગજના બે ચોક્કસ વિભાગોને જોડે છે. આ કોષોમાં જી. એ. એલ. 4ની હાજરીની બહુ ઓછી અથવા કોઈ અસર થતી નથી, કારણ કે જી. એ. એલ. 4ની મુખ્ય અસર યુ. એ. એસ. પ્રદેશ સાથે જોડાવાની હોય છે, અને મોટાભાગના કોષોમાં કોઈ (અથવા નિરુપદ્રવી) યુ. એ. એસ. પ્રદેશો હોતા નથી. ગેલ 4 પોતે દેખાતું નથી, અને કોષો પર તેની ઓછી અસર પડે છે, તેથી આ પ્રણાલીનો અન્ય જરૂરી ભાગ "રિપોર્ટર લાઇન્સ" છે. આ ઇચ્છિત જનીનની બાજુમાં વિશેષ યુ. એ. એસ. વિસ્તાર ધરાવતી માખીઓની જાતિઓ છે. આ આનુવંશિક સૂચનાઓ પ્રાણીના દરેક કોષમાં જોવા મળે છે, પરંતુ મોટાભાગના કોષોમાં કંઈ થતું નથી કારણ કે તે કોષ GAL4 ઉત્પન્ન કરતું નથી. જી. એ. એલ. 4 ઉત્પન્ન કરતા કોષોમાં, જો કે, યુ. એ. એસ. સક્રિય થાય છે, તેની બાજુનું જનીન ચાલુ થાય છે, અને તે તેના પરિણામી પ્રોટીનનું ઉત્પાદન કરવાનું શરૂ કરે છે. આ તપાસકર્તાને જાણ કરી શકે છે કે કયા કોષો GAL4 વ્યક્ત કરી રહ્યા છે, તેથી "રિપોર્ટર લાઇન" શબ્દ, પરંતુ કોષના વર્તનને ચાલાકીથી ચલાવવા માટેના જનીનો પણ ઘણીવાર ઉપયોગમાં લેવાય છે. લાક્ષણિક રિપોર્ટર જનીનોમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છેઃ ગ્રીન (જી. એફ. પી.) અથવા રેડ ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (આર. એફ. પી.) જેવા ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન, જે વૈજ્ઞાનિકોને એ જોવાની મંજૂરી આપે છે કે કયા કોષો ગેલ4 ચેનલહોડૉપ્સિનને વ્યક્ત કરે છે, જે ચેતા કોષો હેલોરહોડૉપ્સિનના પ્રકાશ-સંવેદનશીલ ટ્રિગરિંગને મંજૂરી આપે છે, જે તેનાથી વિપરીત ન્યુરોન્સ શિબાયરના ફાયરિંગને દબાવવા માટે પ્રકાશને મંજૂરી આપે છે, જે ચેતાકોષોને બંધ કરે છે, પરંતુ માત્ર ઊંચા તાપમાને (30 ડિગ્રી સેલ્સિયસ અને તેથી વધુ). આ જનીન સાથેના માખીઓને ઊંચા કરી શકાય છે અને નીચા તાપમાને પરીક્ષણ કરી શકાય છે જ્યાં તેમના ચેતાકોષો સામાન્ય રીતે વર્તે છે. પછી માખીઓના શરીરનું તાપમાન વધારી શકાય છે (કારણ કે તેઓ ઠંડા લોહીવાળા હોય છે), અને આ ચેતાકોષો બંધ થઈ જાય છે. જો માખીનું વર્તન બદલાય છે, તો તે ચેતાકોષો શું કરે છે તેની મજબૂત ચાવી આપે છે. જીઇસીઆઇ (આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ કેલ્શિયમ સૂચક), ઘણીવાર પ્રોટીનના જીસીએએમપી પરિવારના સભ્ય હોય છે. આ પ્રોટીન કેલ્શિયમના સંપર્કમાં આવે ત્યારે ફ્લોરોસ કરે છે, જે મોટાભાગના કોષોમાં ત્યારે થાય છે જ્યારે ચેતાકોષમાં આગ લાગે છે. આ વૈજ્ઞાનિકોને ચિત્રો અથવા ચલચિત્રો લેવાની મંજૂરી આપે છે, જે ચેતાતંત્રની કામગીરી દર્શાવે છે. ઉદાહરણ તરીકે, વૈજ્ઞાનિકો સૌપ્રથમ GAL4 રેખામાંથી ફ્લાય પસંદ કરીને ચેતાકોષોના વર્ગની કલ્પના કરી શકે છે જે ચેતાકોષોના ઇચ્છિત સમૂહમાં GAL4 ને વ્યક્ત કરે છે, અને તેને પત્રકાર રેખા સાથે પાર કરે છે જે GFP ને વ્યક્ત કરે છે. સંતાનમાં, કોષોનો ઇચ્છિત સબસેટ GAL4 બનાવશે, અને આ કોષોમાં GAL4 યુએએસ સાથે જોડાઈ જશે, અને GFPના ઉત્પાદનને સક્ષમ બનાવશે. તેથી કોષોનો ઇચ્છિત સબસેટ હવે ફ્લોરોસન્સ લીલો હશે અને તેને ફ્લોરોસન્સ માઇક્રોસ્કોપ સાથે અનુસરી શકાય છે. આગળ, આ કોષો શું કરી શકે છે તે જાણવા માટે, પ્રયોગ કરનાર ચેનલહોડૉપ્સિન રિપોર્ટર લાઇન સાથે સમાન GAL4 લાઇનને પાર કરીને, આ દરેક કોષોમાં ચેનલહોડૉપ્સિન વ્યક્ત કરી શકે છે. સંતાનમાં પસંદ કરેલા કોષો અને માત્ર તે કોષોમાં ચેનલહોડૉપ્સિન હશે અને તે તેજસ્વી પ્રકાશ દ્વારા શરૂ થઈ શકે છે. હવે વૈજ્ઞાનિક પોતાની મરજીથી આ ચોક્કસ કોષોને સક્રિય કરી શકે છે, અને આ કોષો શું કરી શકે છે તે જોવા માટે પરિણામી વર્તણૂકની તપાસ કરી શકે છે. ઓપરેશન ગેલ 4 એ એક મોડ્યુલર પ્રોટીન છે જેમાં મોટે ભાગે ડીએનએ-બંધનકર્તા ડોમેન અને સક્રિયકરણ ડોમેનનો સમાવેશ થાય છે. જે યુએએસ સાથે GAL4 જોડાય છે તે CGG-N11-CCG છે, જ્યાં N કોઈપણ આધાર હોઈ શકે છે. GAL4 એક યીસ્ટ પ્રોટીન છે જે સામાન્ય રીતે અન્ય સજીવોમાં હાજર નથી, તેમ છતાં તે ડ્રોસોફિલા અને માનવ કોષો જેવા વિવિધ સજીવોમાં ટ્રાન્સક્રિપ્શન સક્રિયક તરીકે કામ કરે છે, જે દર્શાવે છે કે જનીન અભિવ્યક્તિ માટેની સમાન પદ્ધતિઓ ઉત્ક્રાંતિ દરમિયાન સંરક્ષિત કરવામાં આવી છે. ડ્રોસોફિલામાં અભ્યાસ માટે, GAL4 જનીનને મૂળ જનીન પ્રવર્તક અથવા ચાલક જનીનના નિયંત્રણ હેઠળ મૂકવામાં આવે છે, જ્યારે યુએએસ લક્ષ્ય જનીનની અભિવ્યક્તિને નિયંત્રિત કરે છે. GAL4 પછી માત્ર કોષોમાં જ વ્યક્ત થાય છે જ્યાં ચાલક જનીન સામાન્ય રીતે સક્રિય હોય છે. બદલામાં, GAL4 એ ફક્ત જનીન અનુલેખનને સક્રિય કરવું જોઈએ જ્યાં યુએએસ રજૂ કરવામાં આવ્યું છે. ઉદાહરણ તરીકે, જી. એફ. પી. (ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન) જેવા દૃશ્યમાન માર્કરને એન્કોડિંગ કરતા જનીનને ફ્યુઝ કરીને ચાલક જનીનની અભિવ્યક્તિ પેટર્ન નક્કી કરી શકાય છે. જીએએલ4 અને યુએએસ ડ્રોસોફિલામાં જનીન અભિવ્યક્તિનો અભ્યાસ કરવા માટે ખૂબ જ ઉપયોગી છે કારણ કે તેઓ સામાન્ય રીતે હાજર નથી અને તેમની અભિવ્યક્તિ કોષની અન્ય પ્રક્રિયાઓમાં દખલ કરતી નથી. ઉદાહરણ તરીકે, ડ્રોસોફિલામાં GAL4/UAS-નિયંત્રિત ટ્રાન્સજીન્સનો ઉપયોગ પિગમેન્ટ ડિસ્પર્સિંગ ફેક્ટર (PDF) તરીકે ઓળખાતા જાણીતા લયબદ્ધ સર્કેડિયન આઉટપુટમાં એરિથમિક વર્તણૂક ઉત્પન્ન કરવા માટે ગ્લિયલ અભિવ્યક્તિને બદલવા માટે કરવામાં આવે છે. જો કે, કેટલાક સંશોધનોએ સૂચવ્યું છે કે ડ્રોસોફિલામાં GAL4 ની વધુ પડતી અભિવ્યક્તિથી આડઅસરો થઈ શકે છે, જે કદાચ રોગપ્રતિકારક શક્તિ અને તણાવના પ્રતિભાવો સાથે સંબંધિત છે જે અનિવાર્યપણે એલિયન પ્રોટીન છે. આફ્રિકન ક્લોડ ફ્રોગ ઝેનોપસ અને ઝેબ્રાફિશ જેવા ડ્રોસોફિલા ઉપરાંત સજીવોમાં જનીન અભિવ્યક્તિનો અભ્યાસ કરવા માટે પણ જીએએલ4-યુએએસ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે. જી. એ. એલ. 4/યુ. એ. એસ. પ્રણાલીનો ઉપયોગ ટુ-હાઇબ્રિડ સ્ક્રિનિંગમાં પણ થાય છે, જે ડીએનએ સાથે બે પ્રોટીન અથવા પ્રોટીન વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ઓળખવાની પદ્ધતિ છે. એક્સ્ટેન્શન્સ ગેલ4 અભિવ્યક્તિને "આંતરછેદ વ્યૂહરચનાઓ" દ્વારા વધુ ચોક્કસ બનાવી શકાય છે. આ બે અલગ-અલગ GAL4 રેખાઓને જોડી શકે છે-જેમ કે, A અને B-એવી રીતે કે GAL4 માત્ર તે કોષોમાં જ વ્યક્ત થાય છે જે રેખા Aમાં હોય પરંતુ રેખા Bમાં નહીં, અથવા જે રેખા A અને B બંનેમાં હોય. જ્યારે આંતરિક રીતે વિરલ GAL4 રેખાઓ સાથે જોડવામાં આવે છે, ત્યારે આ ખૂબ જ ચોક્કસ પસંદગી પ્રદાન કરે છે, જે ઘણીવાર એક જ કોષ પ્રકાર સુધી મર્યાદિત હોય છે. ગેરલાભ એ છે કે ઓછામાં ઓછી ત્રણ સ્વતંત્ર નિવેશ સાઇટ્સ જરૂરી છે, તેથી રેખાઓએ વિવિધ અને સ્વતંત્ર નિવેશ સાઇટ્સનો ઉપયોગ કરવો આવશ્યક છે, અને ઇચ્છિત અંતિમ સજીવો બનાવવા માટે એક કરતા વધુ ક્રોસની જરૂર છે. આ સંશોધનનું ખૂબ જ સક્રિય ક્ષેત્ર છે, અને આવી ઘણી આંતરછેદ વ્યૂહરચનાઓ છે, જેમાંથી બેની નીચે ચર્ચા કરવામાં આવી છે. કોષોમાં GAL4 અભિવ્યક્તિ બનાવવાની એક રીત જે રેખા A માં છે પરંતુ રેખા B માં નથી, GAL4 ને વ્યક્ત કરવા માટે રેખા A ની જરૂર પડે છે, અને GAL80 ને વ્યક્ત કરવા માટે રેખા B ની જરૂર પડે છે, જે GAL4 અવરોધક છે. તેથી, જે કોષો Aમાં હોય પરંતુ Bમાં ન હોય તેમાં જ સક્રિય GAL4 હશે, જે પછી રિપોર્ટર જનીનને ચલાવી શકે છે. GAL4 ને માત્ર A અને B બંનેમાં રહેલા કોષોમાં જ વ્યક્ત કરવા માટે, "સ્પ્લિટ-GAL4" નામની તકનીકનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. રેખા A એ GAL4 પ્રોટીનનો અડધો ભાગ વ્યક્ત કરવા માટે બનાવવામાં આવે છે, જે પોતે નિષ્ક્રિય છે. તેવી જ રીતે, રેખા B એ GAL4 ના બીજા અડધા ભાગને વ્યક્ત કરવા માટે બનાવવામાં આવી છે, જે પોતે પણ નિષ્ક્રિય છે. માત્ર બંને રેખાઓમાં રહેલા કોષો જ બંને અર્ધ બનાવે છે, જે લ્યુસીન ઝિપર દ્વારા GAL4 માં સ્વ-ભેગા થાય છે અને રિપોર્ટર જનીનને સક્રિય કરે છે. સંદર્ભો આનુવંશિકતા