Illumina dye sequencing
ઇલ્યુમિના ડાય સિક્વન્સિંગ એ એક તકનીક છે જેનો ઉપયોગ ડીએનએમાં બેઝ જોડીની શ્રેણી નક્કી કરવા માટે થાય છે, જેને ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે. રિવર્સિબલ ટર્મિનેટેડ રસાયણશાસ્ત્રની વિભાવનાની શોધ બ્રુનો કેનાર્ડ અને સિમોન સરફાતી દ્વારા પેરિસમાં પાશ્ચર ઇન્સ્ટિટ્યૂટમાં કરવામાં આવી હતી. તે કેમ્બ્રિજ યુનિવર્સિટીના શંકર બાલાસુબ્રમણ્યમ અને ડેવિડ ક્લેનરમેન દ્વારા વિકસાવવામાં આવ્યું હતું, જેમણે પછીથી સોલેક્સાની સ્થાપના કરી હતી, જે કંપની પાછળથી ઈલુમિના દ્વારા હસ્તગત કરવામાં આવી હતી. આ અનુક્રમણિકા પદ્ધતિ રિવર્સિબલ ડાય-ટર્મિનેટર પર આધારિત છે જે સિંગલ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સની ઓળખને સક્ષમ કરે છે કારણ કે તેઓ ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડ્સ પર ધોવાઇ જાય છે. તેનો ઉપયોગ સંપૂર્ણ જીનોમ અને ક્ષેત્ર અનુક્રમણિકા, ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ વિશ્લેષણ, મેટાજેનૉમિક્સ, નાના આરએનએ શોધ, મિથાઇલેશન પ્રોફાઇલિંગ અને જીનોમ-વાઇડ પ્રોટીન-ન્યુક્લિક એસિડ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા વિશ્લેષણ માટે પણ થઈ શકે છે. ઝાંખી આ ત્રણ મૂળભૂત પગલાંઓમાં કામ કરે છેઃ વિસ્તૃત કરો, ક્રમ બનાવો અને વિશ્લેષણ કરો. પ્રક્રિયા શુદ્ધ ડીએનએ સાથે શરૂ થાય છે. ડીએનએ ખંડિત થાય છે અને એડેપ્ટરો ઉમેરવામાં આવે છે જેમાં વિભાગો હોય છે જે વિસ્તરણ, અનુક્રમણિકા અને વિશ્લેષણ દરમિયાન સંદર્ભ બિંદુઓ તરીકે કાર્ય કરે છે. સુધારેલા ડીએનએને ફ્લો સેલ પર લોડ કરવામાં આવે છે જ્યાં એમ્પ્લીફિકેશન અને સિક્વન્સિંગ થશે. ફ્લો સેલમાં નેનોવેલ્સ હોય છે જે ટુકડાઓ બહાર કાઢે છે અને ભીડમાં મદદ કરે છે. દરેક નેનોવેલમાં ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ હોય છે જે એડેપ્ટરોને જોડવા માટે લંગર બિંદુ પ્રદાન કરે છે. એકવાર ટુકડાઓ જોડાઈ જાય પછી, ક્લસ્ટર જનરેશન નામનો તબક્કો શરૂ થાય છે. આ પગલું ડીએનએના દરેક ટુકડાની લગભગ એક હજાર નકલો બનાવે છે અને બ્રિજ એમ્પ્લીફિકેશન પી. સી. આર. દ્વારા કરવામાં આવે છે. આગળ, પ્રાઈમર્સ અને સંશોધિત ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને ચિપ પર ધોવામાં આવે છે. આ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સમાં ઉલટાવી શકાય તેવું ફ્લોરોસન્ટ બ્લૉકર હોય છે જેથી ડીએનએ પોલિમરેઝ ડીએનએ ટુકડા પર એક સમયે માત્ર એક ન્યુક્લિયોટાઇડ ઉમેરી શકે છે. સંશ્લેષણના દરેક રાઉન્ડ પછી, કેમેરા ચિપનું ચિત્ર લે છે. કમ્પ્યુટર નક્કી કરે છે કે ફ્લોરોસન્ટ ટેગની તરંગલંબાઇ દ્વારા કયો આધાર ઉમેરવામાં આવ્યો હતો અને તેને ચિપ પરના દરેક સ્થળ માટે રેકોર્ડ કરે છે. દરેક રાઉન્ડ પછી, બિન-સમાવિષ્ટ અણુઓ ધોવાઇ જાય છે. ત્યારબાદ 3 'ફ્લોરોસન્ટ ટર્મિનલ બ્લોકિંગ જૂથને દૂર કરવા માટે રાસાયણિક ડીબ્લોકિંગ પગલાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. જ્યાં સુધી સંપૂર્ણ ડીએનએ પરમાણુ અનુક્રમિત ન થાય ત્યાં સુધી પ્રક્રિયા ચાલુ રહે છે. આ ટેકનોલોજી સાથે, સમગ્ર જિનોમમાં હજારો સ્થાનોને વિશાળ સમાંતર ક્રમ દ્વારા એક જ સમયે અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે. પ્રોસિજર જીનોમિક લાઈબ્રેરી ડીએનએને શુદ્ધ કર્યા પછી ડીએનએ લાઈબ્રેરી, જીનોમિક લાઈબ્રેરી, બનાવવાની જરૂર છે. જીનોમિક લાઈબ્રેરી બનાવવાની બે રીતો છે, સોનિકેશન અને ટેગમેન્ટેશન. ટેગમેન્ટેશન સાથે, ટ્રાન્સપોઝેસ યાદૃચ્છિક રીતે ડીએનએને 50 અને 500 બી. પી. ના ટુકડાઓ વચ્ચેના કદમાં કાપી નાખે છે અને સાથે સાથે એડેપ્ટર ઉમેરે છે. જીનોમિક ડીએનએના ટુકડા કરવા માટે સોનિકેશનનો ઉપયોગ કરીને આનુવંશિક પુસ્તકાલય પણ બનાવી શકાય છે. સોનિકેશન અલ્ટ્રાસોનિક ધ્વનિ તરંગોનો ઉપયોગ કરીને ડીએનએને સમાન કદમાં વિભાજિત કરે છે. સોનિકેશન પછી જમણા અને ડાબા એડેપ્ટરને T7 DNA પોલિમરેઝ અને T4 DNA લિગેઝ દ્વારા જોડવાની જરૂર પડશે. એડેપ્ટરોને જોડવામાં નિષ્ફળ રહેલા સ્ટ્રેન્ડ્સ ધોવાઇ જાય છે. એડેપ્ટર્સ એડેપ્ટર્સમાં ત્રણ અલગ અલગ વિભાગો હોય છેઃ ઘન આધાર (ફ્લો સેલ પર ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ), બારકોડ ક્રમ (સૂચકાંકો), અને સિક્વન્સિંગ પ્રાઇમર માટે બંધનકર્તા સ્થળનો પૂરક ક્રમ. સૂચકાંકો સામાન્ય રીતે છ આધાર જોડીઓ લાંબા હોય છે અને તેનો ઉપયોગ નમૂનાઓને ઓળખવા માટે ડીએનએ અનુક્રમ વિશ્લેષણ દરમિયાન થાય છે. સૂચકાંકો 96 જેટલા જુદા જુદા નમૂનાઓને એકસાથે ચલાવવાની મંજૂરી આપે છે, જેને મલ્ટિપ્લેક્સિંગ તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે. વિશ્લેષણ દરમિયાન, કોમ્પ્યુટર બધા વાંચનને એક જ અનુક્રમણિકા સાથે એકસાથે જૂથબદ્ધ કરશે. ઇલ્યુમિના "સંશ્લેષણ દ્વારા ક્રમ" અભિગમનો ઉપયોગ કરે છે. આ પ્રક્રિયા એક્રિલામાઇડ-કોટેડ ગ્લાસ ફ્લો સેલની અંદર થાય છે. પ્રવાહ કોષમાં કોષના તળિયે કોટિંગ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (ટૂંકા ન્યુક્લિયોટાઇડ સિક્વન્સ) હોય છે, અને તે સિક્વન્સિંગ દરમિયાન ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડ્સને સ્થાને રાખવા માટે નક્કર આધાર તરીકે કામ કરે છે. જેમ જેમ ખંડિત ડીએનએ પ્રવાહ કોષ પર ધોવાઇ જાય છે, તેમ તેમ યોગ્ય એડેપ્ટર પૂરક નક્કર આધાર સાથે જોડાય છે. બ્રિજ એમ્પ્લીફિકેશન એકવાર જોડાઈ ગયા પછી, ક્લસ્ટર જનરેશન શરૂ થઈ શકે છે. ધ્યેય ડીએનએના સેંકડો સમાન સેર બનાવવાનો છે. કેટલાક આગળના સ્ટ્રાન્ડ હશે; બાકીના, વિપરીત. આ જ કારણ છે કે જમણા અને ડાબા એડેપ્ટરનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. ક્લસ્ટર બ્રિજ એમ્પ્લીફિકેશન દ્વારા પેદા થાય છે. ડીએનએ પોલિમરેઝ ડીએનએના સ્ટ્રાન્ડ સાથે આગળ વધે છે, તેના પૂરક સ્ટ્રાન્ડ બનાવે છે. મૂળ સ્ટ્રાન્ડ ધોવાઇ જાય છે, માત્ર રિવર્સ સ્ટ્રાન્ડ જ રહે છે. રિવર્સ સ્ટ્રાન્ડની ટોચ પર એડેપ્ટર ક્રમ હોય છે. ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડ વળે છે અને ઓલિગો સાથે જોડાય છે જે ટોચના એડેપ્ટર ક્રમમાં પૂરક છે. પોલિમરેઝ રિવર્સ સ્ટ્રાન્ડ સાથે જોડાય છે, અને તેની પૂરક સ્ટ્રાન્ડ (જે મૂળ જેવી જ હોય છે) બનાવવામાં આવે છે. હવે ડબલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએને વિકૃત કરવામાં આવે છે જેથી દરેક સ્ટ્રાન્ડ ફ્લો સેલમાં લંગર કરેલા ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ ક્રમ સાથે અલગથી જોડાઈ શકે. એક રિવર્સ સ્ટ્રાન્ડ હશે; બીજો, ફોરવર્ડ. આ પ્રક્રિયાને બ્રિજ એમ્પ્લીફિકેશન કહેવામાં આવે છે, અને તે એક જ સમયે ફ્લો સેલ પર હજારો ક્લસ્ટરો માટે થાય છે. ક્લોનલ એમ્પ્લીફિકેશન વારંવાર, ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડ્સ વળશે અને નક્કર આધાર સાથે જોડાશે. ડીએનએ પોલિમરેઝ ડબલ સ્ટ્રેન્ડેડ સેગમેન્ટ બનાવવા માટે નવા સ્ટ્રાન્ડનું સંશ્લેષણ કરશે, અને તે વિકૃતિકૃત થશે જેથી એક વિસ્તારમાં તમામ ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડ એક જ સ્રોત (ક્લોનલ એમ્પ્લીફિકેશન) માંથી હોય. ગુણવત્તા નિયંત્રણ હેતુઓ માટે ક્લોનલ એમ્પ્લીફિકેશન મહત્વપૂર્ણ છે. જો કોઈ સ્ટ્રાન્ડમાં વિચિત્ર ક્રમ જોવા મળે છે, તો વૈજ્ઞાનિકો તેની ખાતરી કરવા માટે રિવર્સ સ્ટ્રાન્ડની તપાસ કરી શકે છે કે તેમાં સમાન વિચિત્રતાનું પૂરક છે. આગળની અને પાછળની દોરીઓ કલાકૃતિઓથી રક્ષણ માટે તપાસ તરીકે કામ કરે છે. કારણ કે ઇલ્યુમિના સિક્વન્સિંગ ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે, બેઝ સબસ્ટિટ્યુશન ભૂલો જોવા મળી છે, ખાસ કરીને 3 'છેડે. ક્લસ્ટર જનરેશન સાથે જોડાયેલા એન્ડ રીડ્સ ભૂલ થઈ હોવાની પુષ્ટિ કરી શકે છે. રિવર્સ અને ફોરવર્ડ સ્ટ્રેન્ડ્સ એકબીજાના પૂરક હોવા જોઈએ, બધા રિવર્સ રીડ્સ એકબીજા સાથે મેળ ખાતા હોવા જોઈએ, અને બધા ફોરવર્ડ રીડ્સ એકબીજા સાથે મેળ ખાતા હોવા જોઈએ. જો વાંચન તેના સમકક્ષો (જેની સાથે તે ક્લોન હોવું જોઈએ) માટે પૂરતું સમાન ન હોય, તો ભૂલ આવી હોઈ શકે છે. કેટલીક પ્રયોગશાળાઓના વિશ્લેષણમાં ઓછામાં ઓછી 97 ટકા સમાનતાનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે. સંશ્લેષણ દ્વારા ક્રમ ક્લોનલ એમ્પ્લીફિકેશનના અંતે, તમામ રિવર્સ સ્ટ્રેન્ડ્સ ફ્લો સેલમાંથી ધોવાઇ જાય છે, જેનાથી માત્ર આગળના સ્ટ્રેન્ડ્સ જ રહે છે. એક પ્રાઇમર ફોરવર્ડ સ્ટ્રેન્ડ્સ એડેપ્ટર પ્રાઇમર બાઈન્ડીંગ સાઇટ સાથે જોડાય છે, અને પોલિમરેઝ ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડમાં ફ્લોરોસન્ટલી ટેગ કરેલ ડીએનટીપી ઉમેરે છે. અવરોધક જૂથ તરીકે કામ કરતા ફ્લોરોફોરને કારણે દરેક રાઉન્ડમાં માત્ર એક જ આધાર ઉમેરી શકાય છે; જો કે, અવરોધક જૂથ ઉલટાવી શકાય તેવું છે. ચાર રંગના રસાયણશાસ્ત્રનો ઉપયોગ કરીને, ચાર પાયાઓમાંથી દરેકમાં એક અનોખું ઉત્સર્જન હોય છે, અને દરેક રાઉન્ડ પછી, મશીન રેકોર્ડ કરે છે કે કયો આધાર ઉમેરવામાં આવ્યો હતો. એકવાર રંગ રેકોર્ડ થઈ જાય પછી ફ્લોરોફોર ધોવાઇ જાય છે અને અન્ય ડી. એન. ટી. પી. ફ્લો સેલ પર ધોવાઇ જાય છે અને પ્રક્રિયા પુનરાવર્તિત થાય છે. નેક્સ્ટસેક અને બાદમાં મિનીસેકના લોન્ચિંગથી શરૂ કરીને, ઈલુમિનાએ નવી બે રંગની સિક્વન્સિંગ રસાયણશાસ્ત્ર રજૂ કરી. ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને બે રંગોમાંથી એક (લાલ અથવા લીલો), કોઈ રંગ ("કાળો") અથવા બંને રંગોના સંયોજન (લાલ અને લીલા વચ્ચેના મિશ્રણ તરીકે નારંગી દેખાય છે) દ્વારા અલગ પાડવામાં આવે છે. એકવાર ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડ વાંચ્યા પછી, હમણાં જ ઉમેરવામાં આવેલી સ્ટ્રાન્ડ ધોવાઇ જાય છે. પછી, અનુક્રમણિકા 1 પ્રાઇમર જોડાય છે, અનુક્રમણિકા 1 ક્રમને પોલિમરાઇઝ કરે છે, અને ધોવાઇ જાય છે. સ્ટ્રાન્ડ ફરીથી એક પુલ બનાવે છે, અને ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડનો 3 'છેડો ફ્લો સેલ પર ઓલિગો સાથે જોડાય છે. અનુક્રમણિકા 2 પ્રાઇમર જોડાય છે, ક્રમને પોલિમરાઇઝ કરે છે અને ધોવાઇ જાય છે. પોલિમરેઝ કમાનવાળા સ્ટ્રાન્ડની ટોચ પર પૂરક સ્ટ્રાન્ડને અનુક્રમિત કરે છે. તેઓ અલગ પડે છે, અને દરેક સ્ટ્રાન્ડનો 3 'અંત અવરોધિત થાય છે. આગળનો ભાગ ધોવાઇ જાય છે, અને સંશ્લેષણ દ્વારા ક્રમની પ્રક્રિયા રિવર્સ સ્ટ્રાન્ડ માટે પુનરાવર્તન થાય છે. માહિતીનું વિશ્લેષણ અનુક્રમણિકા લાખો ક્લસ્ટરો માટે એક જ સમયે થાય છે, અને દરેક ક્લસ્ટરમાં ડીએનએ ઇન્સર્ટની ~ 1,000 સમાન નકલો હોય છે. અનુક્રમ માહિતીનું વિશ્લેષણ ઓવરલેપિંગ વિસ્તારો સાથેના ટુકડાઓ શોધીને કરવામાં આવે છે, જેને કોન્ટિગ્સ કહેવાય છે અને તેમને ગોઠવવામાં આવે છે. જો સંદર્ભ ક્રમ જાણીતો હોય, તો પછી વિવિધ ઓળખ માટે કોન્ટિગ્સની તેની સાથે સરખામણી કરવામાં આવે છે. આ પીસમીલ પ્રક્રિયા વૈજ્ઞાનિકોને સંપૂર્ણ ક્રમ જોવાની મંજૂરી આપે છે, તેમ છતાં એક અવિભાજિત ક્રમ ક્યારેય ચલાવવામાં આવ્યો ન હતો; જો કે, કારણ કે ઈલુમિના વાંચન લંબાઈ ખૂબ લાંબી નથી (હાઈસેક અનુક્રમણિકા લગભગ 90 બી. પી. લાંબી વાંચન લંબાઈ ઉત્પન્ન કરી શકે છે), તે ટૂંકા ટેન્ડમ પુનરાવર્તન વિસ્તારોને ઉકેલવા માટે સંઘર્ષ હોઈ શકે છે. ઉપરાંત, જો ક્રમ નવો હોય અને સંદર્ભ અસ્તિત્વમાં ન હોય, તો પુનરાવર્તિત વિસ્તારો અનુક્રમ એસેમ્બલીમાં ઘણી મુશ્કેલીનું કારણ બની શકે છે. વધારાની મુશ્કેલીઓમાં અચોક્કસ પોલિમરેઝ, ચિમેરિક સિક્વન્સ અને પી. સી. આર.-બાયસ દ્વારા બેઝ અવેજી (ખાસ કરીને વાંચનના 3 'છેડે) નો સમાવેશ થાય છે, જે તમામ ખોટો ક્રમ પેદા કરવામાં ફાળો આપી શકે છે. અન્ય અનુક્રમણિકા પદ્ધતિઓ સાથે સરખામણી આ તકનીક સેંગર અનુક્રમણિકા જેવી પરંપરાગત અનુક્રમણિકા પદ્ધતિઓ કરતાં ઘણા ફાયદા પ્રદાન કરે છે. સેંગર સિક્વન્સિંગ માટે બે પ્રતિક્રિયાઓની જરૂર પડે છે, એક ફોરવર્ડ પ્રાઇમર માટે અને બીજી રિવર્સ પ્રાઇમર માટે. ઇલ્યુમિનાથી વિપરીત, સેંગર સિક્વન્સિંગ ડીએનએ ટુકડાનો ક્રમ નક્કી કરવા માટે ફ્લોરોસન્ટ લેબલવાળા ડાઇડિઓક્સિન્યુક્લિયોસાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ (ડીડીએનટીપી) નો ઉપયોગ કરે છે. ડી. ડી. એન. ટી. પી. માં 3 'ઓ. એચ. જૂથ ખૂટે છે અને ડીએનએ સંશ્લેષણને કાયમી ધોરણે સમાપ્ત કરે છે. દરેક પ્રતિક્રિયા ટ્યુબમાં, ડી. એન. ટી. પી. અને ડી. ડી. એન. ટી. પી., ડી. એન. એ. પોલિમરેઝ અને પ્રાઈમર્સ સાથે ઉમેરવામાં આવે છે. ડી. ડી. એન. ટી. પી. અને ડી. એન. ટી. પી. નો ગુણોત્તર મહત્ત્વનો છે કારણ કે નમૂના ડીએનએને સંપૂર્ણપણે સંશ્લેષણ કરવાની જરૂર છે, અને ડી. ડી. એન. ટી. પી. ની વધુ પડતી માત્રા ડીએનએ નમૂનાના સમાન કદ અને સ્થિતિના બહુવિધ ટુકડાઓ બનાવશે. જ્યારે ડીએનએ પોલિમરેઝ ડી. ડી. એન. ટી. પી. ઉમેરે છે ત્યારે ટુકડો સમાપ્ત થાય છે અને એક નવો ટુકડો સંશ્લેષણ થાય છે. સંશ્લેષિત દરેક ટુકડો છેલ્લા કરતાં એક ન્યુક્લિયોટાઇડ લાંબો હોય છે. એકવાર ડીએનએ ટેમ્પલેટ સંપૂર્ણપણે સંશ્લેષિત થઈ જાય, પછી ટુકડાઓ કેશિલરી ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ દ્વારા અલગ કરવામાં આવે છે. કેશિલરી ટ્યુબના તળિયે એક લેસર ફ્લોરોસન્ટ લેબલવાળા ડી. ડી. એન. ટી. પી. ને ઉત્તેજિત કરે છે અને કેમેરા ઉત્સર્જિત રંગને મેળવે છે. ઇલ્યુમિના ડાઈ સિક્વન્સિંગની સ્વચાલિત પ્રકૃતિને કારણે એક જ સમયે બહુવિધ સ્ટ્રેન્ડ્સને સિક્વન્સ કરવું અને વાસ્તવિક સિક્વન્સિંગ ડેટા ઝડપથી મેળવવો શક્ય છે. સેંગર સિક્વન્સિંગ સાથે, એક સમયે માત્ર એક જ સ્ટ્રાન્ડને અનુક્રમિત કરી શકાય છે અને તે પ્રમાણમાં ધીમું છે. અન્ય અનુક્રમણિકા તકનીકો દ્વારા જરૂરી બહુવિધ, ખર્ચાળ ઉત્સેચકોના વિરોધમાં ઇલ્યુમિના માત્ર ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે. પાયરોસીક્વેન્સિંગ). સંદર્ભો ડીએનએ અનુક્રમણિકા પદ્ધતિઓ