Reversed-phase chromatography
રિવર્સડ-ફેઝ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી (આર. પી.-એલ. સી.) એ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફીનો એક પ્રકાર છે જેમાં બિન-ધ્રુવીય સ્થિર તબક્કો અને ધ્રુવીય ગતિશીલ તબક્કાઓનો ઉપયોગ કાર્બનિક સંયોજનોને અલગ કરવા માટે થાય છે. તાજેતરના વર્ષોમાં હાઇ પર્ફોર્મન્સ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી-એચ. પી. એલ. સી. નો ઉપયોગ કરીને મોટાભાગના વિભાજન અને વિશ્લેષણ રિવર્સડ ફેઝ મોડનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે. રિવર્સડ ફેઝ મોડમાં, નમૂનાના ઘટકો સિસ્ટમમાં જાળવી રાખવામાં આવે છે, તેઓ જેટલા વધુ હાઇડ્રોફોબિક હોય છે. રિવર્સડ ફેઝ ક્રોમેટોગ્રાફિક સિસ્ટમમાં દ્રાવકોની જાળવણી અને વિભાજનને અસર કરતા પરિબળો નીચે મુજબ છેઃ a. સ્થિર તબક્કાની રાસાયણિક પ્રકૃતિ, એટલે કે, તેની સપાટી પર બંધાયેલા લિગાન્ડ્સ, તેમજ તેમની બંધન ઘનતા, એટલે કે તેમના આવરણની હદ. બી. ગતિશીલ તબક્કાની રચના. જથ્થાબંધ દ્રાવકોના પ્રકાર કે જેનું મિશ્રણ ગતિશીલ તબક્કાની ધ્રુવીયતાને અસર કરે છે, તેથી દ્રાવક માટેનું નામ સંશોધક ગતિશીલ તબક્કાની ધ્રુવીયતાને અસર કરવા માટે ઉમેરવામાં આવે છે. સી. ઉમેરણો, જેમ કે બફર, ગતિશીલ તબક્કાના પીએચને અસર કરે છે, જે દ્રાવકોની આયનીકરણ સ્થિતિ અને તેમની ધ્રુવીયતાને અસર કરે છે. મિશ્રણમાં કાર્બનિક ઘટકોને જાળવી રાખવા માટે, સ્તંભોમાં ભરેલા સ્થિર તબક્કાઓમાં હાઇડ્રોફોબિક સબસ્ટ્રેટ્સનો સમાવેશ થાય છે, જે વિવિધ ભૌમિતિક (ગોળાકાર, અનિયમિત) માં છિદ્રાળુ સિલિકા-જેલ કણોની સપાટી સાથે બંધાયેલા હોય છે, વિવિધ વ્યાસ (પેટા-2,3,5,7,10 યુએમ) પર, વિવિધ છિદ્ર વ્યાસ (60,100,150,300 એ) સાથે. કણોની સપાટી રાસાયણિક રીતે બંધાયેલા હાઇડ્રોકાર્બન દ્વારા આવરી લેવામાં આવે છે, જેમ કે C3, C4, C8, C18 અને વધુ. સ્થિર તબક્કા સાથે સંકળાયેલું હાઇડ્રોકાર્બન જેટલું લાંબું હશે, નમૂનાના ઘટકો તેટલા લાંબા સમય સુધી જાળવી રાખવામાં આવશે. કેટલાક સ્થિર તબક્કાઓ હાઇડ્રોફોબિક પોલિમરીક કણો અથવા સંકરણ સિલિકા-કાર્બનિક જૂથોના કણોથી પણ બનેલા હોય છે, જેમાં અત્યંત pH પર ગતિશીલ તબક્કાઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. બાયોમેડિકલ સામગ્રીને અલગ કરવાની મોટાભાગની વર્તમાન પદ્ધતિઓ સી-18 સ્તંભોનો ઉપયોગ કરે છે, જેને કેટલીકવાર વેપાર નામો દ્વારા ઓળખવામાં આવે છે, જેમ કે ઓડીએસ (ઓક્ટાડેસિલસિલેન) અથવા આરપી-18. ગતિશીલ તબક્કાઓ પાણી અને ધ્રુવીય કાર્બનિક દ્રાવકોનું મિશ્રણ છે, જેમાંથી મોટાભાગના મિથેનોલ અને એસિટોનિટ્રિલ છે. આ મિશ્રણમાં સામાન્ય રીતે વિવિધ ઉમેરણો હોય છે જેમ કે બફર (એસિટેટ, ફોસ્ફેટ, સાઇટ્રેટ), અને/અથવા સર્ફેક્ટન્ટ્સ (આલ્કાઈલ એમાઇન્સ અથવા આલ્કાઈલ સલ્ફોનેટ્સ) અને/અથવા વિશેષ ઉમેરણો (ઈડીટીએ). એક અથવા બીજા પ્રકારના પૂરવણીઓનો ઉપયોગ કરવાનો ધ્યેય કાર્યક્ષમતા અને/અથવા પસંદગીમાં વધારો કરવાનો અને દ્રાવણની જાળવણીને નિયંત્રિત કરવાનો છે. સ્થિર તબક્કાઓ મેજર, ડોલન, કાર અને સ્નાઇડર દ્વારા એક લેખમાં વિગતવાર વર્ણવેલ વિપરીત તબક્કાના સ્થિર તબક્કાઓનો ઇતિહાસ અને ઉત્ક્રાંતિ 1970 ના દાયકામાં, મોટાભાગના પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફી રન સ્થિર તબક્કાઓ તરીકે નક્કર કણોનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યા હતા, જે બિનપરિવર્તિત સિલિકા-જેલ અથવા એલ્યુમિનાથી બનેલા હતા. આ પ્રકારની તકનીકને હવે સામાન્ય તબક્કાની ક્રોમેટોગ્રાફી તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. આ તકનીકમાં સ્થિર તબક્કો હાઇડ્રોફિલિક હોવાથી, અને ગતિશીલ તબક્કો એ-ધ્રુવીય હોવાથી, જેમાં હેક્ઝેન અને હેપ્ટેન જેવા બિન-ધ્રુવીય કાર્બનિક દ્રાવકોનો સમાવેશ થતો હતો, નમૂનામાં હાઇડ્રોફિલિક ગુણધર્મો ધરાવતા બાયોમોલેક્યુલ્સ સ્થિર તબક્કા સાથે ઉચ્ચ આકર્ષણ ધરાવતા હતા, તેથી તેઓ તેને મજબૂત રીતે શોષી લે છે. વધુમાં, તેઓ ગતિશીલ તબક્કાના દ્રાવકોમાં સરળતાથી ઓગળ્યા ન હતા. તે જ સમયે હાઇડ્રોફોબિક અણુઓ ધ્રુવીય સ્થિર તબક્કા સાથે ઓછું આકર્ષણ અનુભવે છે, અને પૂરતી જાળવણી વિના તેમાંથી વહેલા પસાર થાય છે. આ જ કારણ હતું કે 1970ના દાયકા દરમિયાન સિલિકા આધારિત કણોને હાઇડ્રોકાર્બન સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી, તેમની સપાટી પર સ્થિર અથવા બંધાયેલા હતા, અને ગતિશીલ તબક્કાઓને બાયોમેડિકલ પદાર્થોને સમાવવા માટે જલીય અને ધ્રુવીય પ્રકૃતિમાં ફેરવવામાં આવ્યા હતા. હાઇડ્રોફોબિક સ્થિર તબક્કા અને ધ્રુવીય ગતિશીલ તબક્કાઓનો ઉપયોગ અનિવાર્યપણે સામાન્ય તબક્કાની ક્રોમેટોગ્રાફીથી વિપરીત છે, કારણ કે ગતિશીલ અને સ્થિર તબક્કાઓની ધ્રુવીયતા ઊંધી થઈ ગઈ છે-તેથી શબ્દ વિપરીત-તબક્કાની ક્રોમેટોગ્રાફી છે. પરિણામે, ધ્રુવીય ગતિશીલ તબક્કામાં હાઇડ્રોફોબિક પરમાણુઓ હાઇડ્રોફોબિક સ્થિર તબક્કામાં શોષાય છે, અને નમૂનામાં હાઇડ્રોફિલિક અણુઓ સ્તંભમાંથી પસાર થાય છે અને પહેલા બહાર નીકળે છે. કાર્બનિક (બિન-ધ્રુવીય) દ્રાવકનો ઉપયોગ કરીને ગતિશીલ તબક્કાની ધ્રુવીયતાને ઘટાડીને સ્તંભમાંથી હાઇડ્રોફોબિક અણુઓને દૂર કરી શકાય છે, જે હાઇડ્રોફોબિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને ઘટાડે છે. અણુ જેટલો વધુ હાઇડ્રોફોબિક હશે, તે સ્થિર તબક્કા સાથે વધુ મજબૂત રીતે જોડાઈ જશે અને પરમાણુને બહાર કાઢવા માટે જરૂરી કાર્બનિક દ્રાવકની સાંદ્રતા તેટલી વધારે હશે. ક્રોમેટોગ્રાફીના સિદ્ધાંતના ઘણા ગાણિતિક પરિમાણો અને અન્ય ક્રોમેટોગ્રાફિક પદ્ધતિઓમાં ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાયોગિક વિચારણાઓ આરપી-એલસીને પણ લાગુ પડે છે (ઉદાહરણ તરીકે, પસંદગી પરિબળ, ક્રોમેટોગ્રાફિક રીઝોલ્યુશન, પ્લેટ ગણતરી, વગેરે. તેનો ઉપયોગ વિવિધ પ્રકારના અણુઓને અલગ કરવા માટે થઈ શકે છે. તેનો ઉપયોગ સામાન્ય રીતે પ્રોટીનને અલગ કરવા માટે થાય છે, કારણ કે સામાન્ય તબક્કાની ક્રોમેટોગ્રાફીમાં ઉપયોગમાં લેવાતા કાર્બનિક દ્રાવકો ઘણા પ્રોટીનને વિકૃત કરી શકે છે. આજે, આર. પી.-એલ. સી. એ વારંવાર ઉપયોગમાં લેવાતી વિશ્લેષણાત્મક તકનીક છે. આર. પી.-એલ. સી. માં ઉપયોગ માટે સ્થિર તબક્કાઓની વિશાળ વિવિધતા ઉપલબ્ધ છે, જે અલગ કરવાની પદ્ધતિઓના વિકાસમાં ખૂબ જ લવચીકતાને મંજૂરી આપે છે. સિલિકા-આધારિત સ્થિર તબક્કાઓ સિલિકા જેલ કણો સામાન્ય રીતે ઉચ્ચ-પ્રદર્શન લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી (એચ. પી. એલ. સી.) માં ઘણા કારણોસર સ્થિર તબક્કા તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે, જેમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છેઃ ઉચ્ચ સપાટી વિસ્તારઃ સિલિકા જેલ કણોમાં ઉચ્ચ સપાટી વિસ્તાર હોય છે, જે દ્રાવકો સાથે સીધી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને મંજૂરી આપે છે અથવા નમૂનાના અણુઓ સાથે બહુમુખી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટે વિવિધ પ્રકારના લિગાન્ડ્સના બંધન પછી, વધુ સારા વિભાજન તરફ દોરી જાય છે. રાસાયણિક અને ઉષ્મીય સ્થિરતા અને જડતાઃ સિલિકા જેલ રાસાયણિક રીતે સ્થિર છે, કારણ કે તે સામાન્ય રીતે ગતિશીલ તબક્કાના દ્રાવકો અથવા સંયોજનોને અલગ કરીને પ્રતિક્રિયા આપતું નથી, પરિણામે સચોટ, પુનરાવર્તિત અને વિશ્વસનીય વિશ્લેષણ થાય છે. વ્યાપક ઉપયોગિતાઃ સિલિકા જેલ બહુમુખી છે અને તેને વિવિધ કાર્યાત્મક જૂથો સાથે સુધારી શકાય છે, જે તેને વિશ્લેષણ અને ઉપયોગોની વિશાળ શ્રેણી માટે યોગ્ય બનાવે છે. કાર્યક્ષમ વિભાજનઃ સિલિકા જેલ કણોના અનન્ય ગુણધર્મો, તેમના ઉચ્ચ સપાટી વિસ્તાર અને નિયંત્રિત સરેરાશ કણો વ્યાસના છિદ્રોના કદ સાથે જોડાઈને, એચ. પી. એલ. સી. માં સંયોજનોના કાર્યક્ષમ અને ચોક્કસ વિભાજનને સરળ બનાવે છે. પ્રજનનક્ષમતાઃ સિલિકા જેલના કણો ઉચ્ચ બેચ-ટુ-બેચ પ્રજનનક્ષમતા પ્રદાન કરી શકે છે, જે સમગ્ર દાયકાઓમાં સુસંગત અને વિશ્વસનીય એચ. પી. એલ. સી. વિશ્લેષણ માટે નિર્ણાયક છે. કણ વ્યાસ અને છિદ્ર કદ નિયંત્રણઃ સિલિકા જેલને ચોક્કસ છિદ્ર કદ માટે એન્જિનિયર્ડ કરી શકાય છે, જે પરમાણુ કદના આધારે વિભાજન પર ચોક્કસ નિયંત્રણને સક્ષમ કરે છે. ખર્ચ-અસરકારકઃ સિલિકા એ પૃથ્વી પર સૌથી વધુ વિપુલ તત્વ છે, તેથી તેની જેલ એચ. પી. એલ. સી. કાર્યક્રમો માટે ખર્ચ-અસરકારક પસંદગી છે, જે તેને પ્રયોગશાળાઓમાં વ્યાપકપણે અપનાવવામાં આવે છે. યુનાઇટેડ સ્ટેટ્સ ફાર્માકોપિયા (યુ. એસ. પી.) એ એચ. પી. એલ. સી. સ્તંભોને એલ #પ્રકારો દ્વારા વર્ગીકૃત કર્યા છે. આ વર્ગીકરણમાં સૌથી વધુ લોકપ્રિય સ્તંભ ઓક્ટાડેસિલ કાર્બન સાંકળ (સી 18)-બંધાયેલ સિલિકા (યુએસપી વર્ગીકરણ એલ 1) છે. આ પછી C8-બંધાયેલ સિલિકા (L7), શુદ્ધ સિલિકા (L3), સાયનો-બંધાયેલ સિલિકા (CN) (L10) અને ફિનાઇલ-બંધાયેલ સિલિકા (L11) આવે છે. નોંધ કરો કે C18, C8 અને ફિનાઇલ સમર્પિત રિવર્સ-ફેઝ સ્થિર તબક્કાઓ છે, જ્યારે CN સ્તંભોનો ઉપયોગ એનાલાઇટ અને મોબાઇલ તબક્કાની સ્થિતિના આધારે રિવર્સ-ફેઝ મોડમાં થઈ શકે છે. તમામ C18 સ્તંભો સમાન રીટેન્શન ગુણધર્મો ધરાવતા નથી. સિલિકાનું સપાટી પર કાર્યાત્મકકરણ મોનોમેરિક અથવા પોલિમરીક પ્રતિક્રિયામાં કરી શકાય છે, જેમાં બાકીના સિલાનોલ જૂથો (એન્ડ-કેપિંગ) ને આવરી લેવા માટે બીજા તબક્કામાં ઉપયોગમાં લેવાતા વિવિધ શોર્ટ-ચેઇન ઓર્ગેનોસિલેન્સનો ઉપયોગ થાય છે. જ્યારે એકંદર રીટેન્શન મિકેનિઝમ સમાન રહે છે, ત્યારે વિવિધ સ્થિર તબક્કાઓના સપાટીના રસાયણશાસ્ત્રમાં સૂક્ષ્મ તફાવતો પસંદગીમાં ફેરફારો તરફ દોરી જશે. આધુનિક સ્તંભોમાં સ્થિર તબક્કા સાથે બંધાયેલા લિગાન્ડના આધારે વિવિધ ધ્રુવીયતા હોય છે. પી. એફ. પી. એ પેન્ટાફ્લોરફિનાઇલ છે. સી. એન. એ સાયનો છે. NH2 એ એમિનો છે. ઓ. ડી. એસ. ઓક્ટાડેસિલ અથવા સી 18 છે. ODCN એ મિશ્ર મોડ સ્તંભ છે જેમાં C18 અને નાઇટ્રાઇલનો સમાવેશ થાય છે. ક્રોમેટોગ્રાફિક સપોર્ટ અને લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી (એલ. સી.) માટેના ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટેશનમાં તાજેતરના વિકાસ વિવિધ સ્થિર તબક્કાઓની ભૂમિતિઓનો ઉપયોગ કરીને ઝડપી અને અત્યંત કાર્યક્ષમ વિભાજનની સુવિધા આપે છે. વિવિધ વિશ્લેષણાત્મક વ્યૂહરચનાઓ પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવી છે, જેમ કે સિલિકા-આધારિત મોનોલિથિક આધારનો ઉપયોગ, ઉન્નત ગતિશીલ તબક્કાના તાપમાન અને અલ્ટ્રા-હાઈ-પ્રેશર એલ. સી. સિસ્ટમ્સ (યુ. એચ. પી. એલ. સી.) માં ઉપયોગ માટે પેટા-3 માઇક્રોન સુપરફિસિયલી છિદ્રાળુ કણો (ફ્યુઝ્ડ અથવા સોલિડ કોર) અથવા પેટા-2 માઇક્રોન સંપૂર્ણપણે છિદ્રાળુ કણોથી ભરેલા સ્તંભો. મોબાઇલ તબક્કાઓ રિવર્સડ ફેઝ ક્રોમેટોગ્રાફીમાં મોબાઇલ તબક્કાની પસંદગીના આધુનિક વલણો અને શ્રેષ્ઠ પદ્ધતિઓ પર એક વ્યાપક લેખ બોયસ અને ડોંગ દ્વારા પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યો હતો. રિવર્સડ ફેઝ ક્રોમેટોગ્રાફીમાં ગતિશીલ તબક્કામાં પાણી અથવા જલીય બફરના મિશ્રણનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં કાર્બનિક દ્રાવકો ઉમેરવામાં આવે છે, જેથી પસંદગીયુક્ત રીતે રિવર્સડ-ફેઝ કોલમમાંથી વિશ્લેષણ કરી શકાય. ઉમેરાયેલા કાર્બનિક દ્રાવકો પાણી સાથે મિશ્ર હોવા જોઈએ, અને ઉપયોગમાં લેવાતા બે સૌથી સામાન્ય કાર્બનિક દ્રાવકો એસિટોનિટ્રાઇલ, મિથેનોલ છે. અન્ય દ્રાવકોનો પણ ઉપયોગ કરી શકાય છે જેમ કે ઇથેનોલ અથવા 2-પ્રોપેનોલ (આઇસોપ્રોપીલ આલ્કોહોલ) અને ટેટ્રાહાઇડ્રોફુરન (ટી. એચ. એફ.). કાર્બનિક દ્રાવકને સંશોધક પણ કહેવામાં આવે છે, કારણ કે તે ગતિશીલ તબક્કાની ધ્રુવીયતામાં ફેરફાર કરવા માટે ગતિશીલ તબક્કામાં જલીય દ્રાવણમાં ઉમેરવામાં આવે છે. રિવર્સડ ફેઝ મોબાઇલ તબક્કામાં પાણી સૌથી વધુ ધ્રુવીય દ્રાવક છે, તેથી, મોડિફાયર્સ ઉમેરીને મોબાઇલ ફેઝની ધ્રુવીયતાને ઘટાડવાથી તેની ઇલ્યુશન શક્તિમાં વધારો થાય છે. બે સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા કાર્બનિક સંશોધકો એસિટોનિટ્રાઇલ અને મિથેનોલ છે, જોકે એસિટોનિટ્રાઇલ વધુ લોકપ્રિય પસંદગી છે. આઇસોપ્રોપેનોલ (2-પ્રોપેનોલ) નો ઉપયોગ તેના મજબૂત એલ્યુટિંગ ગુણધર્મોને કારણે પણ થઈ શકે છે, પરંતુ તેનો ઉપયોગ તેની ઉચ્ચ સ્નિગ્ધતા દ્વારા મર્યાદિત છે, જે ઉચ્ચ બેક પ્રેશરમાં પરિણમે છે. એસિટોનિટ્રાઇલ અને મિથેનોલ બંને આઇસોપ્રોપેનોલ કરતાં ઓછા ચીકણું હોય છે, જો કે 50:50% મિથેનોલનું મિશ્રણઃ પાણી પણ ખૂબ જ ચીકણું હોય છે અને ઉચ્ચ બેક પ્રેશરનું કારણ બને છે. ત્રણેય દ્રાવકો અનિવાર્યપણે યુવી પારદર્શક છે. સામાન્ય રિવર્સ ફેઝ ક્રોમેટોગ્રાફી માટે આ એક નિર્ણાયક ગુણધર્મ છે કારણ કે નમૂનાના ઘટકો સામાન્ય રીતે યુવી ડિટેક્ટર્સ દ્વારા શોધવામાં આવે છે. એસીટોનિટ્રાઇલ ઓછી યુવી તરંગલંબાઇની શ્રેણીમાં અન્ય કરતા વધુ પારદર્શક છે, તેથી તેનો ઉપયોગ લગભગ સંપૂર્ણપણે ત્યારે થાય છે જ્યારે પેપ્ટાઇડ્સ જેવા નબળા અથવા કોઈ રંગસૂત્રો (યુવી-વીઆઇએસ શોષતા જૂથો) ધરાવતા અણુઓને અલગ કરવામાં આવે છે. મોટાભાગના પેપ્ટાઇડ્સ માત્ર અલ્ટ્રા-વાયોલેટ સ્પેક્ટ્રમ (સામાન્ય રીતે 225 એનએમ કરતા ઓછા) નીચી તરંગલંબાઇ પર શોષી લે છે અને એસીટોનિટ્રાઇલ અન્ય સામાન્ય દ્રાવકોની તુલનામાં ઓછી તરંગલંબાઇ પર ઘણી ઓછી પૃષ્ઠભૂમિ શોષણ પ્રદાન કરે છે. ગતિશીલ તબક્કાના પીએચ વિશ્લેષણની જાળવણીમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવી શકે છે અને ચોક્કસ વિશ્લેષણની પસંદગીને બદલી શકે છે. એમાઇન્સ, કાર્બોક્સિલ્સ, ફોસ્ફેટ્સ, ફોસ્ફોનેટ્સ, સલ્ફેટ્સ અને સલ્ફોનેટ્સ જેવા આયનીકૃત કાર્યાત્મક જૂથો સાથેના દ્રાવકો ધરાવતા નમૂનાઓ માટે, આ જૂથોના આયનીકરણને મોબાઇલ ફેઝ બફરનો ઉપયોગ કરીને નિયંત્રિત કરી શકાય છે. ઉદાહરણ તરીકે, દ્રાવકોમાં કાર્બોક્સિલિક જૂથો વધુને વધુ નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થાય છે કારણ કે ગતિશીલ તબક્કાનું પી. એચ. તેમના પી. કે. એ. થી ઉપર વધે છે, તેથી સમગ્ર પરમાણુ વધુ ધ્રુવીય બને છે અને એ-ધ્રુવીય સ્થિર તબક્કા પર ઓછો જાળવી રાખે છે. આ કિસ્સામાં, ફેઝ મોબાઇલના પી. એચ. ને 4-5 = પી. એચ. (જે કાર્બોક્સિલિક જૂથો માટે લાક્ષણિક પી. કે. એ. શ્રેણી છે) થી ઉપર વધારવાથી તેમનું આયનીકરણ વધે છે, તેથી તેમની જાળવણીમાં ઘટાડો થાય છે. તેનાથી વિપરીત, 4 કરતા ઓછા pH પર ગતિશીલ તબક્કાનો ઉપયોગ કરવાથી તેમની જાળવણીમાં વધારો થશે, કારણ કે તે તેમના આયનીકરણના સ્તરમાં ઘટાડો કરશે, જેનાથી તેઓ ઓછા ધ્રુવીય બનશે. એ જ વિચારણાઓ મૂળભૂત કાર્યાત્મક જૂથો ધરાવતા પદાર્થોને લાગુ પડે છે, જેમ કે એમાઇન્સ, જેમની પી. કે. એ. શ્રેણી લગભગ 8 અને તેથી વધુ હોય છે, તે વધુ જાળવી રાખવામાં આવે છે, કારણ કે ગતિશીલ તબક્કાની પી. એચ. વધે છે, 8 અને તેથી વધુની નજીક પહોંચે છે, કારણ કે તેઓ ઓછા આયનીકૃત હોય છે, તેથી ઓછા ધ્રુવીય હોય છે. જો કે, ઉચ્ચ pH મોબાઇલ તબક્કાઓના કિસ્સામાં, મોટાભાગના પરંપરાગત સિલિકા જેલ આધારિત રિવર્સડ ફેઝ કૉલમ સામાન્ય રીતે pH 8 અને તેનાથી ઉપરના મોબાઇલ તબક્કાઓ સાથે ઉપયોગ માટે મર્યાદિત હોય છે, તેથી, આ શ્રેણીમાં એમાઇન્સની જાળવણી પર નિયંત્રણ મર્યાદિત છે. બફર પ્રકારની પસંદગી એ આર. પી.-એલ. સી. પદ્ધતિના વિકાસમાં એક મહત્વપૂર્ણ પરિબળ છે, કારણ કે તે રુચિના વિશ્લેષકોની જાળવણી, પસંદગી અને ઠરાવને અસર કરી શકે છે. આર. પી.-એચ. પી. એલ. સી. માટે બફર પસંદ કરતી વખતે, ધ્યાનમાં લેવાના ઘણા પરિબળો છે, જેમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છેઃ મોબાઇલ તબક્કાના ઇચ્છિત પી. એચ.: બફર તેમના પી. કે. એ. મૂલ્યની આસપાસ સૌથી વધુ અસરકારક હોય છે, તેથી પી. કે. એ. સાથે બફર પસંદ કરવું મહત્વપૂર્ણ છે જે ઇચ્છિત મોબાઇલ તબક્કાના પી. એચ. ની નજીક છે. કાર્બનિક દ્રાવકમાં બફરની દ્રાવ્યતાઃ બફર કાર્બનિક દ્રાવક સાથે સુસંગત હોવું જોઈએ જેનો ઉપયોગ ગતિશીલ તબક્કામાં થઈ રહ્યો છે, મોટે ભાગે ઉપર ઉલ્લેખિત સામાન્ય કાર્બનિક દ્રાવકો, એસિટોનિટ્રાઇલ, મિથેનોલ અને આઇસોપ્રોપેનોલ સાથે. બફરનો યુવી કટ-ઓફઃ યુવી શોધના કિસ્સામાં, બફરમાં યુવી શોષણ હોવું જોઈએ જે રસના વિશ્લેષકોની શોધ તરંગલંબાઇથી ઓછું હોવું જોઈએ. આ બફરને તે વિશ્લેષકોની શોધમાં દખલ કરતા અટકાવશે. ડિટેક્ટર સાથે બફરની સુસંગતતાઃ જો માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (એમ. એસ.) નો ઉપયોગ શોધ માટે કરવામાં આવી રહ્યો હોય, તો બફર માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (એમ. એસ.) સાધન સાથે સુસંગત હોવું જોઈએ. કેટલાક બફર, જેમ કે ફોસ્ફેટ ક્ષાર ધરાવતા, એમ. એસ. ડિટેક્ટર્સ સાથે ઉપયોગ કરી શકાતા નથી, કારણ કે તેઓ જરૂરિયાત મુજબ અસ્થિર નથી, અને તેઓ એનાલાઇટ્સ આયનીકરણને દબાવીને એમ. એસ. શોધમાં દખલ કરે છે, જેનાથી તેમને એમ. એસ. દ્વારા શોધી શકાતા નથી. આર. પી.-એચ. પી. એલ. સી. માં ઉપયોગમાં લેવાતા કેટલાક સૌથી સામાન્ય બફરમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છેઃ ફોસ્ફેટ બફરઃ ફોસ્ફેટ બફર બહુમુખી છે અને 3 પી. કે. એ. મૂલ્યોને કારણે તેનો ઉપયોગ પી. એચ. મૂલ્યોની વિશાળ શ્રેણી પ્રાપ્ત કરવા માટે થઈ શકે છે. તેઓ યુવી ડિટેક્શન માટે ખૂબ ઓછી યુવી બેકગ્રાઉન્ડ પણ ધરાવે છે. જો કે, તેઓ એમ. એસ. ની તપાસ માટે યોગ્ય નથી. એસિટેટ બફર્સઃ એસિટેટ બફર્સ પણ બહુમુખી છે અને તેનો ઉપયોગ સામાન્ય રીતે આરપી-એલસીમાં ઉપયોગમાં લેવાતા પીએચ મૂલ્યોની શ્રેણી પ્રાપ્ત કરવા માટે થઈ શકે છે. પેટા 220 એનએમ તરંગલંબાઇ પર યુવી શોધની દ્રષ્ટિએ, તે એટલું અનુકૂળ નથી. એમોનિયમ એસિટેટ બફર એમએસ. ફોર્મેટ બફર સાથે સુસંગત છેઃ ફોર્મેટ બફર 225 એનએમ હેઠળ ઉપયોગમાં લેવાતા પીએચ અને મર્યાદિત યુવી શોધની શ્રેણીની દ્રષ્ટિએ એસિટેટ બફર જેવું જ છે. તેનું એમોનિયમ એસિટેટ પણ એમએસ સાથે સુસંગત છે. એમોનિયમ બફર્સઃ એમોનિયમ બફર્સ અસ્થિર હોય છે અને તેનો ઉપયોગ ઘણીવાર એલસી-એમએસ પદ્ધતિઓમાં થાય છે. તેઓ ઓછી યુવી શોધ માટે પણ મર્યાદિત છે. ચાર્જ કરેલા વિશ્લેષકોને આયન-જોડી (જેને આયન-ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પણ કહેવાય છે) નો ઉપયોગ કરીને વિપરીત તબક્કાના સ્તંભ પર અલગ કરી શકાય છે. આ તકનીકને રિવર્સ-ફેઝ આયન-પેયરિંગ ક્રોમેટોગ્રાફી તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. ઇલ્યુશન આઇસોક્રેટિક રીતે કરી શકાય છે (પાણી-દ્રાવકની રચના અલગ કરવાની પ્રક્રિયા દરમિયાન બદલાતી નથી) અથવા સોલ્યુશન ગ્રેડિયન્ટનો ઉપયોગ કરીને (પાણી-દ્રાવકની રચના અલગ કરવાની પ્રક્રિયા દરમિયાન બદલાય છે, સામાન્ય રીતે ધ્રુવીયતામાં ઘટાડો કરીને). એક્વિઅસ નોર્મલ-ફેઝ ક્રોમેટોગ્રાફી સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ કોષ્ટકો વિવિધ પ્રકારના વિપરીત તબક્કાઓનો સારાંશ આપે છે, અને કાર્યાત્મક પ્રક્રિયા ક્રોમેટોગ્રાફી પરની માહિતી પણ જુઓ.