Bisulfite sequencing
બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ (બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ તરીકે પણ ઓળખાય છે) એ મિથાઇલેશનની પેટર્ન નક્કી કરવા માટે નિયમિત સિક્વન્સિંગ પહેલાં ડીએનએની બાયસલ્ફાઇટ સારવારનો ઉપયોગ છે. ડીએનએ મિથાઇલેશન એ પ્રથમ શોધાયેલ એપિજેનેટિક ચિહ્ન હતું, અને તે સૌથી વધુ અભ્યાસ કરાયેલ છે. પ્રાણીઓમાં તે મુખ્યત્વે ડાયન્યુક્લિયોટાઇડ સી. પી. જી. ના સાયટોસિન અવશેષોની કાર્બન-5 સ્થિતિમાં મિથાઈલ જૂથનો ઉમેરો કરે છે, અને ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ પ્રવૃત્તિના દમનમાં સામેલ છે. બાયસલ્ફાઇટ સાથે ડીએનએની સારવાર સાયટોસિન અવશેષોને યુરેસિલમાં રૂપાંતરિત કરે છે, પરંતુ 5-મિથાઈલસાયટોસિન અવશેષોને અસર થતી નથી. તેથી, બાયસલ્ફાઇટ સાથે સારવાર કરાયેલ ડીએનએ માત્ર મિથાઇલેટેડ સાયટોસિનને જાળવી રાખે છે. આમ, બાયસલ્ફાઇટ સારવાર ડીએનએ અનુક્રમમાં ચોક્કસ ફેરફારો રજૂ કરે છે જે વ્યક્તિગત સાયટોસિન અવશેષોની મિથાઇલેશન સ્થિતિ પર આધાર રાખે છે, જે ડીએનએના સેગમેન્ટની મિથાઇલેશન સ્થિતિ વિશે સિંગલ-ન્યુક્લિયોટાઇડ રિઝોલ્યુશન માહિતી આપે છે. આ માહિતીને પુનઃપ્રાપ્ત કરવા માટે બદલાયેલા ક્રમ પર વિવિધ વિશ્લેષણ કરી શકાય છે. તેથી આ વિશ્લેષણનો ઉદ્દેશ બાયસલ્ફાઇટ રૂપાંતરણ (આકૃતિ 1) ના પરિણામે સિંગલ ન્યુક્લિયોટાઇડ પોલીમોર્ફિઝમ્સ (સાયટોસિન્સ અને થાઇમિડીન) વચ્ચે તફાવત કરવા માટે ઘટાડવામાં આવે છે. પદ્ધતિઓ બિસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ સી. પી. જી. ડિન્યુક્લિયોટાઇડ્સ પર મિથાઇલેશનની સ્થિતિ નક્કી કરવા માટે બિસલ્ફાઇટ-સારવાર કરાયેલ જીનોમિક ડીએનએ પર નિયમિત સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિઓ લાગુ કરે છે. અન્ય બિન-અનુક્રમ વ્યૂહરચનાઓનો ઉપયોગ ચોક્કસ સ્થાન પર અથવા જીનોમ-વ્યાપી સ્તરે મિથાઇલેશનની પૂછપરછ કરવા માટે પણ કરવામાં આવે છે. તમામ વ્યૂહરચનાઓ ધારે છે કે બાયસલ્ફાઇટ-પ્રેરિત રીતે અનમિથાઇલેટેડ સાયટોસિનનું યુરેસિલમાં રૂપાંતર પૂર્ણ થયું છે, અને આ પછીની તમામ તકનીકોના આધાર તરીકે કામ કરે છે. આદર્શ રીતે, ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ દરેક એલીલ માટે અલગથી મિથાઇલેશનની સ્થિતિ નક્કી કરશે. બાયસલ્ફાઇટ અનુક્રમણિકાની વૈકલ્પિક પદ્ધતિઓમાં સંયુક્ત બાયસલ્ફાઇટ પ્રતિબંધ વિશ્લેષણ અને મિથાઇલેટેડ ડીએનએ ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન (એમ. ડી. આઈ. પી.) નો સમાવેશ થાય છે. બાયસલ્ફાઇટ-સારવારવાળા ડીએનએનું વિશ્લેષણ કરવાની પદ્ધતિઓ સતત વિકસાવવામાં આવી રહી છે. આ ઝડપથી વિકસતી પદ્ધતિઓનો સારાંશ આપવા માટે, અસંખ્ય સમીક્ષા લેખો લખવામાં આવ્યા છે. પદ્ધતિઓને સામાન્ય રીતે મિથાઇલેશન-વિશિષ્ટ પી. સી. આર. (એમ. એસ. પી.) (આકૃતિ 4) પર આધારિત વ્યૂહરચનાઓમાં વિભાજિત કરી શકાય છે, અને બિન-મિથાઇલેશન-વિશિષ્ટ પરિસ્થિતિઓ (આકૃતિ 3) હેઠળ કરવામાં આવતી પોલિમરેઝ સાંકળ પ્રતિક્રિયા (પી. સી. આર.) નો ઉપયોગ કરતી વ્યૂહરચનાઓ. માઇક્રોએરે-આધારિત પદ્ધતિઓ બિન-મિથાઈલેશન-વિશિષ્ટ પરિસ્થિતિઓના આધારે પણ પી. સી. આર. નો ઉપયોગ કરે છે. નોન-મિથાઇલેશન-સ્પેસિફિક પી. સી. આર. આધારિત પદ્ધતિઓ ડાયરેક્ટ સિક્વન્સિંગ બાયસલ્ફાઇટ-ટ્રીટેડ ડી. એન. એ. નો ઉપયોગ કરીને મિથાઇલેશન વિશ્લેષણની પ્રથમ અહેવાલ પદ્ધતિમાં પી. સી. આર. અને સ્ટાન્ડર્ડ ડાઇડિઓક્સિન્યુક્લિયોટાઇડ ડી. એન. એ. સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ બાયસલ્ફાઇટ રૂપાંતરણ માટે પ્રતિરોધક ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને સીધા નક્કી કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. પ્રાઈમર્સ સ્ટ્રેન્ડ-વિશિષ્ટ તેમજ બાયસલ્ફાઇટ-વિશિષ્ટ (એટલે કે, બિન-સી. પી. જી. સાયટોસિન ધરાવતા પ્રાઈમર્સ જેમ કે તેઓ બિન-બાયસલ્ફાઇટ-સારવારવાળા ડી. એન. એ. ના પૂરક નથી), ફ્લેન્કિંગ (પરંતુ સામેલ નથી) રસના મિથાઇલેશન સાઇટ માટે રચાયેલ છે. તેથી, તે મિથાઇલેશન-વિશિષ્ટ પી. સી. આર. થી વિપરીત, મિથાઇલેટેડ અને અનમિથાઇલેટેડ બંને સિક્વન્સને વિસ્તૃત કરશે. અનમિથાઇલેટેડ સાયટોસિનની તમામ સાઇટો સેન્સ સ્ટ્રાન્ડના પરિણામી વિસ્તૃત અનુક્રમમાં થાઇમિન તરીકે અને વિસ્તૃત એન્ટિસેન્સ સ્ટ્રાન્ડમાં એડેનિન તરીકે પ્રદર્શિત થાય છે. પી. સી. આર. પ્રાઇમરમાં ઉચ્ચ થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ એડેપ્ટરોનો સમાવેશ કરીને, પી. સી. આર. ઉત્પાદનોને મોટા પાયે સમાંતર સિક્વન્સિંગ સાથે અનુક્રમિત કરી શકાય છે. વૈકલ્પિક રીતે, અને શ્રમ-સઘન, પી. સી. આર. ઉત્પાદનને ક્લોન અને અનુક્રમિત કરી શકાય છે. અનુક્રમણિકા માટે ઉત્પાદનને વધારવા માટે નેસ્ટેડ પી. સી. આર. પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. બાયસલ્ફાઇટ-ટ્રીટેડ ડીએનએનો ઉપયોગ કરીને પછીની તમામ ડીએનએ મિથાઇલેશન વિશ્લેષણ તકનીકો ફ્રોમેર એટ અલના આ અહેવાલ પર આધારિત છે. (આકૃતિ 2). મોટાભાગની અન્ય પદ્ધતિઓ સાચી અનુક્રમણિકા-આધારિત તકનીકો નથી, તેમ છતાં "બાયસલ્ફાઇટ અનુક્રમણિકા" શબ્દનો ઉપયોગ સામાન્ય રીતે બાયસલ્ફાઇટ-રૂપાંતર ડીએનએ મિથાઇલેશન વિશ્લેષણ તકનીકોનું વર્ણન કરવા માટે થાય છે. પાયરોસીક્વેન્સિંગ પાયરોસીક્વેન્સિંગનો ઉપયોગ મિથાઇલેશન-વિશિષ્ટ પી. સી. આર. નો ઉપયોગ કર્યા વિના બાયસલ્ફાઇટ-સારવારવાળા ડી. એન. એ. નું વિશ્લેષણ કરવા માટે પણ થાય છે. રસના પ્રદેશના પી. સી. આર. વિસ્તરણ પછી, આ પ્રદેશમાં ચોક્કસ સી. પી. જી. સ્થળોની બાયસલ્ફાઇટ-રૂપાંતરિત શ્રેણી નક્કી કરવા માટે પાયરોસીક્વેન્સિંગનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. વ્યક્તિગત સ્થળો પર સી-ટુ-ટીનો ગુણોત્તર ક્રમ વિસ્તરણ દરમિયાન સી અને ટીના સમાવેશની માત્રાના આધારે માત્રાત્મક રીતે નક્કી કરી શકાય છે. આ પદ્ધતિની મુખ્ય મર્યાદા ટેકનોલોજીની કિંમત છે. જો કે, પાયરોસીક્વેન્સિંગ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સ્ક્રીનીંગ પદ્ધતિઓના વિસ્તરણ માટે સારી રીતે પરવાનગી આપે છે. વોંગ એટ અલ દ્વારા વર્ણવવામાં આવેલી આ તકનીકનો એક પ્રકાર એલીલ-વિશિષ્ટ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરે છે જે સિક્વન્સિંગ પ્રાઈમરના ક્રમમાં સિંગલ-ન્યુક્લિયોટાઇડ પોલીમોર્ફિઝમ્સને સામેલ કરે છે, આમ માતૃ અને પૈતૃક એલીલ્સનું અલગ વિશ્લેષણ કરવાની મંજૂરી આપે છે. આ તકનીક જીનોમિક છાપ વિશ્લેષણ માટે ખાસ ઉપયોગી છે. મિથાઇલેશન-સેન્સિટિવ સિંગલ-સ્ટ્રાન્ડ કન્ફોર્મેશન એનાલિસિસ (એમએસ-એસ. એસ. સી. એ.) આ પદ્ધતિ સિંગલ-સ્ટ્રાન્ડ કન્ફોર્મેશન પોલીમોર્ફિઝમ એનાલિસિસ (એસ. એસ. સી. એ.) પદ્ધતિ પર આધારિત છે જે સિંગલ-ન્યુક્લિયોટાઇડ પોલીમોર્ફિઝમ (એસ. એન. પી.) વિશ્લેષણ માટે વિકસાવવામાં આવી છે. એસ. એસ. સી. એ. બિન-અસંતૃપ્ત ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસમાં વિભેદક સ્થળાંતરના આધારે સમાન કદના પરંતુ અલગ ક્રમના સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટુકડાઓ વચ્ચે તફાવત કરે છે. એમ. એસ.-એસ. એસ. સી. એ. માં, આનો ઉપયોગ બાયસલ્ફાઇટ-સારવાર, પી. સી. આર.-વિસ્તૃત વિસ્તારો કે જેમાં રસ ધરાવતી સી. પી. જી. સાઇટ્સ વચ્ચે તફાવત કરવા માટે થાય છે. જ્યારે માત્ર એક જ ન્યુક્લિયોટાઇડ તફાવત હાજર હોય ત્યારે એસ. એસ. સી. એ. માં સંવેદનશીલતાનો અભાવ હોય છે, તેમ છતાં બાયસલ્ફાઇટ સારવાર વારંવાર રસના મોટાભાગના વિસ્તારોમાં સંખ્યાબંધ સી-ટુ-ટી રૂપાંતરણો કરે છે, અને પરિણામી સંવેદનશીલતા 100% સુધી પહોંચે છે. એમએસ-એસ. એસ. સી. એ. બેન્ડની તીવ્રતાના ગુણોત્તરના આધારે ડીએનએ મિથાઇલેશનની માત્રાનું અર્ધ-માત્રાત્મક વિશ્લેષણ પણ પ્રદાન કરે છે. જો કે, આ પદ્ધતિ વ્યક્તિગત મિથાઇલેશન સાઇટ્સને બદલે રસના ક્ષેત્રમાં સમગ્ર રીતે તમામ સી. પી. જી. સાઇટ્સનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે રચાયેલ છે. ઉચ્ચ રીઝોલ્યુશન ગલન વિશ્લેષણ (એચ. આર. એમ.) બિનપરિવર્તિત બાયસલ્ફાઇટ-ઉપચારિત ડી. એન. એ. થી રૂપાંતરિતને અલગ પાડવાની વધુ એક પદ્ધતિ ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન ગલન વિશ્લેષણ (એચ. આર. એમ.) નો ઉપયોગ કરે છે, જે શરૂઆતમાં એસ. એન. પી. ને અલગ પાડવા માટે રચાયેલ માત્રાત્મક પી. સી. આર. આધારિત તકનીક છે. પી. સી. આર. એમ્પ્લિકોનનું તાપમાનમાં વધારો કરીને સીધું વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે અને પીગળતી વખતે ઇન્ટરકલેટિંગ ફ્લોરોસન્ટ રંગની મુક્તિ થાય છે. મિથાઇલેશનની માત્રા, જેમ કે એમ્પ્લિકનમાં સી-ટુ-ટી સામગ્રી દ્વારા રજૂ થાય છે, તે ગલનની ઝડપ અને પરિણામે રંગના પ્રકાશનને નિર્ધારિત કરે છે. આ પદ્ધતિ સિંગલ-ટ્યુબ પરીક્ષણમાં સીધી માત્રાને મંજૂરી આપે છે, પરંતુ ચોક્કસ સી. પી. જી. સાઇટ્સને બદલે સમગ્ર વિસ્તૃત પ્રદેશમાં મિથાઇલેશનનું મૂલ્યાંકન કરે છે. મિથાઇલેશન-સેન્સિટિવ સિંગલ-ન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રાઇમર એક્સ્ટેંશન (એમ. એસ.-એસ. એન. યુ. પી. ઈ.) એમ. એસ.-એસ. એન. યુ. પી. ઈ. શરૂઆતમાં સિંગલ-ન્યુક્લિયોટાઇડ પોલીમોર્ફિઝમ્સનું વિશ્લેષણ કરવા માટે રચાયેલ પ્રાઇમર એક્સ્ટેંશન પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરે છે. ડીએનએ બાયસલ્ફાઇટ-રૂપાંતરિત હોય છે, અને બાયસલ્ફાઇટ-વિશિષ્ટ પ્રાઇમરને રસના સી. પી. જી. પહેલાં તરત જ બેઝ જોડી સુધીના ક્રમમાં એનેલ કરવામાં આવે છે. પ્રાઇમરને ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરીને સી (અથવા ટી) માં એક આધાર જોડીને વિસ્તૃત કરવાની મંજૂરી આપવામાં આવે છે જે ડાઇડિઓક્સિન્યુક્લિયોટાઇડ્સને સમાપ્ત કરે છે, અને સી થી ટીનો ગુણોત્તર માત્રાત્મક રીતે નક્કી કરવામાં આવે છે. આ C: T ગુણોત્તર નક્કી કરવા માટે સંખ્યાબંધ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. શરૂઆતમાં, એમ. એસ.-એસ. એન. યુ. પી. ઈ. એ પ્રાઇમર એક્સ્ટેંશનના રિપોર્ટર તરીકે કિરણોત્સર્ગી ડી. ડી. એન. ટી. પી. પર આધાર રાખ્યો હતો. ફ્લોરોસન્સ-આધારિત પદ્ધતિઓ અથવા પાયરોસીક્વેન્સિંગનો પણ ઉપયોગ કરી શકાય છે. જો કે, મેટ્રિક્સ-આસિસ્ટેડ લેસર ડિસોર્પ્શન આયનીકરણ/ટાઇમ-ઓફ-ફ્લાઇટ (MALDI-TOF) માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી વિશ્લેષણનો ઉપયોગ બે પોલીમોર્ફિક પ્રાઇમર એક્સ્ટેંશન પ્રોડક્ટ્સ વચ્ચે તફાવત કરવા માટે, સારમાં, SNP જીનોટાઇપિંગ માટે રચાયેલ ગુડ એસેના આધારે કરી શકાય છે. આયન જોડી રિવર્સ-ફેઝ હાઇ-પર્ફોર્મન્સ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી (આઇ. પી.-આર. પી.-એચ. પી. એલ. સી.) નો ઉપયોગ પ્રાઇમર એક્સ્ટેંશન પ્રોડક્ટ્સને અલગ પાડવા માટે પણ કરવામાં આવ્યો છે. બેઝ-સ્પેસિફિક ક્લેવેજ/માલ્ડી-ટીઓએફ એ તાજેતરમાં એહરિચ એટ અલ દ્વારા વર્ણવવામાં આવેલી પદ્ધતિ છે. આગળ ન્યુક્લિયોટાઇડ ફેરફારોમાંથી મેળવેલી માહિતીને વધારવા માટે બેઝ-વિશિષ્ટ ક્લેવેજ પગલું ઉમેરીને બાયસલ્ફાઇટ-રૂપાંતરણનો લાભ લે છે. પ્રથમ આરએનએમાં રસના ક્ષેત્રના ઈન વિટ્રો ટ્રાન્સક્રિપ્શનનો ઉપયોગ કરીને (પ્રારંભિક એમ્પ્લીફિકેશનમાં પીસીઆર પ્રાઇમરમાં આરએનએ પોલિમરેઝ પ્રમોટર સાઇટ ઉમેરીને), આરએનએઝ એનો ઉપયોગ બેઝ-સ્પેસિફિક સાઇટ્સ પર આરએનએ ટ્રાન્સક્રિપ્ટને તોડવા માટે કરી શકાય છે. જેમ કે આર. એન. એ. ખાસ કરીને સાયટોસિન અને યુરાસિલ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ પર આર. એન. એ. ને વિભાજિત કરે છે, જ્યારે સાયટોસિન-વિશિષ્ટ (સી-વિશિષ્ટ) ક્લેવેજ ઇચ્છિત હોય ત્યારે ક્લેવેજ-પ્રતિરોધક ડી. ટી. ટી. પી. નો સમાવેશ કરીને અને જ્યારે યુરાસિલ-વિશિષ્ટ (યુ-વિશિષ્ટ) ક્લેવેજ ઇચ્છિત હોય ત્યારે ડી. સી. ટી. પી. નો સમાવેશ કરીને આધાર-વિશિષ્ટતા પ્રાપ્ત થાય છે. પછી કપાયેલા ટુકડાઓનું માલ્ડી-ટીઓએફ દ્વારા વિશ્લેષણ કરી શકાય છે. બાયસલ્ફાઇટ સારવારના પરિણામે સી-ટુ-યુ રૂપાંતરણો દ્વારા ક્લેવેજ સાઇટ્સની રજૂઆત/દૂર કરવામાં આવે છે અથવા વિસ્તૃત રિવર્સ સ્ટ્રાન્ડમાં જી-ટુ-એ રૂપાંતરણો દ્વારા ટુકડાના જથ્થામાં પરિવર્તન થાય છે. સી-વિશિષ્ટ ક્લેવેજ ખાસ કરીને તમામ મિથાઇલેટેડ સી. પી. જી. સાઇટ્સ પર કાપશે. પરિણામી ટુકડાઓના કદનું વિશ્લેષણ કરીને, સમગ્ર પ્રદેશના મિથાઇલેશનની હદ નક્કી કરવાને બદલે, પ્રદેશની અંદર CpG સાઇટ્સના DNA મિથાઇલેશનની ચોક્કસ પેટર્ન નક્કી કરવી શક્ય છે. આ પદ્ધતિએ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સ્ક્રિનિંગ માટે અસરકારકતા દર્શાવી હતી, જે ખર્ચ-કાર્યક્ષમ રીતે બહુવિધ પેશીઓમાં અસંખ્ય સી. પી. જી. સાઇટ્સની પૂછપરછ માટે પરવાનગી આપે છે. મિથાઇલેશન-વિશિષ્ટ પી. સી. આર. (એમ. એસ. પી.) મિથાઇલેશન વિશ્લેષણની આ વૈકલ્પિક પદ્ધતિ બાયસલ્ફાઇટ-સારવારવાળા ડી. એન. એ. નો પણ ઉપયોગ કરે છે પરંતુ રસના વિસ્તારને અનુક્રમિત કરવાની જરૂરિયાતને ટાળે છે. તેના બદલે, પ્રાઇમર જોડીઓ માત્ર બિનપરિવર્તિત 5-મિથાઈલસાયટોસિનને પૂરક અનુક્રમોનો સમાવેશ કરીને "મિથાઈલેટેડ-વિશિષ્ટ" તરીકે ડિઝાઇન કરવામાં આવે છે, અથવા, ઊલટું, "અનમીથાઈલેટેડ-વિશિષ્ટ", અનમીથાઈલેટેડ સાયટોસિનમાંથી રૂપાંતરિત થાયમિનને પૂરક બનાવે છે. મિથાઇલેશન એ એમ્પ્લીફિકેશન હાંસલ કરવા માટે ચોક્કસ પ્રાઇમરની ક્ષમતા દ્વારા નક્કી થાય છે. આ પદ્ધતિ ખાસ કરીને ઉચ્ચ મિથાઇલેશન ઘનતા ધરાવતા સી. પી. જી. ટાપુઓની પૂછપરછ કરવા માટે ઉપયોગી છે, કારણ કે પ્રાઇમરમાં સી. પી. જી. જોડીઓની વધતી સંખ્યા પરીક્ષણની વિશિષ્ટતામાં વધારો કરે છે. સી. પી. જી. જોડીને પ્રાઇમરના 3 '-છેડે મૂકવાથી પણ સંવેદનશીલતામાં સુધારો થાય છે. એમ. એસ. પી. નો ઉપયોગ કરતા પ્રારંભિક અહેવાલમાં 0.1 ટકા એલીલ્સનું મિથાઇલેશન શોધવા માટે પૂરતી સંવેદનશીલતા વર્ણવવામાં આવી છે. સામાન્ય રીતે, કોઈ ચોક્કસ સ્થાન પર મિથાઇલેશનની સ્થિતિની પૂછપરછ કરતી વખતે એમ. એસ. પી. અને તેના સંબંધિત પ્રોટોકોલને સૌથી સંવેદનશીલ માનવામાં આવે છે. મેથિલાઇટ પદ્ધતિ એમ. એસ. પી. પર આધારિત છે, પરંતુ માત્રાત્મક પી. સી. આર. નો ઉપયોગ કરીને માત્રાત્મક વિશ્લેષણ પ્રદાન કરે છે. મિથાઇલેટેડ-વિશિષ્ટ પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, અને મિથાઇલેટેડ-વિશિષ્ટ ફ્લોરોસન્સ રિપોર્ટર પ્રોબનો પણ ઉપયોગ કરવામાં આવે છે જે વિસ્તૃત પ્રદેશમાં ફેલાય છે. વૈકલ્પિક રીતે, જો સંકળાયેલ ક્રમમાં CpG જોડીઓ વચ્ચે ભેદભાવની જરૂર હોય તો પ્રાઈમર્સ અથવા પ્રોબને મિથાઇલેશન વિશિષ્ટતા વિના ડિઝાઇન કરી શકાય છે. પરિમાણ મિથાઇલેટેડ સંદર્ભ ડીએનએના સંદર્ભમાં કરવામાં આવે છે. સફળતાપૂર્વક બાયસલ્ફાઇટ-રૂપાંતરિત ડીએનએ (કોનલાઇટ-એમએસપી) માટે પીસીઆરની વિશિષ્ટતા વધારવા માટે આ પ્રોટોકોલમાં ફેરફાર આ બિન-વિશિષ્ટ વિસ્તરણને માપવા માટે બાયસલ્ફાઇટ-અપરિવર્તિત ડીએનએ માટે વધારાની તપાસનો ઉપયોગ કરે છે. એમએસપી-એમ્પ્લિફાઇડ ડીએનએનો ઉપયોગ કરીને આગળની પદ્ધતિ મેલ્ટિંગ કર્વ એનાલિસિસ (મેક-એમએસપી) નો ઉપયોગ કરીને ઉત્પાદનોનું વિશ્લેષણ કરે છે. આ પદ્ધતિ મિથાઇલેટેડ-વિશિષ્ટ અને અનમિથાઇલેટેડ-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર બંને સાથે બાયસલ્ફાઇટ-રૂપાંતરિત ડીએનએને વિસ્તૃત કરે છે, અને ગલન વળાંક વિશ્લેષણમાં પેદા થયેલા વિભેદક શિખરોની તુલના કરીને બે ઉત્પાદનોના માત્રાત્મક ગુણોત્તરને નિર્ધારિત કરે છે. ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન ગલન વિશ્લેષણ પદ્ધતિ કે જે માત્રાત્મક પી. સી. આર. અને ગલન વિશ્લેષણ બંનેનો ઉપયોગ કરે છે, ખાસ કરીને, નિમ્ન-સ્તરના મિથાઇલેશનની સંવેદનશીલ તપાસ માટે માઇક્રોએરે-આધારિત પદ્ધતિઓ માઇક્રોએરે-આધારિત પદ્ધતિઓ બાયસલ્ફાઇટ-સારવારવાળા ડી. એન. એ. નું વિશ્લેષણ કરવા માટે ઉપલબ્ધ તકનીકોનું તાર્કિક વિસ્તરણ છે. ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ માઇક્રોએરેની રચના ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ સંકરણ તપાસની જોડીનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી છે જે CpG સાઇટ્સને લક્ષ્યાંક બનાવે છે. એક અપરિવર્તિત મિથાઇલેટેડ ક્રમ માટે પૂરક છે, અને બીજો સી-ટુ-યુ-રૂપાંતરિત અનમિથાઇલેટેડ ક્રમ માટે પૂરક છે. બાયસલ્ફાઇટ દ્વારા અપૂર્ણ રીતે રૂપાંતરિત ડીએનએ સાથે બંધનને રોકવા માટે તપાસ પણ બાયસલ્ફાઇટ-વિશિષ્ટ છે. ઇલ્યુમિના મિથાઇલેશન એસે એ એક એવું પરીક્ષણ છે જે જીનોમ-વાઇડ મિથાઇલેશન ડેટા પેદા કરવા માટે માઇક્રોએરે સ્તર પર બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ તકનીકને લાગુ કરે છે. મર્યાદાઓ 5-હાઇડ્રોક્સિમિથાઇલસાયટોસિન બિસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ સસ્તન પ્રાણીઓના જીનોમમાં વ્યાપકપણે થાય છે, જો કે નવા સસ્તન પ્રાણીઓના ડીએનએમાં ફેરફાર 5-હાઇડ્રોક્સિમિથાઇલસાયટોસિનની શોધ સાથે ગૂંચવણો ઊભી થઈ છે. 5-હાઈડ્રોક્સિમિથાઇલસાયટોસિન બાયસલ્ફાઇટ સારવાર પર સાયટોસિન-5-મિથાઈલસલ્ફોનેટમાં રૂપાંતરિત થાય છે, જે પછી જ્યારે અનુક્રમિત થાય ત્યારે સી તરીકે વાંચે છે. તેથી, બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ 5-મિથાઈલસાયટોસિન અને 5-હાઈડ્રોક્સિમિથાઈલસાયટોસિન વચ્ચે ભેદભાવ કરી શકતું નથી. આનો અર્થ એ છે કે બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગમાંથી ઉત્પાદનને હવે માત્ર ડીએનએ મિથાઇલેશન તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરી શકાતું નથી, કારણ કે તે 5-મિથાઈલસાયટોસિન અને 5-હાઈડ્રોક્સિમિથાઈલસાયટોસિનનું મિશ્રણ છે. શિકાગો યુનિવર્સિટી ખાતે ચુઆન હે દ્વારા ટેટ-સહાયિત ઓક્સિડેટીવ બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગનો વિકાસ હવે સિંગલ બેઝ રિઝોલ્યુશન પર બે ફેરફારો વચ્ચે તફાવત કરવામાં સક્ષમ છે. અપૂર્ણ રૂપાંતરણ બિસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ દરેક એક અનમિથાઇલેટેડ સાયટોસિન અવશેષને યુરેસિલમાં રૂપાંતરિત કરવા પર આધાર રાખે છે. જો રૂપાંતર અપૂર્ણ હોય, તો પછીનું વિશ્લેષણ બિનપરિવર્તિત અનમિથાઇલેટેડ સાયટોસિન્સને ખોટી રીતે મિથાઇલેટેડ સાયટોસિન્સ તરીકે અર્થઘટન કરશે, પરિણામે મિથાઇલેશન માટે ખોટા હકારાત્મક પરિણામો મળશે. સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએમાં માત્ર સાયટોસિન બાયસલ્ફાઇટ દ્વારા હુમલો કરવા માટે સંવેદનશીલ હોય છે, તેથી વિશ્લેષણ હેઠળ રહેલા ડીએનએનું વિકૃતીકરણ મહત્વપૂર્ણ છે. તે સુનિશ્ચિત કરવું મહત્વપૂર્ણ છે કે તાપમાન અને મીઠાની સાંદ્રતા જેવા પ્રતિક્રિયા પરિમાણો ડીએનએને સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ રચનામાં જાળવવા માટે યોગ્ય છે અને સંપૂર્ણ રૂપાંતર માટે પરવાનગી આપે છે. એગરોઝ જેલમાં ડીએનએને જડિત કરવાથી ડીએનએના તારને શારીરિક રીતે અલગ રાખીને રૂપાંતરના દરમાં સુધારો થયો હોવાનું નોંધવામાં આવ્યું છે. અપૂર્ણ રૂપાંતરણ દરનો અંદાજ લગાવી શકાય છે અને ગોઠવી શકાય છે-જેમ કે લેમ્બડા ફેજ ડીએનએ (જે અનમિથાઇલેટેડ તરીકે ઓળખાય છે) જેવા અનુક્રમણિકા પુસ્તકાલયમાં આંતરિક નિયંત્રણનો સમાવેશ કરીને અથવા ક્લોરોપ્લાસ્ટ જીનોમ જેવા જીવતંત્રમાં જાણીતા અનમિથાઇલેટેડ પ્રદેશમાં બાયસલ્ફાઇટ અનુક્રમણિકા રીડ્સને સંરેખિત કરીને. બાયસલ્ફાઇટ સારવાર દરમિયાન ડીએનએનું અધઃપતન બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગમાં એક મોટો પડકાર એ ડીએનએનું અધઃપતન છે જે રૂપાંતર સાથે એક સાથે થાય છે. સંપૂર્ણ રૂપાંતરણ માટે જરૂરી પરિસ્થિતિઓ, જેમ કે લાંબા સેવનનો સમય, ઊંચું તાપમાન અને ઉચ્ચ બાયસલ્ફાઇટ સાંદ્રતા, ઇન્ક્યુબેટેડ ડીએનએના લગભગ 90 ટકાના અધઃપતન તરફ દોરી શકે છે. ડીએનએની પ્રારંભિક માત્રા ઘણીવાર મર્યાદિત હોય છે તે જોતાં, આવા વ્યાપક અધઃપતન સમસ્યારૂપ બની શકે છે. અધોગતિ એ ડેપ્યુરિનેશન તરીકે થાય છે જેના પરિણામે રેન્ડમ સ્ટ્રાન્ડ તૂટી જાય છે. તેથી, ઇચ્છિત પી. સી. આર. એમ્પ્લિકન જેટલું લાંબું હશે, અખંડ નમૂના અણુઓની સંખ્યા તેટલી મર્યાદિત હશે. આ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનની નિષ્ફળતા તરફ દોરી શકે છે, અથવા નમૂનાના અણુઓના મર્યાદિત નમૂનાના પરિણામે મિથાઇલેશન સ્તરો પર માત્રાત્મક રીતે સચોટ માહિતીની ખોટ થઈ શકે છે. આમ, કાર્યરત પ્રતિક્રિયાની પરિસ્થિતિઓના પરિણામે ડીએનએના અધઃપતનની માત્રાનું મૂલ્યાંકન કરવું અને આ ઇચ્છિત એમ્પ્લિકનને કેવી અસર કરશે તે ધ્યાનમાં લેવું મહત્વપૂર્ણ છે. ડીએનએના અધઃપતનને ઘટાડવા માટે પણ તકનીકોનો ઉપયોગ કરી શકાય છે, જેમ કે સેવન તાપમાનને સાયકલ ચલાવવું. 2020માં, ન્યૂ ઇંગ્લેન્ડ બાયોલેબ્સે એન. ઇ. બી. નેક્સ્ટ એન્ઝાઇમેટિક મિથાઈલ-સેક વિકસાવ્યું હતું, જે ડીએનએના નુકસાનને ઘટાડવા માટે વૈકલ્પિક એન્ઝાઇમેટિક અભિગમ છે. અન્ય ચિંતાઓ બાયસલ્ફાઇટ સારવાર પછીની સંભવિત નોંધપાત્ર સમસ્યા દ્રાવણના અપૂરતા આલ્કલાઇઝેશનને કારણે પાયરિમિડીન અવશેષોનું અપૂર્ણ ડિસલ્ફોનેશન છે. આ કેટલાક ડીએનએ પોલિમરેઝને અટકાવી શકે છે, જે પછીના પી. સી. આર. ને મુશ્કેલ બનાવે છે. જો કે, ડિસલ્ફોનેશન પૂર્ણ થશે તેની ખાતરી કરવા માટે દ્રાવણના પીએચ પર દેખરેખ રાખીને આ પરિસ્થિતિને ટાળી શકાય છે. અંતિમ ચિંતા એ છે કે બાયસલ્ફાઇટ સારવાર નમૂનામાં જટિલતાના સ્તરને મોટા પ્રમાણમાં ઘટાડે છે, જે જો બહુવિધ પી. સી. આર. પ્રતિક્રિયાઓ કરવામાં આવે તો સમસ્યારૂપ બની શકે છે (2006). પ્રાઇમર ડિઝાઇન વધુ મુશ્કેલ છે, અને અયોગ્ય ક્રોસ-સંકરણ વધુ વારંવાર થાય છે. એપ્લિકેશન્સઃ જીનોમ-વાઇડ મિથાઇલેશન એનાલિસિસ બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગમાં પ્રગતિથી તેમને જીનોમ-વાઇડ સ્કેલ પર લાગુ કરવાની સંભાવના તરફ દોરી ગઈ છે, જ્યાં, અગાઉ, ડીએનએ મિથાઇલેશનનું વૈશ્વિક માપ માત્ર અન્ય તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને શક્ય હતું, જેમ કે પ્રતિબંધ સીમાચિહ્ન જીનોમિક સ્કેનીંગ. માનવ એપિજેનોમના મેપિંગને ઘણા વૈજ્ઞાનિકો દ્વારા માનવ જીનોમ પ્રોજેક્ટ પૂર્ણ કરવા માટેના તાર્કિક અનુવર્તી તરીકે જોવામાં આવે છે. આનુવંશિક ક્રમનું કાર્ય કેવી રીતે અમલમાં મૂકવામાં આવે છે અને તેનું નિયમન કરવામાં આવે છે તે સમજવા માટે આ એપિજેનોમિક માહિતી મહત્વપૂર્ણ રહેશે. એપિજેનોમ જીનોમ કરતાં ઓછું સ્થિર હોવાથી, તે જનીન-પર્યાવરણની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં મહત્વપૂર્ણ માનવામાં આવે છે. એપિજેનોમિક મેપિંગ સ્વાભાવિક રીતે જિનોમ સિક્વન્સિંગ કરતાં વધુ જટિલ છે, જો કે, કારણ કે એપિજેનોમ જિનોમ કરતાં વધુ પરિવર્તનશીલ છે. વ્યક્તિનું એપિજેનોમ વય સાથે બદલાય છે, પેશીઓ વચ્ચે બદલાય છે, પર્યાવરણીય પરિબળો દ્વારા બદલાય છે અને રોગોમાં વિચલન દર્શાવે છે. જો કે, વિવિધ ઉંમર, પેશીઓના પ્રકારો અને રોગની સ્થિતિઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા આવા સમૃદ્ધ એપિજેનોમિક મેપિંગ, એપિજેનેટિક ગુણના સામાન્ય કાર્ય તેમજ વૃદ્ધત્વ અને રોગ તરફ દોરી જતી પદ્ધતિઓ વિશે મૂલ્યવાન માહિતી આપશે. એપિજેનોમિક મેપિંગના સીધા ફાયદાઓમાં ક્લોનિંગ ટેકનોલોજીમાં સંભવિત પ્રગતિનો સમાવેશ થાય છે. એવું માનવામાં આવે છે કે સામાન્ય સદ્ધરતા અને જીવનકાળ સાથે ક્લોન કરેલા પ્રાણીઓનું ઉત્પાદન કરવામાં નિષ્ફળતા એપિજેનેટિક ગુણની અયોગ્ય પેટર્નના પરિણામે થાય છે. ઉપરાંત, ઘણા કેન્સરમાં અસામાન્ય મિથાઇલેશન પેટર્ન સારી રીતે દર્શાવવામાં આવે છે. વૈશ્વિક હાયપોમિથાઇલેશનના પરિણામે જીનોમિક સ્થિરતામાં ઘટાડો થાય છે, જ્યારે ટ્યુમર સપ્રેસર જનીન પ્રમોટર્સનું સ્થાનિક હાયપરમિથાઇલેશન ઘણીવાર તેમના કાર્યના નુકસાન માટે જવાબદાર છે. મિથાઇલેશનની ચોક્કસ પેટર્ન ચોક્કસ કેન્સરના પ્રકારોનું સૂચક છે, પૂર્વસૂચન મૂલ્ય ધરાવે છે, અને સારવારના શ્રેષ્ઠ માર્ગને માર્ગદર્શન આપવામાં મદદ કરી શકે છે. વિશ્વભરમાં મોટા પાયે એપિજેનોમ મેપિંગના પ્રયાસો ચાલી રહ્યા છે અને હ્યુમન એપિજેનોમ પ્રોજેક્ટ હેઠળ તેનું આયોજન કરવામાં આવ્યું છે. આ બહુસ્તરીય વ્યૂહરચના પર આધારિત છે, જેમાં મર્યાદિત સંખ્યામાં સંદર્ભ એપિજેનોમ્સ માટે ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન મિથાઇલેશન રૂપરેખાઓ મેળવવા માટે બાયસલ્ફાઇટ અનુક્રમણિકાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, જ્યારે નમૂનાઓના વિશાળ વર્ણપટ પર ઓછું સંપૂર્ણ વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. આ અભિગમનો હેતુ આપેલ સંસાધનોમાંથી મેળવેલી આંતરદૃષ્ટિને મહત્તમ કરવાનો છે, કારણ કે ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન જીનોમ-વાઇડ મેપિંગ એક ખર્ચાળ ઉપક્રમ છે. જીન-સેટ વિશ્લેષણ (ઉદાહરણ તરીકે ડેવિડ અને ગોસેક જેવા સાધનોનો ઉપયોગ કરીને) ઉચ્ચ-થ્રુપુટ મિથાઇલેશન ડેટા (દા. ત. મિથાઇલેશન ડેટા) પર લાગુ કરવામાં આવે ત્યારે ગંભીર રીતે પક્ષપાતી હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે. જીનોમ-વાઇડ બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ); એવું સૂચવવામાં આવ્યું છે કે આને નમૂનાના લેબલ ક્રમચયો અથવા દરેક જનીનને લક્ષ્ય કરતી CpG ચકાસણીઓ/CpG સાઇટ્સની સંખ્યામાં તફાવતોને નિયંત્રિત કરવા માટે આંકડાકીય મોડેલનો ઉપયોગ કરીને સુધારી શકાય છે. ઓક્સિડેટિવ બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ 5-મિથાઈલસાયટોસિન અને 5-હાઈડ્રોક્સિમિથાઇલસાયટોસિન બંને બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગમાં સી તરીકે વાંચે છે. ઓક્સિડેટિવ બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ એ સિંગલ બેઝ રિઝોલ્યુશન પર 5-મિથાઈલસાયટોસિન અને 5-હાઇડ્રોક્સિમિથાઈલસાયટોસિન વચ્ચે ભેદ પાડવાની એક પદ્ધતિ છે. આ પદ્ધતિ 5-હાઇડ્રોક્સિમિથાઇલસાયટોસિનના 5-ફોર્મિલસાયટોસિનમાં ચોક્કસ (ટેટ-સહાયિત) રાસાયણિક ઓક્સિડેશનનો ઉપયોગ કરે છે, જે પછીથી બાયસલ્ફાઇટ સારવાર દરમિયાન યુરેસિલમાં રૂપાંતરિત થાય છે. એકમાત્ર આધાર જે પછી સી તરીકે વાંચે છે તે 5-મિથાઈલસાયટોસિન છે, જે ડીએનએ નમૂનામાં સાચા મિથાઇલેશન સ્થિતિનો નકશો આપે છે. બાયસલ્ફાઇટ અને ઓક્સિડેટીવ બાયસલ્ફાઇટ સિક્વન્સિંગ વચ્ચેના તફાવતને માપીને પણ 5-હાઇડ્રોક્સિમિથાઇલસાઇટોસિનના સ્તરનું પ્રમાણ નક્કી કરી શકાય છે. આ પણ જુઓ ઘટાડેલી રજૂઆત બાયસલ્ફાઇટ અનુક્રમણિકા સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ બાયસલ્ફાઇટ રૂપાંતરણ પ્રોટોકોલ હ્યુમન એપિજેનોમ પ્રોજેક્ટ (એચઇપી)-ડેટા-સેંગર ઇન્સ્ટિટ્યૂટ દ્વારા એપિજેનોમ નેટવર્ક ઓફ એક્સેલન્સ મોલેક્યુલર બાયોલોજી એપિજેનેટિક્સ જીનોમિક્સ તકનીકો