Digital transcriptome subtraction
ડિજિટલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ બાદબાકી (ડી. ટી. એસ.) એ યજમાન ક્રમની કોમ્પ્યુટેશનલ દૂર કરીને નવીન પેથોજેન ટ્રાન્સક્રિપ્ટની હાજરી શોધવા માટેની બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પદ્ધતિ છે. ડી. ટી. એસ. એ વેટ-લેબ એપ્રોચ રિપ્રેઝેન્ટેશનલ ડિફરન્સ એનાલિસિસ (આર. ડી. એ.) નું સીધું સિલિકો એનાલોગ છે, અને તે નિષ્પક્ષ ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ અને યજમાનના ઉચ્ચ ગુણવત્તાવાળા, એનોટેટેડ સંદર્ભ જીનોમની ઉપલબ્ધતા દ્વારા શક્ય બને છે. આ પદ્ધતિ ખાસ કરીને ચેપી રોગોના ઇટીયોલોજીકલ એજન્ટની તપાસ કરે છે અને મર્કેલ સેલ પોલિઓમાવાયરસની શોધ માટે જાણીતી છે, જે મર્કેલ-સેલ કાર્સિનોમામાં શંકાસ્પદ કારક એજન્ટ છે. નવા પેથોજેન્સ શોધવા માટે કોમ્પ્યુટેશનલ બાદબાકીનો ઉપયોગ કરવાનો ઇતિહાસ સૌપ્રથમ 2002 માં મેયરસન એટ અલ દ્વારા પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવ્યો હતો. હ્યુમન એક્સપ્રેસ્ડ સિક્વન્સ ટેગ (EST) ડેટાસેટ્સનો ઉપયોગ કરીને. સિદ્ધાંત પ્રયોગના પુરાવા તરીકે, મેયર્સન એટ અલ. તે દર્શાવે છે કે પોસ્ટ-ટ્રાન્સપ્લાન્ટ લિમ્ફોપ્રોલિફરેટિવ ડિસઓર્ડર (પી. ટી. એલ. ડી.) માં એપસ્ટીન-બાર વાયરસ-ચેપગ્રસ્ત લિમ્ફોસાઇટ્સનો ઉપયોગ કરીને તે એક શક્ય અભિગમ હતો. 2007 માં, "ડિજિટલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ સબટ્રેક્શન" શબ્દ ચાંગ-મૂર જૂથ દ્વારા રચવામાં આવ્યો હતો, અને તેનો ઉપયોગ મર્કેલ-સેલ કાર્સિનોમામાં મર્કેલ સેલ પોલિમાવાયરસ શોધવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. એમસીવીની શોધની સાથે સાથે, આ અભિગમનો ઉપયોગ એવા કિસ્સામાં મૃત્યુના કારણ તરીકે નવલકથા એરેનાવાયરસને સામેલ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો જ્યાં એક જ દાતા પાસેથી અંગ પ્રત્યારોપણ પછી તરત જ ત્રણ દર્દીઓ સમાન બીમારીઓથી મૃત્યુ પામ્યા હતા. પદ્ધતિ સી. ડી. એન. એ. પુસ્તકાલયનું નિર્માણ માનવ જીનોમિક ડી. એન. એ. ને દૂર કરવા માટે ડી. એન. એ. એસ. I સાથે સારવાર કર્યા પછી, પ્રાથમિક ચેપગ્રસ્ત પેશીઓમાંથી કુલ આર. એન. એ. કાઢવામાં આવે છે. ત્યારબાદ મેસેન્જર આર. એન. એ. ને ઓલિગો-ડી. ટી. સ્તંભનો ઉપયોગ કરીને શુદ્ધ કરવામાં આવે છે જે પોલી-એ પૂંછડી સાથે જોડાય છે, જે સંકેત ખાસ કરીને અનુલેખિત જનીનો પર જોવા મળે છે. રેન્ડમ હેક્સામર્સ પ્રાઇમિંગનો ઉપયોગ કરીને, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ (આરટી) તમામ એમઆરએનએને સીડીએનએમાં રૂપાંતરિત કરે છે અને બેક્ટેરિયલ વેક્ટરમાં ક્લોન કરે છે. બેક્ટેરિયા, સામાન્ય રીતે ઇ. કોલી, પછી સી. ડી. એન. એ. વેક્ટરનો ઉપયોગ કરીને રૂપાંતરિત થાય છે અને માર્કરનો ઉપયોગ કરીને પસંદ કરવામાં આવે છે, રૂપાંતરિત ક્લોનનો સંગ્રહ સી. ડી. એન. એ. લાઇબ્રેરી છે. આ પેશીના એમ. આર. એન. એ. નો સ્નેપ-શોટ પેદા કરે છે જે સ્થિર હોય છે અને પછીના તબક્કે અનુક્રમિત કરી શકાય છે. ક્રમ અને ગુણવત્તા નિયંત્રણ સી. ડી. એન. એ. પુસ્તકાલયને ખૂબ ઊંડાણપૂર્વક ક્રમબદ્ધ કરવું આવશ્યક છે (એટલે કે. અનુક્રમિત ક્લોનની સંખ્યા) સૈદ્ધાંતિક દુર્લભ રોગકારક ક્રમ (કોષ્ટક 1) શોધવા માટે, ખાસ કરીને જો વિદેશી ક્રમ નવીન હોય. ચાંગ-મૂર બહુવિધ સિક્વન્સિંગ પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ કરીને 200,000 લખાણ અથવા તેનાથી વધુની સિક્વન્સિંગ ઊંડાઈની ભલામણ કરે છે. પછી ખોટા-હકારાત્મક પરિણામોને ઘટાડવા માટે કાચા ક્રમ પર કડક ગુણવત્તા નિયંત્રણ લાગુ કરવામાં આવે છે. પ્રારંભિક ગુણવત્તાવાળી સ્ક્રીન અસ્પષ્ટ ક્રમને બાકાત રાખવા માટે કેટલાક સામાન્ય પરિમાણોનો ઉપયોગ કરે છે, જે ઉચ્ચ-વફાદારી (હાય-ફાઇ) વાંચનનો ડેટાસેટ પાછળ છોડી દે છે. લો ફ્રેડ સ્કોર કટઓફનો ઉપયોગ ઓછી ગુણવત્તાવાળા અંતિમ ક્રમને દૂર કરવા માટે થાય છે. સામાન્ય રીતે, દરેક બેઝ-કોલિંગમાં 99%-99.9% ચોકસાઈની ખાતરી કરવા માટે 20 અથવા 30ના ફ્રેડ સ્કોર કટઓફનો ઉપયોગ થાય છે. વેક્ટર અને એડેપ્ટર દૂર કરવા. ઓછી જટિલતા-શ્રેણીનો જટિલતા સ્કોર પોલી-ડીટી અથવા પોલી-ડીએ જેવા શ્રેણી (હોમો-પોલિમર) માં સમાન પાયાની સંખ્યાને પ્રતિબિંબિત કરે છે. માનવ પુનરાવર્તિત ડીએનએ. લંબાઈ-પરિમાણ ઉપયોગમાં લેવાતી અનુક્રમણિકા તકનીક માટે વિશિષ્ટ ઑપ્ટિમાઇઝ કરેલ વાંચન લંબાઈ પર આધારિત છે. બ્લાસ્ટ કરો અને ઇ. કોલી જીનોમ સિક્વન્સને બાકાત રાખો. મેગાબ્લેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને જીનોમ હોસ્ટ કરવા માટે બ્લાસ્ટ, હાઈ-ફાઈ રીડ્સ પછી એનોટેટેડ ડેટાબેઝમાં સિક્વન્સ સાથે મેળ ખાય છે અને કોઈપણ પોઝિટિવ મેચો પછી ડેટાસેટમાંથી બાદ કરવામાં આવે છે. માનવ ક્રમની હકારાત્મક મેળ માટે લઘુતમ હિટ લંબાઈ સામાન્ય રીતે 30 સળંગ સમાન પાયા હોય છે, જે 60 ના બ્લાસ્ટ સ્કોરની સમકક્ષ હોય છે; સામાન્ય રીતે, બાકીનો ક્રમ થોડો વિસંગતતા (20 ન્યુક્લિયોટાઇડમાં 1) માટે પરવાનગી આપવા માટે ઓછા કડક પરિમાણો સાથે ફરીથી બ્લાસ્ટ હોય છે. મોટા ભાગના ક્રમ (> 99 ટકા) ને આ તબક્કે ડેટાસેટમાંથી દૂર કરવા જોઈએ. બાદ કરેલ ક્રમમાં સામાન્ય રીતે નીચેનાનો સમાવેશ થાય છેઃ સંદર્ભ માનવ લખાણ-અભિવ્યક્તિ પુસ્તકાલય સમૂહોમાંથી કોઈપણ જાણીતા માનવ લખાણને દૂર કરે છે. માનવ જીનોમનો સંદર્ભ-સી. ડી. એન. એ. પુસ્તકાલયના નિર્માણ દરમિયાન એનોટેશન પ્રક્રિયા અને કોઈપણ દૂષિત જીનોમિક સિક્વન્સ દ્વારા ચૂકી ગયેલા જનીનોને દૂર કરે છે. મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએ-મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએ ઝડપી પરિવર્તન દરને કારણે અત્યંત વિપુલ પ્રમાણમાં અને બહુરૂપી છે. ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન ક્ષેત્ર-ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન લોકી અત્યંત બહુરૂપી છે અને અન્યથા સંદર્ભ જીનોમની નબળી ગોઠવણીને કારણે ખોટા-હકારાત્મક પરિણામ આપે છે. અન્ય કરોડઅસ્થિધારી શ્રેણીઓ "બિન-યજમાન" ઉમેદવારોનું બિનઅનુભવી શ્રેણીઓનું વિશ્લેષણ રોગકારક ડેટાબેઝ સાથે સંરેખિત બાદબાકીના કડક રાઉન્ડ પછી, બાકીના શ્રેણીઓને બિન-અપૂરતા કોન્ટિગ્સમાં ક્લસ્ટર કરવામાં આવે છે અને ઓછી-કઠોરતાના પરિમાણોનો ઉપયોગ કરીને જાણીતા રોગકારક શ્રેણીઓ સાથે સંરેખિત કરવામાં આવે છે. જેમ જેમ રોગકારક જીનોમ ઝડપથી પરિવર્તિત થાય છે, તેમ તેમ ન્યુક્લિયોટાઇડ-ન્યુક્લિયોટાઇડ સંરેખણ અથવા બ્લાસ્ટન સામાન્ય રીતે બિન-માહિતીપ્રદ હોય છે કારણ કે કોડન અધોગતિને કારણે એમિનો એસિડના અવશેષોને બદલ્યા વિના ચોક્કસ પાયા પર પરિવર્તન થવું શક્ય છે. તમામ 6 ખુલ્લી વાંચન ફ્રેમની ઇન સિલિકો અનુવાદિત પ્રોટીન સિક્વન્સને એમિનો એસિડ સિક્વન્સ સાથે એનોટેટેડ પ્રોટીન અથવા બ્લાસ્ટક્સ સાથે મેચ કરવી એ પસંદગીની સંરેખણ પદ્ધતિ છે કારણ કે તે સંબંધિત તાણ/પ્રજાતિઓ સાથે મેળ ખાતા નવા પેથોજેનને ઓળખવાની સંભાવના વધારે છે. સકારાત્મક મેળની શક્યતાઓને મહત્તમ કરવા માટે આ તબક્કે ઉમેદવાર ક્રમના પ્રાયોગિક વિસ્તરણનો પણ ઉપયોગ કરી શકાય છે. ડી નોવો એસેમ્બલી એવા કિસ્સાઓમાં કે જ્યાં જાણીતા પેથોજેન્સ સાથે સંરેખણ બિન-માહિતીપ્રદ અથવા અસ્પષ્ટ હોય, ઉમેદવાર ક્રમના કોન્ટિગ્સનો ઉપયોગ પ્રાથમિક ચેપગ્રસ્ત પેશીઓમાં સંપૂર્ણ પેથોજેન જીનોમ ક્રમ પેદા કરવા માટે પ્રાઇમર વૉકિંગ માટે નમૂનાઓ તરીકે થઈ શકે છે. વાયરલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ અત્યંત દુર્લભ ગુણોત્તર પેશી mRNA (1 મિલિયનમાં 10 ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ) હોવાથી, ઓછા કવરેજને કારણે એકલા મૂળ ઉમેદવાર સિક્વન્સના આધારે ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ બનાવવાની શક્યતા નથી. પેથોજેનની માન્યતા એકવાર ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ ડેટામાં અનુમાનિત પેથોજેનની ઓળખ થઈ જાય પછી, વધુ સંવેદનશીલ તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને ચેપગ્રસ્ત દર્દીઓમાં પેથોજેનની હાજરીને માન્ય કરવી અનિવાર્ય છે, જેમ કેઃ આર. ટી.-પી. સી. આર. અને 3 '-અને 5'-આર. એ. સી. ઈ. સહિત વ્યુત્પન્ન પદ્ધતિઓ, રોગકારક એમ. આર. એન. એ. ના અસ્તિત્વની પુષ્ટિ કરવા માટે. પેશીઓમાં રોગકારક અસ્તિત્વ નક્કી કરવા માટે સંબંધિત રોગકારક માટે એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી. રોગકારક-વિશિષ્ટ એન્ટિબોડી ટાઈટરને માપવા માટે સેરોલોજીકલ પરીક્ષણો. બેક્ટેરિયલ કલ્ચર/વાયરલ કલ્ચર, જેને પ્રયોગશાળાના નિદાનમાં સુવર્ણ ધોરણ માનવામાં આવે છે. ડી. ટી. એસ. માટેનો પ્રાથમિક ઉપયોગ કેન્સરમાં રોગકારક વાયરસની ઓળખમાં રહેલો છે. તેનો ઉપયોગ બિન-કેન્સર સંબંધિત રોગમાં વાયરલ પેથોજેન્સને ઓળખવા માટે પણ થઈ શકે છે. ભવિષ્યના તબીબી કાર્યક્રમોમાં વ્યક્તિઓમાં નિયમિત ધોરણે ડી. ટી. એસ. નો ઉપયોગ સામેલ હોઈ શકે છે. ડી. ટી. એસ. કૃષિ પર પણ લાગુ થઈ શકે છે, ઉત્પાદન પર અસર કરતા પેથોજેન્સને ઓળખી શકે છે. ગણતરી બાદબાકીનો ઉપયોગ પહેલેથી જ મેટાજેનોમિક્સ અભ્યાસમાં કરવામાં આવ્યો હતો જે આઈ. એ. પી. વી. દ્વારા વાયરલ ચેપને મધમાખીઓમાં વસાહત પતન વિકાર સાથે સંકળાયેલો હતો. ફાયદાઓ રોગકારક ક્રમ વિશે કોઈ પૂર્વ જ્ઞાનની જરૂર નથી. અગાઉ અસંબંધિત, સંભવિત રીતે સારવાર કરી શકાય તેવા પેથોજેન્સને ઓળખી શકે છે. પહેલેથી જ ઉપલબ્ધ પરમાણુ પદ્ધતિઓ અને સંસાધનોનો ઉપયોગ કરે છે. ગેરફાયદા રોગકારકની હાજરીને ઓળખે છે પરંતુ રોગ સાથે કારણભૂત જોડાણ સ્થાપિત કરતું નથી. કોચની પૂર્વધારણા અને બ્રેડફોર્ડ હિલ માપદંડ જુઓ. અભ્યાસ કરવામાં આવી રહેલા જીવતંત્ર માટે અત્યંત વિશ્વસનીય, સંપૂર્ણ સંદર્ભ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ હોવું આવશ્યક છે. વિદેશી અનુક્રમ ઓળખનો અભાવ રોગકારક વિદેશી પદાર્થને સંપૂર્ણપણે બાકાત રાખી શકતો નથી. સંદર્ભો બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ