Single particle analysis
સિંગલ પાર્ટિકલ એનાલિસિસ એ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (TEM) માંથી છબીઓનું વિશ્લેષણ કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી સંબંધિત કોમ્પ્યુટરાઈઝ્ડ ઇમેજ પ્રોસેસિંગ તકનીકોનું જૂથ છે. આ પદ્ધતિઓ કણોના નમૂનાઓ, ખાસ કરીને પ્રોટીન અથવા વાયરસ જેવા અન્ય મોટા જૈવિક ઘટકોની TEM છબીઓમાંથી મેળવી શકાય તેવી માહિતીને સુધારવા અને વિસ્તૃત કરવા માટે વિકસાવવામાં આવી હતી. રંગીન અથવા બિન-રંગીન કણોની વ્યક્તિગત છબીઓ ખૂબ જ ઘોંઘાટીયા હોય છે, અને તેનું અર્થઘટન કરવું ખૂબ મુશ્કેલ હોય છે. સમાન કણોની ઘણી ડિજિટાઇઝ્ડ છબીઓને એકસાથે જોડવાથી મજબૂત અને વધુ સરળતાથી અર્થઘટન કરી શકાય તેવી સુવિધાઓ સાથેની છબી મળે છે. આ તકનીકનું વિસ્તરણ કણના ત્રિ-પરિમાણીય પુનર્નિર્માણ માટે એક કણ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરે છે. ક્રાયો-ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને ઉપ-નેનોમીટર રીઝોલ્યુશન અને નજીકના અણુ રીઝોલ્યુશન સાથે પુનર્નિર્માણ ઉત્પન્ન કરવું શક્ય બન્યું છે, પ્રથમ અત્યંત સપ્રમાણ વાયરસના કિસ્સામાં, અને હવે નાના, અસમપ્રમાણ પ્રોટીનમાં પણ. એકલ કણ વિશ્લેષણ પ્રેરિત કપલ્ડ પ્લાઝ્મા માસ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (આઇસીપી-એમએસ) દ્વારા પણ કરી શકાય છે. તકનીકો એક કણનું વિશ્લેષણ નકારાત્મક રંગીન અને કાચું બરફ-જડિત ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન ક્રાયોમિક્રોસ્કોપી (ક્રાયોટીઈએમ) નમૂનાઓ બંને પર કરી શકાય છે. એક કણ વિશ્લેષણ પદ્ધતિઓ, સામાન્ય રીતે, નમૂનાના એકરૂપ હોવા પર નિર્ભર હોય છે, જો કે રચનાત્મક વિષમતા સાથે વ્યવહાર કરવા માટેની તકનીકો વિકસાવવામાં આવી રહી છે. ફોસ્ફોરેસેન્ટ સ્તર સાથે જોડાયેલા ચાર્જ-કપલ્ડ ડિવાઇસ (સી. સી. ડી.) ડિટેક્ટર્સનો ઉપયોગ કરીને છબીઓ (માઇક્રોગ્રાફ્સ) ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપથી લેવામાં આવે છે (ભૂતકાળમાં, તેઓ તેના બદલે ફિલ્મ પર એકત્રિત કરવામાં આવતા હતા અને ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા સ્કેનર્સનો ઉપયોગ કરીને ડિજિટાઇઝ કરવામાં આવતા હતા). છબી પ્રક્રિયા વિશિષ્ટ સોફ્ટવેર કાર્યક્રમોનો ઉપયોગ કરીને હાથ ધરવામાં આવે છે, જે ઘણીવાર મલ્ટી-પ્રોસેસર કમ્પ્યુટર ક્લસ્ટરો પર ચાલે છે. નમૂના અથવા ઇચ્છિત પરિણામોના આધારે, દ્વિ-અથવા ત્રિ-પરિમાણીય પ્રક્રિયાના વિવિધ પગલાં લઈ શકાય છે. વધુમાં, ICP-MS એકમનો ઉપયોગ કરીને એકલ કણ વિશ્લેષણ વ્યક્તિગત કણ સ્થિતિમાં પણ કરી શકાય છે. સંરેખણ અને વર્ગીકરણ જૈવિક નમૂનાઓ, અને ખાસ કરીને પાતળા કાચવાળા બરફમાં જડિત નમૂનાઓ, અત્યંત કિરણોત્સર્ગ સંવેદનશીલ હોય છે, આમ નમૂનાની છબી બનાવવા માટે માત્ર ઓછા ઇલેક્ટ્રોન ડોઝનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. આ ઓછી માત્રા, તેમજ ઉપયોગમાં લેવાતા ધાતુના ડાઘમાં વિવિધતા (જો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો) નો અર્થ એ છે કે અવલોકન કરવામાં આવતા કણ દ્વારા આપવામાં આવેલા સંકેતની તુલનામાં છબીઓમાં ઉચ્ચ અવાજ હોય છે. ઘણી સમાન છબીઓને એકબીજા સાથે સંરેખિત કરીને જેથી તેઓ રજિસ્ટરમાં હોય અને પછી તેમની સરેરાશ કરીને, ઉચ્ચ સંકેત-થી-અવાજ ગુણોત્તર ધરાવતી છબી મેળવી શકાય છે. કારણ કે ઘોંઘાટ મોટે ભાગે અવ્યવસ્થિત રીતે વહેંચાયેલો હોય છે અને અંતર્ગત છબી સ્થિર હોય છે, દરેક પિક્સેલની તીવ્રતાને ઘણી છબીઓ પર સરેરાશ કરીને માત્ર સ્થિર લાક્ષણિકતાઓને મજબૂત કરવામાં આવે છે. લાક્ષણિક રીતે, એક છબીને બીજી પર મેપ કરવા માટે શ્રેષ્ઠ સંરેખણ (અનુવાદ અને ઇન-પ્લેન રોટેશન) ની ગણતરી ક્રોસ-સહસંબંધ દ્વારા કરવામાં આવે છે. જો કે, માઇક્રોગ્રાફમાં ઘણીવાર બહુવિધ જુદી જુદી દિશાઓ અને/અથવા રચનાઓમાં કણો હોય છે, અને તેથી વધુ પ્રતિનિધિ છબી સરેરાશ મેળવવા માટે, સમાન કણોની છબીઓને બહુવિધ સમૂહોમાં એકસાથે જૂથબદ્ધ કરવાની પદ્ધતિ જરૂરી છે. આ સામાન્ય રીતે ઘણા ડેટા વિશ્લેષણ અને છબી વર્ગીકરણ અલ્ગોરિધમ્સમાંથી એકનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે, જેમ કે બહુ-વિવિધતા આંકડાકીય વિશ્લેષણ અને અધિક્રમિક ચડતા વર્ગીકરણ, અથવા કે-મીન્સ ક્લસ્ટરિંગ. ઘણીવાર હજારો કણોની છબીઓના ડેટા સેટનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, અને શ્રેષ્ઠ ઉકેલ સુધી પહોંચવા માટે સંરેખણ અને વર્ગીકરણની પુનરાવર્તિત પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, જેમાં વર્ગીકરણ દ્વારા ઉત્પાદિત મજબૂત છબી સરેરાશનો ઉપયોગ સમગ્ર ડેટા સેટના અનુગામી સંરેખણ માટે સંદર્ભ છબીઓ તરીકે થાય છે. ઇમેજ ફિલ્ટરિંગ (બેન્ડ-પાસ ફિલ્ટરિંગ) નો ઉપયોગ ઘણીવાર છબીઓમાં ઉચ્ચ અને/અથવા ઓછી અવકાશી આવર્તન માહિતીના પ્રભાવને ઘટાડવા માટે થાય છે, જે સંરેખણ અને વર્ગીકરણ પ્રક્રિયાઓના પરિણામોને અસર કરી શકે છે. આ ખાસ કરીને નકારાત્મક ડાઘવાળી છબીઓમાં ઉપયોગી છે. અલ્ગોરિધમ્સ ઝડપી ફોરિયર ટ્રાન્સફોર્મ (એફ. એફ. ટી.) નો ઉપયોગ કરે છે, જે ઘણીવાર ચોક્કસ આવર્તન શ્રેણીઓને દબાવવા માટે પારસ્પરિક જગ્યામાં ગૌસીયન આકારના નરમ ધારવાળા માસ્કનો ઉપયોગ કરે છે. હાઇ-પાસ ફિલ્ટર્સ ઓછી અવકાશી આવૃત્તિઓ (જેમ કે રેમ્પ અથવા ગ્રેડિયન્ટ અસરો) ને દૂર કરે છે, જેનાથી ઉચ્ચ આવૃત્તિઓ અકબંધ રહે છે. લો-પાસ ફિલ્ટર્સ ઉચ્ચ અવકાશી આવર્તન સુવિધાઓને દૂર કરે છે અને સારી વિગતો પર અસ્પષ્ટ અસર કરે છે. કોન્ટ્રાસ્ટ ટ્રાન્સફર ફંક્શન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપમાં છબી રચનાની પ્રકૃતિને કારણે, બ્રાઇટ-ફિલ્ડ TEM છબીઓ નોંધપાત્ર અંડરફોકસનો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવે છે. આ, માઇક્રોસ્કોપની લેન્સ સિસ્ટમમાં સહજ લાક્ષણિકતાઓ સાથે, બિંદુ પ્રસાર કાર્ય તરીકે દૃશ્યમાન એકત્રિત છબીઓને ઝાંખી પાડે છે. ઇમેજિંગ શરતોની સંયુક્ત અસરોને કોન્ટ્રાસ્ટ ટ્રાન્સફર ફંક્શન (સીટીએફ) તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, અને પારસ્પરિક અવકાશમાં કાર્ય તરીકે ગાણિતિક રીતે અંદાજિત કરી શકાય છે. વિશિષ્ટ ઇમેજ પ્રોસેસિંગ તકનીકો જેમ કે ફેઝ ફ્લિપિંગ અને એમ્પ્લિટ્યુડ કરેક્શન/વીનર ફિલ્ટરિંગ સીટીએફ માટે (ઓછામાં ઓછું આંશિક રીતે) સુધારી શકે છે, અને ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન પુનર્નિર્માણને મંજૂરી આપે છે. ત્રિ-પરિમાણીય પુનર્નિર્માણ ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી છબીઓ તબીબી એક્સ-રે જેવી જ વસ્તુ દ્વારા ઘનતાનું વિતરણ દર્શાવતા પદાર્થના અંદાજો છે. પ્રક્ષેપણ-સ્લાઇસ પ્રમેયનો ઉપયોગ કરીને જોવાના ખૂણાઓની શ્રેણીમાંથી લેવામાં આવેલી વસ્તુની ઘણી છબીઓ (2D અંદાજો) ને જોડીને પદાર્થનું ત્રિ-પરિમાણીય પુનર્નિર્માણ કરી શકાય છે. કાચવાળા બરફમાં પ્રોટીન આદર્શ રીતે દિશાઓ (અથવા જોવાના ખૂણા) નું અવ્યવસ્થિત વિતરણ અપનાવે છે, જો મોટી સંખ્યામાં કણોની છબીઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો એકદમ આઇસોટ્રોપિક પુનર્નિર્માણની મંજૂરી આપે છે. આ ઇલેક્ટ્રોન ટોમોગ્રાફી સાથે વિરોધાભાસી છે, જ્યાં નમૂના/ઇમેજિંગ સેટની ભૂમિતિને કારણે જોવાના ખૂણા મર્યાદિત હોય છે, જે અનિસોટ્રોપિક પુનર્નિર્માણ આપે છે. ફિલ્ટર કરેલ બેક પ્રોજેક્શન એ એક કણ વિશ્લેષણમાં 3D પુનર્નિર્માણ પેદા કરવાની સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ છે, જો કે ઘણા વૈકલ્પિક અલ્ગોરિધમ્સ અસ્તિત્વમાં છે. પુનર્નિર્માણ કરી શકાય તે પહેલાં, દરેક છબીમાં ઑબ્જેક્ટની દિશાનો અંદાજ કાઢવાની જરૂર છે. દરેક છબીના સંબંધિત યુલર ખૂણાઓ શોધવા માટે ઘણી પદ્ધતિઓ વિકસાવવામાં આવી છે. કેટલાક સામાન્ય રેખાઓ (સામાન્ય 1D અંદાજો અને સાઇનોગ્રામ) પર આધારિત છે, અન્ય પુનરાવર્તિત પ્રક્ષેપણ મેળ ખાતા અલ્ગોરિધમ્સનો ઉપયોગ કરે છે. બાદમાં એક સરળ, ઓછી રીઝોલ્યુશન 3D પ્રારંભિક મોડેલથી શરૂઆત કરીને કામ કરે છે અને પ્રાયોગિક છબીઓને મોડેલના અંદાજો સાથે સરખાવે છે અને ઉકેલ તરફ બુટસ્ટ્રેપ કરવા માટે એક નવું 3D બનાવે છે. અંતર્ગત હેલિકલ સમપ્રમાણતાનો લાભ લઈને હેલિકલ નમૂનાઓ (જેમ કે તમાકુ મોઝેક વાયરસ) નું 3D પુનર્નિર્માણ કરવા માટેની પદ્ધતિઓ પણ ઉપલબ્ધ છે. આ નમૂનાઓ માટે વાસ્તવિક અવકાશ પદ્ધતિઓ (હેલિક્સના વિભાગોને એક કણો તરીકે ગણવા) અને પારસ્પરિક અવકાશ પદ્ધતિઓ (વિવર્તન પેટર્નનો ઉપયોગ કરીને) બંનેનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. ઝુકાવ પદ્ધતિઓ માઇક્રોસ્કોપના નમૂનાના તબક્કાને નમાવી શકાય છે (સામાન્ય રીતે એક જ અક્ષ સાથે), જે રેન્ડમ શંકુ ઝુકાવ તરીકે ઓળખાતી એક કણ તકનીકને મંજૂરી આપે છે. નમૂનાનો વિસ્તાર શૂન્ય અને ઉચ્ચ ખૂણા (~ 60-70 ડિગ્રી) બંને પર અથવા ઓર્થોગોનલ ઝુકાવ પુનર્નિર્માણની સંબંધિત પદ્ધતિના કિસ્સામાં, + 45 અને-45 ડિગ્રી પર ચિત્રિત કરવામાં આવે છે. બે જુદા જુદા ઝુકાવ (ઝુકાવ જોડી) પર સમાન પદાર્થને અનુરૂપ કણોની જોડી પસંદ કરવામાં આવે છે, અને અનુગામી સંરેખણ અને વર્ગીકરણ પગલાંઓમાં ઉપયોગમાં લેવાતા પરિમાણોને અનુસરીને ત્રિ-પરિમાણીય પુનર્નિર્માણ પ્રમાણમાં સરળતાથી પેદા કરી શકાય છે. આનું કારણ એ છે કે દરેક કણનો જોવાનો કોણ (ત્રણ યુલર ખૂણા તરીકે વ્યાખ્યાયિત) ઝુકાવ ભૂમિતિમાંથી જાણી શકાય છે. રેન્ડમ શંક્વાકાર ઝુકાવમાંથી 3D પુનર્નિર્માણ દિશા નિર્દેશોની મર્યાદિત શ્રેણીના પરિણામે ગુમ થયેલ માહિતીથી પીડાય છે. ગુમ થયેલ શંકુ તરીકે ઓળખાય છે (પારસ્પરિક જગ્યામાં આકારને કારણે), આ 3D નકશામાં વિકૃતિઓનું કારણ બને છે. જો કે, ખોવાયેલી શંકુની સમસ્યાને ઘણીવાર કેટલાક ઝુકાવ પુનર્નિર્માણને જોડીને દૂર કરી શકાય છે. ઝુકાવ પદ્ધતિઓ નકારાત્મક રંગીન નમૂનાઓ માટે શ્રેષ્ઠ અનુકૂળ છે, અને તેનો ઉપયોગ એવા કણો માટે થઈ શકે છે જે પસંદગીના દિશા નિર્દેશોમાં કાર્બન સહાયક ફિલ્મને શોષી લે છે. ચાર્જિંગ અથવા બીમ-પ્રેરિત હિલચાલ તરીકે ઓળખાતી ઘટના કાચવાળા બરફમાં નમૂનાઓની ઉચ્ચ-નમેલી છબીઓ એકત્રિત કરવાનું પડકારજનક બનાવે છે. નકશા વિઝ્યુલાઇઝેશન અને ફિટિંગ વિવિધ સોફ્ટવેર પ્રોગ્રામ્સ ઉપલબ્ધ છે જે 3D નકશા જોવાની મંજૂરી આપે છે. આ ઘણીવાર વપરાશકર્તાને ઇલેક્ટ્રોન ઘનતામાં પેટા એકમોના પ્રોટીન કોઓર્ડિનેટ્સ (એક્સ-રે ક્રિસ્ટલોગ્રાફી અથવા એન. એમ. આર. માંથી માળખાં) માં જાતે ડોક કરવા માટે સક્ષમ કરે છે. કેટલાક પ્રોગ્રામ્સ ગણતરીત્મક રીતે પેટા એકમોને પણ ફિટ કરી શકે છે. સિંગલ પાર્ટિકલ આઇ. સી. પી.-એમ. એસ. સિંગલ પાર્ટિકલ-ઇન્ડ્યુસ્ડ કપલ્ડ પ્લાઝમા-માસ સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી (એસ. પી.-આઇ. સી. પી.-એમ. એસ.) નો ઉપયોગ એવા ઘણા ક્ષેત્રોમાં થાય છે જ્યાં પર્યાવરણીય પ્રવાહીના નમૂનાઓમાં સસ્પેન્ડેડ કણોને શોધવા અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવાની, તેમના સ્થળાંતરનું મૂલ્યાંકન કરવાની, કણોના કદ અને તેમના વિતરણનું મૂલ્યાંકન કરવાની અને આપેલ વાતાવરણમાં તેમની સ્થિરતા પણ નક્કી કરવાની સંભાવના છે. એસ. પી.-આઇ. સી. પી.-એમ. એસ. ની રચના 2000માં ક્લાઉડ ડેગુએલ્ડ્રે દ્વારા કણ સસ્પેન્શન માટે કરવામાં આવી હતી. તેમણે સૌપ્રથમ જિનીવા યુનિવર્સિટીની ફોરેલ ઇન્સ્ટિટ્યૂટમાં આ નવી પદ્ધતિનું પરીક્ષણ કર્યું હતું અને 2002ની વસંતઋતુમાં ઇ. એમ. આર. એસ. ની બેઠક દરમિયાન 'કોલોઇડ 2ઓઓ2' પરિસંવાદમાં અને 2003માં કાર્યવાહીમાં આ નવો વિશ્લેષણાત્મક અભિગમ રજૂ કર્યો હતો. આ અભ્યાસ એસ. પી. આઇ. સી. પી.-એમ. એસ. નો સિદ્ધાંત અને માટીના કણો (મોન્ટમોરિલોનાઇટ) તેમજ કોલોઇડ્સના અન્ય સસ્પેન્શન પર કરવામાં આવેલા પરીક્ષણોના પરિણામો રજૂ કરે છે. ત્યારબાદ આ પદ્ધતિનું પરીક્ષણ થોરિયમ ડાયોક્સાઇડ નેનોપાર્ટિકલ્સ પર ડેગ્યુએલડ્રે એન્ડ ફેવર્જર (2004), ઝિર્કોનિયમ ડાયોક્સાઇડ પર ડેગ્યુએલડ્રે એટ અલ (2004) અને ગોલ્ડ નેનોપાર્ટિકલ્સ દ્વારા કરવામાં આવ્યું હતું, જેનો ઉપયોગ નેનોફાર્મેસીમાં સબસ્ટ્રેટ તરીકે થાય છે અને ડેગ્યુએલડ્રે એટ અલ (2006) દ્વારા પ્રકાશિત કરવામાં આવે છે. ત્યારબાદ, યુરેનિયમ ડાયોક્સાઇડ નેનો-અને સૂક્ષ્મ કણોના અભ્યાસે એક વિગતવાર પ્રકાશન, રેફ. ડેગુએલ્ડ્રે એટ અલ (2006). 2010 થી એસ. પી. આઇ. સી. પી.-એમ. એસ. માટે રસ વિસ્ફોટ થયો છે. ઉદાહરણો પ્રોટીન સંશ્લેષણ, લિગાન્ડ બંધન અને આરએનએ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પરની મહત્વપૂર્ણ માહિતી આ નવીન તકનીકનો ઉપયોગ કરીને 7.5 થી 25 એ. ના મધ્યમ રિઝોલ્યુશન પર મેળવી શકાય છે. મિથેનોકોકસ મેરિપાલુડિસ ચેપરનિન, 0.43 નેનોમીટર રિઝોલ્યુશનમાં પુનઃનિર્મિત. આ બેક્ટેરિયલ પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ અન્ય પ્રોટીનને ફોલ્ડ કરવા માટેનું એક મશીન છે, જે શેલની અંદર ફસાઈ જાય છે. 0. 09 નેનોમીટર રિઝોલ્યુશન પર યીસ્ટમાંથી ફેટી એસિડ સિન્થેઝ. આ વિશાળ એન્ઝાઇમ સંકુલ સેલ્યુલર જીવન માટે જરૂરી લાંબી સાંકળ ફેટી એસિડ્સના નિર્માણ માટે જવાબદાર છે. એક્વેરિયોવાયરસનું 0.33 નેનોમીટરનું પુનર્નિર્માણ. આ વાયરસ માછલીઓ અને અન્ય જળચર પ્રાણીઓને ચેપ લગાવે છે. પુનર્નિર્માણમાં એમિનો એસિડની બાજુની સાંકળની ઘનતા સરળતાથી જોવા મળે તેટલું ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન છે. પ્રાથમિક ડેટાબેઝ ઇ. એમ. ડેટા બેંક (ઇ. એમ. ડેટા બેંક) સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ માઇક્રોસ્કોપ પ્રોટીન માળખું છબી પ્રક્રિયા