ChIP-exo
ચીપ-એક્સો એ ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન આધારિત પદ્ધતિ છે જે તે સ્થાનોના મેપિંગ માટે છે કે જ્યાં રસ ધરાવતું પ્રોટીન (ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળ) જીનોમ સાથે જોડાય છે. તે ચીપ-સેક પ્રોટોકોલનો એક ફેરફાર છે, જે બંધનકર્તા સાઇટ્સના રિઝોલ્યુશનને સેંકડો બેઝ જોડીથી લગભગ એક બેઝ જોડીમાં સુધારે છે. તે પ્રોટીન-બાઉન્ડ ડીએનએના સ્ટ્રાન્ડ્સને 5 '-3' દિશામાં પ્રોટીન બાઇન્ડિંગ સાઇટના ન્યુક્લિયોટાઇડ્સની થોડી સંખ્યામાં ઘટાડવા માટે એક્સોન્યુક્લીઝના ઉપયોગનો ઉપયોગ કરે છે. એક્સોન્યુક્લીઝ-સારવાર કરાયેલા છેડાના ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ ડીએનએ સિક્વન્સિંગ, માઇક્રોએરે અને પી. સી. આર. ના કેટલાક સંયોજનનો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવે છે. આ સિક્વન્સ પછી જિનોમ પર સ્થાનોને ઓળખવા માટે જિનોમ સાથે મેપ કરવામાં આવે છે કે જેના પર પ્રોટીન જોડાય છે. પ્રોટીન-ડીએનએ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ શોધવા માટે 1984 થી ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન (ચીપ) તકનીકોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. પરિણામોની ગુણવત્તા સુધારવા માટે ચીપ પર ઘણા ફેરફારો કરવામાં આવ્યા છે. આવો જ એક સુધારો, ચિપ-ઓન-ચિપ (ચિપ-ચિપ), ચિપને માઇક્રોએરે ટેકનોલોજી સાથે જોડે છે. આ તકનીકમાં મર્યાદિત સંવેદનશીલતા અને વિશિષ્ટતા છે, ખાસ કરીને વિવોમાં જ્યાં માઇક્રોએરે પરમાણુ ડબ્બામાં હાજર હજારો પ્રોટીન દ્વારા મર્યાદિત હોય છે, પરિણામે ખોટા હકારાત્મકતાના ઊંચા દરમાં પરિણમે છે. ત્યારબાદ ચીપ-સિક્વન્સિંગ (ચીપ-સેક) આવ્યું, જે ચીપને ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ સાથે જોડે છે. જો કે, શીઅર્ડ ડીએનએ ફ્રેગમેન્ટ્સની વિજાતીય પ્રકૃતિ બંધનકર્તા સાઇટ્સને ±300 બેઝ જોડીની અંદર મેપ કરે છે, જે વિશિષ્ટતાને મર્યાદિત કરે છે. બીજું, દૂષિત ડીએનએ એક ગંભીર સમસ્યા રજૂ કરે છે કારણ કે થોડા આનુવંશિક સ્થાનો રસના પ્રોટીન સાથે ક્રોસ-લિંક્ડ હોય છે, જે કોઈપણ બિન-વિશિષ્ટ જીનોમિક ડીએનએને પૃષ્ઠભૂમિ અવાજનો નોંધપાત્ર સ્રોત બનાવે છે. આ સમસ્યાઓનું સમાધાન કરવા માટે, રી અને પુઘે ચીપ-એક્સો વિકસાવવા માટે ક્લાસિક ન્યુક્લીઝ પ્રોટેક્શન એસેમાં સુધારો કર્યો. આ નવી ચીપ તકનીક લેમ્બડા એક્સોન્યુક્લીઝ પર આધાર રાખે છે જે ફક્ત 5′-3′ દિશામાં અનબાઉન્ડ ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએનું અધઃપતન કરે છે. ટૂંકમાં, રસ ધરાવતું પ્રોટીન (એપિટોપ ટેગ સાથેનું એન્જિનિયરિંગ ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન માટે ઉપયોગી હોઈ શકે છે) ફોર્મેલ્ડિહાઇડનો ઉપયોગ કરીને જીનોમમાં તેના કુદરતી બંધનકર્તા સ્થાનો સાથે વિવોમાં જોડવામાં આવે છે. કોષો પછી એકત્રિત કરવામાં આવે છે, તૂટી જાય છે, અને ક્રોમેટિનને કાપવામાં આવે છે અને સોનિકેશન દ્વારા દ્રાવ્ય બને છે. ત્યારબાદ એક એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ ક્રોસ-લિંક્ડ ડીએનએ સાથે રસના પ્રોટીનને ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેટ કરવા માટે થાય છે. ડી. એન. એ. પી. સી. આર. અનુકૂલનકર્તાઓને પછી છેડા સાથે જોડવામાં આવે છે, જે એક્સોન્યુક્લીઝ પાચન પછી બીજા સ્ટ્રાન્ડ ડી. એન. એ. સંશ્લેષણ માટે પ્રાથમિક બિંદુ તરીકે કામ કરે છે. લામ્બડા એક્સોન્યુક્લીઝ પછી પ્રોટીન-ડીએનએ સહસંયોજક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની સરહદ પર પાચન અવરોધિત ન થાય ત્યાં સુધી 5 'છેડેથી ડબલ ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડ્સને પચાવે છે. મોટાભાગના દૂષિત ડીએનએ બીજા સિંગલ-સ્ટ્રાન્ડ વિશિષ્ટ એક્સોન્યુક્લીઝના ઉમેરા દ્વારા અધોગતિ પામે છે. ક્રોસ-લિંકિંગને ઉલટાવી દેવામાં આવે તે પછી, પી. સી. આર. એડેપ્ટર માટેના પ્રાઇમરને ડબલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ બનાવવા માટે વિસ્તૃત કરવામાં આવે છે, અને બીજા એડેપ્ટરને 5 'છેડા સાથે જોડવામાં આવે છે જેથી એક્સોન્યુક્લીઝ પાચન બંધ થવાના ચોક્કસ સ્થાનનું સીમાંકન કરી શકાય. પછી પુસ્તકાલયને પી. સી. આર. દ્વારા વિસ્તૃત કરવામાં આવે છે, અને ઉત્પાદનોને ઉચ્ચ થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ દ્વારા ઓળખવામાં આવે છે. આ પદ્ધતિ કોઈપણ જિનોમની અંદર કોઈપણ પ્રોટીન બંધનકર્તા સ્થળ માટે એક જ આધાર જોડીના રિઝોલ્યુશન માટે પરવાનગી આપે છે, જે ચીપ-ચિપ અથવા ચીપ-સેક કરતાં ઘણું વધારે રિઝોલ્યુશન છે. ફાયદા ચીપ-એક્સો પ્રોટીન બંધનકર્તા સ્થાનોને ઓળખવામાં સિંગલ બેઝ પેઅર રિઝોલ્યુશન સુધી છોડવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે. આ ચીપ-સેકથી વિપરીત છે જે પ્રોટીનના બંધન સ્થળને માત્ર ±300 આધાર જોડીઓ સાથે શોધી શકે છે. બિન-પ્રોટીન-બાઉન્ડ ડીએનએ ટુકડાઓનું પ્રદૂષણ ચીપ પ્રયોગોમાં ખોટા હકારાત્મક અને નકારાત્મકના ઊંચા દરમાં પરિણમી શકે છે. પ્રક્રિયામાં એક્સોન્યુક્લીઝનો ઉમેરો માત્ર બંધનકર્તા-સાઇટ કૉલિંગના રિઝોલ્યુશનમાં સુધારો કરે છે, પરંતુ અનુક્રમણિકા પહેલાં દ્રાવણમાંથી દૂષિત ડીએનએને દૂર કરે છે. ન્યુક્લિયોટાઇડના ટુકડા સાથે બિનકાર્યક્ષમ રીતે બંધાયેલા પ્રોટીનને ચીપ-એક્સો દ્વારા શોધવાની શક્યતા વધુ હોય છે. આનાથી, ઉદાહરણ તરીકે, અગાઉ શોધાયેલ કરતાં વધુ સીટીસીએફ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળ બંધનકર્તા સાઇટ્સની માન્યતાને મંજૂરી આપવામાં આવી છે. ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન અને ઓછી પૃષ્ઠભૂમિને કારણે, ચીપ-એક્સોનો ઉપયોગ કરતી વખતે સિક્વન્સિંગ કવરેજની ઓછી ઊંડાઈ જરૂરી છે. મર્યાદાઓ જો પ્રોટીન-ડીએનએ સંકુલમાં એક જ બંધનકર્તા ઘટનામાં ક્રોસ-લિંકિંગના બહુવિધ સ્થાનો હોય, તો તે બહુવિધ અલગ બંધનકર્તા ઘટનાઓ હોય તેમ દેખાઈ શકે છે. આ સંભવિત પરિણામ એ જ ઇવેન્ટમાં ઉપલબ્ધ બંધનકર્તા સાઇટ્સમાંથી એક પર આ પ્રોટીનને વિકૃત અને ક્રોસ-લિંકિંગ કરવામાં આવે છે. પ્રોટીન કયા સ્થળ સાથે ક્રોસ-લિંક્ડ છે તેના આધારે એક્સોન્યુક્લીઝ પછી બાઉન્ડ સાઇટ્સમાંથી એક પર બંધ થઈ જશે. કોઈપણ ચીપ-આધારિત પદ્ધતિની જેમ, આ તકનીકનો ઉપયોગ કરવા માટે રસના પ્રોટીન માટે યોગ્ય એન્ટિબોડી ઉપલબ્ધ હોવી જરૂરી છે. રી અને પુઘ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોના નાના સંગ્રહ પર વિશ્લેષણ કરીને ચીપ-એક્સો રજૂ કરે છેઃ રીબ 1, ગેલ 4, પીએચડી 1, યીસ્ટમાં રૅપ 1 અને માનવમાં સીટીસીએફ. રિબ 1 સાઇટ્સ ઘણીવાર ક્લસ્ટરોમાં જોવા મળતી હતી અને આ ક્લસ્ટરોમાં અપેક્ષા કરતા ~ 10 ગણો વધુ કબજો હતો. ક્લસ્ટરોમાં ગૌણ સ્થળો પ્રાથમિક બંધનકર્તા સ્થળમાંથી ~ 40 બી. પી. મળી આવ્યા હતા. ગેલ 4 ની બંધનકર્તા રચનાઓએ ચારમાંથી ત્રણ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ માટે મજબૂત પસંદગી દર્શાવી હતી, જે ગેલ 4 અને બાકાત ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ વચ્ચે નકારાત્મક ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સૂચવે છે. Phd1 ત્રણ જુદી જુદી રચનાઓને ઓળખે છે જે Phd1 ની બંધનકર્તા રચનાની અસ્પષ્ટતાના અગાઉના અહેવાલોને સમજાવે છે. રૅપ 1 ચાર પ્રધાનતત્ત્વોને ઓળખતો હોવાનું જાણવા મળ્યું હતું. આ પ્રોટીન દ્વારા બંધાયેલા રાઇબોસોમલ પ્રોટીન જનીનોમાં મજબૂત સર્વસંમતિ ક્રમ સાથે ચોક્કસ રચનાનો ઉપયોગ કરવાની વૃત્તિ હતી. અન્ય જનીનો ઘણીવાર નબળા સર્વસંમતિ પ્રધાનતત્ત્વોના સમૂહોનો ઉપયોગ કરે છે, સંભવતઃ સમાન કબજો હાંસલ કરવા માટે. સી. ટી. સી. એફ. ના બંધનકર્તા પ્રણાલીઓમાં ચાર "મોડ્યુલો" નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. બાઉન્ડ CTCF સાઇટ્સમાંથી અડધા મોડ્યુલ 1 અને 2 નો ઉપયોગ કરે છે, જ્યારે બાકીના ચારના કેટલાક સંયોજનનો ઉપયોગ કરે છે. એવું માનવામાં આવે છે કે સીટીસીએફ આ મોડ્યુલોના વિવિધ સંયોજનોને ઓળખવા માટે તેની ઝિંક આંગળીઓનો ઉપયોગ કરે છે. રી અને પુઘે સેક્રોમાઇસીસ જીનોમમાં પૂર્વ-પ્રારંભ સંકુલ (પી. આઈ. સી.) માળખું અને સંગઠનનું વિશ્લેષણ કર્યું. ચીપ-એક્સોનો ઉપયોગ કરીને, તેઓ અન્ય શોધો વચ્ચે, ટાટા-ઓછી હોવાનું નોંધાયેલા પ્રમોટરોમાં ટાટા જેવી સુવિધાઓને ચોક્કસપણે ઓળખવામાં સક્ષમ હતા. આ પણ જુઓ ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન ચિપ-સિક્વન્સિંગ ચિપ-ઓન-ચિપ પ્રોટીન-ડીએનએ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ ઉચ્ચ વ્યાખ્યામાં ડીએનએ-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન બંધનકર્તા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળને ઉકેલવું મહત્વપૂર્ણ જીન-રેગ્યુલેશન પ્રોટીન નવી પદ્ધતિ દ્વારા પિનપોઈન્ટેડ સેક્સોરઃ એક આર/બાયોકોન્ડક્ટર પેકેજ ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન પ્રોટીન-ડીએનએ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ઉજાગર કરવા માટે ચિપ-એક્સોમાં પ્રતિકૃતિઓ પેકોનિક જીનોમિક્સ પ્રોટીન પદ્ધતિઓ મોલેક્યુલર બાયોલોજી મોલેક્યુલર બાયોલોજી જીનોમિક્સ ડીએનએ સિક્વન્સિંગ બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ તકનીકો