Cell synchronization
સેલ સિંક્રોનાઇઝેશન એ એક પ્રક્રિયા છે જેના દ્વારા કોષ ચક્રના વિવિધ તબક્કે સંવર્ધનમાં કોષોને એક જ તબક્કામાં લાવવામાં આવે છે. કોષ ચક્ર દ્વારા પ્રગતિ કરતા કોષોના અભ્યાસમાં કોષ સમન્વય એક મહત્વપૂર્ણ પ્રક્રિયા છે કારણ કે તે માત્ર એક-કોષ પ્રયોગો પર આધાર રાખવાને બદલે વસ્તી-વ્યાપી માહિતી એકત્રિત કરવાની મંજૂરી આપે છે. સમન્વયના પ્રકારોને વ્યાપક રીતે બે જૂથોમાં વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે; ભૌતિક વિભાજન અને રાસાયણિક અવરોધ. શારીરિક વિભાજન એ એક એવી પ્રક્રિયા છે જેના દ્વારા કોષોને સતત વિભાજિત કરીને નીચેની લાક્ષણિકતાઓના આધારે તબક્કા-સમૃદ્ધ વસ્તીમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છેઃ કોષની ઘનતા કોષનું કદ એન્ટિબોડીઝ દ્વારા ચિહ્નિત કોષની સપાટીના એપિટોપની હાજરી લેબલવાળા કોષો દ્વારા પ્રકાશ વિખેરાયેલા ફ્લોરોસન્ટ ઉત્સર્જન. કોષો સમગ્ર કોષ ચક્રમાં વિવિધ આકારવિજ્ઞાન અને સપાટીના ચિહ્નો લે છે તે જોતાં, આ લક્ષણોનો ઉપયોગ તબક્કા દ્વારા અલગ કરવા માટે થઈ શકે છે. બે સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિઓ છે. સેન્ટ્રીફ્યુગલ ઇલ્યુટ્રિયેશન (અગાઉ કાઉન્ટર સ્ટ્રીમિંગ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન તરીકે ઓળખાતું હતું) સેન્ટ્રીફ્યુગલ ઇલ્યુટ્રિયેશનનો ઉપયોગ કોષ ચક્રના વિવિધ તબક્કાઓમાં કોષોને તેમના કદ અને સેડિમેન્ટેશન વેગ (સેડિમેન્ટેશન ગુણાંક સાથે સંબંધિત) ના આધારે અલગ કરવા માટે થઈ શકે છે. સમગ્ર કોષ ચક્રમાં સતત વૃદ્ધિની પેટર્નને કારણે, કેન્દ્રત્યાગી એલ્યુટ્રિએશન સેલ્યુલર વિજાતીયતા અને અલગ કદના ફેરફારના અભાવને કારણે G2 અને M તબક્કાઓ વચ્ચે ઓછા રિઝોલ્યુશન સાથે કદ વધારીને (અને સેડિમેન્ટેશન ગુણાંક વધારીને) કોષોને G1, S, G2 અને M તબક્કાઓમાં અલગ કરી શકે છે. મોટા કોષો ઝડપથી કાંપ કાપે છે, તેથી G2માં એક કોષ, જેણે વધુ વૃદ્ધિ સમયનો અનુભવ કર્યો છે, તે G1માં કોષ કરતાં વધુ ઝડપથી કાંપ કાપે છે અને તેથી તેને વિભાજિત કરી શકાય છે. સસ્પેન્શનમાં ઉગાડવામાં આવતા કોષો એકબીજાને વળગી રહેતા નથી અને ગોળાકાર, એકસમાન આકાર ધરાવતા હોવાથી તેમને બહાર કાઢવાનું સરળ બને છે. જો કે, કેટલાક પ્રકારનાં સંલગ્ન કોષોને ટ્રિપ્સિન સાથે સારવાર કરી શકાય છે અને એલ્યુટ્રિએશન માટે ફરીથી સ્થગિત કરી શકાય છે કારણ કે તેઓ સસ્પેન્શનમાં વધુ ગોળાકાર આકાર ધારણ કરશે. ફ્લો સાયટોમેટ્રી અને સેલ સોર્ટિંગ ફ્લો સાયટોમેટ્રી કોષોના ભૌતિક અને રાસાયણિક ગુણધર્મોની શોધ, ગણતરી અને માપન માટે પરવાનગી આપે છે. કોષો પ્રવાહીમાં લટકાવવામાં આવે છે અને ફ્લો સાયટોમીટર દ્વારા મૂકવામાં આવે છે. કોષોને લેસર બીમ દ્વારા એક પછી એક મોકલવામાં આવે છે અને પ્રકાશના વિખેરાઈને ડિટેક્ટર દ્વારા માપવામાં આવે છે. કોષો અથવા તેમના ઘટકોને ફ્લોરોસન્ટ માર્કર્સ સાથે લેબલ કરી શકાય છે જેથી તેઓ લેસરના જવાબમાં પ્રકાશની વિવિધ તરંગલંબાઇ બહાર કાઢે છે, જે વધારાના ડેટા સંગ્રહ માટે પરવાનગી આપે છે. માત્રાત્મક કોષ ચક્ર વિશ્લેષણ માટે, કોષો સામાન્ય રીતે ઇથેનોલ સાથે સ્થિર હોય છે અને પ્રોપિડિયમ આયોડાઇડ, હોક્સ્ટ 33342, ડીએપીઆઈ, 7-એમિનોએક્ટિનોમિસિન ડી, મિથ્રામાઇસિન, ડીઆરએક્યૂ 5, અથવા ટીઓ-પ્રો-3 જેવા ડીએનએ-બંધનકર્તા રંગોથી રંગીન હોય છે, જે ડીએનએ જથ્થા દ્વારા તબક્કાના નિર્ધારણ માટે પરવાનગી આપે છે. જો કે, જો આ કોષોને સ્થિર કરવામાં આવ્યા હોય, તો તેઓ મૃત છે અને સતત વૃદ્ધિ માટે જાળવી શકાતા નથી. જીવંત સંસ્કૃતિઓ જાળવવા માટે કોષોને માધ્યમોમાં ફરીથી સ્થગિત કરી શકાય છે અને બિન-ઝેરી રંગોથી રંગવામાં આવે છે. કોષોને જિનોમ સંપાદિત પણ કરી શકાય છે જેમ કે કેટલાક સેલ્યુલર પ્રોટીન જી. એફ. પી., એમ. ચેરી અને લ્યુસિફેરેઝ જેવા સંયોજિત ફ્લોરોસન્ટ ટેગથી બનાવવામાં આવે છે જેનો ઉપયોગ તે ઘટકોને શોધવા અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે. ઉદાહરણ તરીકે, ચિમેરિક હિસ્ટોન H2B-GFP રચનાઓ બનાવી શકાય છે અને તેનો ઉપયોગ ડીએનએ સામગ્રીને માપવા અને સમજદાર કોષ તબક્કાના સાધન તરીકે પ્રતિકૃતિની સ્થિતિ નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે. પ્રકાશ છૂટાછવાયા માપનો ઉપયોગ કદ જેવી લાક્ષણિકતાઓ નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે, જે ટેગિંગ વિના કોષ તબક્કાના તફાવતને મંજૂરી આપે છે. ફ્લો સાયટોમીટરનો ઉપયોગ મલ્ટિપેરામીટર સાયટોમેટ્રી ડેટા એકત્રિત કરવા માટે થઈ શકે છે, પરંતુ તેનો ઉપયોગ કોષોને અલગ કરવા અથવા શુદ્ધ કરવા માટે કરી શકાતો નથી. ફ્લોરોસન્સ-એક્ટિવેટેડ સેલ સોર્ટિંગ (એફ. એ. સી. એસ.) એ પ્રકાશના છૂટાછવાયા દ્વારા શોધી શકાય તેવા તફાવતના આધારે કોષોને અલગ કરવાની એક તકનીક છે. કોષનું કદ) અથવા ફ્લોરોસન્સ ઉત્સર્જન (પેનિટ્રેટેડ ડીએનએ, આરએનએ, પ્રોટીન અથવા એન્ટિજેન્સ દ્વારા). સિસ્ટમ ફ્લો સાયટોમેટ્રીની જેમ કામ કરે છે, પરંતુ નિર્ધારિત પરિમાણના આધારે માપવામાં આવ્યા પછી દરેક કોષના ટીપાંને પણ ચાર્જ કરશે. ચાર્જ કરેલું ટીપું પછી ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ડિફ્લેક્શન સિસ્ટમનો સામનો કરશે જે તે ચાર્જના આધારે કોષને અલગ કન્ટેનરમાં સૉર્ટ કરશે. આ ફ્લોરોસન્ટ સામગ્રી અથવા છૂટાછવાયા આધારે કોષોને અલગ કરવાની મંજૂરી આપે છે. સારાંશ આપવા માટે, કોષ ચક્ર તબક્કાના વિતરણ વિશે માત્રાત્મક માહિતી એકત્રિત કરવા માટે એકલા ફ્લો સાયટોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરી શકાય છે, પરંતુ એફએસીએસ સાથે સંકલનમાં ફ્લો સાયટોમેટ્રીનો ઉપયોગ વધુ અભ્યાસ માટે તબક્કાવાર માત્રાત્મક માહિતી અને અલગ કોષો એકત્રિત કરવા માટે કરી શકાય છે. મર્યાદાઓમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છેઃ પ્રકાશના છૂટાછવાયા માપન માટે, સ્થિર કોષો માટે G2 અને M (કેન્દ્રત્યાગી ઉત્સર્જનની જેમ) વચ્ચે નબળું રિઝોલ્યુશન, સ્થિર પરંતુ રંગીન કોષો માટે જીવંત સંવર્ધન જાળવવામાં અસમર્થતા, રંગની સારવારને કારણે કોષોમાં સંભવિત વિક્ષેપ અથવા મ્યુટેજેનેસિસ કેટલીક વસ્તીની વિજાતીયતા જાળવી શકાય છે, કારણ કે કદનું વિભાજન હંમેશા તબક્કાને માપવા માટે સચોટ ન હોઈ શકે અને ડીએનએ-સંપાદિત કોષો માટે દરેક તબક્કામાં (પ્રારંભિક G1 વિરુદ્ધ અંતમાં G1) તમામ કોષો એક જ બિંદુ પર ન હોઈ શકે, આ પ્રક્રિયામાં લાંબા સમય સુધી સમય લાગી શકે છે. આ તકનીકો ઈન વિટ્રોમાં હાથ ધરવામાં આવી શકે છે અને તેને સંવર્ધન વાતાવરણમાંથી દૂર કરવાની જરૂર નથી. રાસાયણિક નાકાબંધીનો સૌથી સામાન્ય પ્રકાર એ ધરપકડ અને મુક્તિ છે, જેમાં રાસાયણિક અવરોધ સાથે સંવર્ધનની સારવાર અને અવરોધ માટે તટસ્થ એજન્ટને ધોઈને અથવા ઉમેરીને અનુગામી મુક્તિનો સમાવેશ થાય છે. જ્યારે રાસાયણિક નાકાબંધી સામાન્ય રીતે ભૌતિક વિભાજન કરતાં વધુ અસરકારક અને ચોક્કસ હોય છે, ત્યારે કેટલીક પદ્ધતિઓ વિવિધ કારણોસર અપૂર્ણ હોઈ શકે છે, જેમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છેઃ સમન્વયિત કોષોનું પ્રમાણ અપૂરતું રાસાયણિક મેનિપ્યુલેશન્સ સેલ્યુલર કાર્યને વિક્ષેપિત કરી શકે છે અને/અથવા કોષોના એક ભાગને મારી શકે છે સારવાર ઝેરી છે અને વિવોમાં લાગુ પડતી નથી (જો ક્લિનિકલ એપ્લિકેશનને ધ્યાનમાં લેવામાં આવે તો જ સુસંગત) એમ મિટોટિક ધરપકડમાં ધરપકડ ઘણી પદ્ધતિઓ દ્વારા અને એમ-તબક્કાની અંદર વિવિધ બિંદુઓ પર પ્રાપ્ત કરી શકાય છે, જેમાં જી2/એમ સંક્રમણ, મેટાફેઝ/એનાફેઝ સંક્રમણ અને માઇટોટિક એક્ઝિટનો સમાવેશ થાય છે. નોકોડાઝોલ એ માઇક્રોટ્યુબ્યુલ પોલિમરાઇઝેશનનું ઝડપથી ઉલટાવી શકાય તેવું અવરોધક છે જેનો ઉપયોગ મેટાફેઝ/એનાફેઝ સંક્રમણમાં સ્પિન્ડલ એસેમ્બલી ચેકપોઇન્ટ પર એનાફેઝ પહેલાં કોષોને પકડવા માટે થઈ શકે છે. માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઝેર માઇટોટિક સ્પિન્ડલ્સની રચનાને અવરોધિત કરીને કામ કરે છે જે વિભાજીત કોષોમાં બહેન ક્રોમેટિડ્સ સાથે જોડાય છે અને અલગ પાડે છે. જ્યાં સુધી નોકોડાઝોલ ધોવાઇ ન જાય ત્યાં સુધી કોષો બંધ રહેશે. નોકોડાઝોલ ઇન્ટરફેઝ ચયાપચયને વિક્ષેપિત કરતું નથી, અને મુક્ત થયેલા કોષો સામાન્ય કોષ ચક્ર પ્રગતિમાં પાછા ફરે છે. કારણ કે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સ અન્ય સેલ્યુલર કાર્યોમાં મહત્વપૂર્ણ છે, નોકોડાઝોલનો સતત ઉપયોગ તે કાર્યોમાં વિક્ષેપમાં પરિણમી શકે છે, જેના કારણે સેલ મૃત્યુ થાય છે. G2 થી M તબક્કામાં સંક્રમણ માટે CDK1 CDK1 નો અવરોધ જરૂરી છે. આરઓ-3306 એ પસંદગીયુક્ત સીડીકે1 અવરોધક છે જે જી2/એમ સરહદ પર કોષોને ઉલટાવી શકે છે. આરઓ-3306 95 ટકા સાઇકલિંગ કોષો (કેન્સર કોષો સહિત) નું સમન્વય કરે છે, અને મુક્ત થયેલા કોષો ઝડપથી માઇટોસિસમાં પ્રવેશ કરે છે. રોસ્કોવિટાઇન રોસ્કોવિટાઇનનો ઉપયોગ કિનેઝના એટીપી-બંધનકર્તા પ્રદેશમાં એટીપી સાથે સ્પર્ધા કરીને સાયક્લિન-આધારિત કિનેઝ (સીડીકે) ની પ્રવૃત્તિને રોકવા માટે થઈ શકે છે. તેની અસરો શક્તિશાળી છે, કોષ ચક્રની પ્રગતિ માટે જરૂરી સી. ડી. કે. ના કાર્યને ઘટાડીને કોષોને અટકાવે છે. રોસ્કોવિટાઇનનો ઉપયોગ G0/G1, G1/S, અથવા G2/M સંક્રમણોમાં કોષોને પકડવા માટે થઈ શકે છે. કોલ્ચિસિન મેટાફેઝમાં કોષોને અટકાવે છે અને નોકોડાઝોલની જેમ માઇટોટિક સ્પિન્ડલની રચનાને અટકાવતું માઇક્રોટ્યુબ્યુલ ઝેર છે. તે માઇક્રોટ્યુબ્યુલ્સમાં ટ્યુબ્યુલિનને ડિપોલિમરાઇઝ કરીને કામ કરે છે, સ્પિન્ડલ એસેમ્બલી ચેકપોઇન્ટ પર સતત ધરપકડ દ્વારા એનાફેઝની પ્રગતિને અવરોધે છે. એસ (જી1/એસ ધરપકડ) માં ધરપકડ એસ તબક્કામાં ધરપકડમાં સામાન્ય રીતે ડીએનએ સંશ્લેષણના અવરોધનો સમાવેશ થાય છે કારણ કે જીનોમની નકલ કરવામાં આવી રહી છે. મોટાભાગની પદ્ધતિઓ ધોવા દ્વારા ઉલટાવી શકાય છે. ડબલ થાઇમાઇડિન બ્લોક થાઇમાઇડિનની ઉચ્ચ સાંદ્રતા સ્પર્ધાત્મક અવરોધ દ્વારા ડિઓક્સિન્યુક્લિયોટાઇડ ચયાપચયના માર્ગને વિક્ષેપિત કરે છે, આમ ડીએનએ પ્રતિકૃતિને અવરોધે છે. થાઇમિડીન સાથેની એક જ સારવાર સમગ્ર એસ તબક્કામાં કોષોને અટકાવે છે, તેથી ડબલ સારવાર પ્રારંભિક એસ તબક્કામાં વધુ સમાન અવરોધને પ્રેરિત કરવા માટે કાર્ય કરે છે. આ પ્રક્રિયા થાઇમાઇડિનની સારવારથી શરૂ થાય છે, કલ્ચરને ધોવા, ત્યારબાદ બીજી થાઇમાઇડિનની સારવાર થાય છે. હાઇડ્રોક્સિયુરિયા એન્ઝાઇમ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ રિડક્ટેઝને અટકાવીને ડીએનટીપીનું ઉત્પાદન ઘટાડે છે. આ પ્રતિકૃતિ કાંટા પર ડી. એન. ટી. પી. ના ડી. એન. એ. પોલિમરેઝને વંચિત કરીને ડી. એન. એ. સંશ્લેષણને અટકાવવાનું કામ કરે છે. હાઇડ્રોક્સિયુરિયાનો ઉપયોગ ચોક્કસ પ્રકારના કેન્સર અને લોહીની વિકૃતિઓની સારવાર માટે પણ થાય છે. એફિડિકોલિન એફિડોકોલિન એ ફૂગ-વ્યુત્પન્ન ટેટ્રાસાયક્લિક ડાઇટરપેનોઇડ છે જે ડીએનએ પોલિમરેઝ α માટે પસંદગીયુક્ત અવરોધક તરીકે કામ કરે છે. આ ઉત્સેચક પ્રતિકૃતિ ડીએનએ સંશ્લેષણ માટે જરૂરી છે, પરંતુ ડીએનએ રિપેર સંશ્લેષણ અથવા મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએ પ્રતિકૃતિને વિક્ષેપિત કરતું નથી. જી1માં ધરપકડ જી1માં કોષોના સમન્વય માટે એક સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી રાસાયણિક પદ્ધતિ અસ્તિત્વમાં છે. તેમાં લોવાસ્ટેટિનનો સમાવેશ થાય છે, જે 3-હાઈડ્રોક્સી-3-મિથાઈલગ્લુટેરિલ-કોએન્ઝાઇમ એ રિડક્ટેઝનું ઉલટાવી શકાય તેવું સ્પર્ધાત્મક અવરોધક છે, જે મેવાલોનિક એસિડના ઉત્પાદનમાં મહત્વપૂર્ણ એન્ઝાઇમ છે. મેવાલોનિક એસિડ કોલેસ્ટ્રોલના સંશ્લેષણ માટે જવાબદાર મેવાલોનેટ માર્ગમાં મુખ્ય મધ્યવર્તી છે. લોવાસ્ટેટિન-સારવાર કરાયેલ કોષોમાં કોલેસ્ટ્રોલનો ઉમેરો એ ધરપકડની અસરને પૂર્વવત્ કરતું નથી, તેથી લોવાસ્ટેટિન માર્ગમાં કેટલાક પ્રારંભિક મધ્યવર્તીની રચનાને અટકાવે છે જે પ્રારંભિક જી 1 દ્વારા પ્રગતિ માટે જરૂરી છે. સિંક્રોનાઇઝેશનની અન્ય પદ્ધતિઓ માઇટોટિક પસંદગી માઇટોટિક પસંદગી એ ઘાતાંકીય વૃદ્ધિમાંથી પસાર થતા મોનોલેયરમાંથી માઇટોટિક કોષોની પસંદગી માટેની દવા મુક્ત પ્રક્રિયા છે. માઇટોસિસ દરમિયાન, કોષો આકારવિજ્ઞાનમાં ફેરફારોમાંથી પસાર થાય છે, અને માઇટોટિક પસંદગી મોનોલેયરમાં ઉગાડવામાં આવતા સંલગ્ન કોષોમાં આનો લાભ લે છે. કોષો વધુ ગોળાકાર બને છે, જે સંવર્ધન પ્લેટ સાથે જોડાયેલા કોષ પટલના સપાટી વિસ્તારને ઘટાડે છે. તેથી માઇટોટિક કોષોને હળવેથી હલાવીને અને સુપરનેટન્ટમાંથી એકત્રિત કરીને સંપૂર્ણપણે અલગ કરી શકાય છે. પોષક તત્ત્વો/સીરમનો અભાવ લગભગ 24 કલાક સુધી સંવર્ધન માધ્યમમાંથી સીરમને દૂર કરવાથી જી0 શાંતિ અને પ્રારંભિક જી1 વચ્ચેના સંક્રમણ સમયે કોષોના સંચયમાં પરિણમે છે. આ ધરપકડ સીરમ અથવા વંચિત પોષક તત્ત્વોના ઉમેરા દ્વારા સરળતાથી ઉલટાવી શકાય છે. મુક્ત થયા પછી, કોષ ચક્ર દ્વારા પ્રગતિ પરિવર્તનશીલ હોય છે, કારણ કે કેટલાક કોષો શાંત રહે છે જ્યારે અન્ય કોષ ચક્ર દ્વારા પરિવર્તનશીલ દરે આગળ વધે છે. સંપર્ક અવરોધ સંપર્ક અવરોધ ત્યારે થાય છે જ્યારે કોષોને ઊંચા અથવા સંપૂર્ણ સંગમ સુધી વધવા દેવામાં આવે છે, જે કોષ-થી-કોષ સંપર્કને મહત્તમ કરે છે. આ સામાન્ય કોષોમાં પ્રારંભિક જી 1 માં ધરપકડ કરે છે. ઓછી ઘનતા પર કોષોની પ્રતિકૃતિ બનાવીને ધરપકડ ઉલટાવી દેવામાં આવે છે. કેન્સર માટે આંતરિક પ્રસાર-પ્રોત્સાહન પરિવર્તનને કારણે, ગાંઠ કોષ રેખાઓ સામાન્ય રીતે સંપર્ક અવરોધમાંથી પસાર થઈ શકતી નથી, જોકે તેમાં અપવાદો છે. બાહ્ય કડીઓ કોષ સમન્વય પ્રોટોકોલ સંદર્ભો કોષ જીવવિજ્ઞાન