VINE-seq
VINE-SEQ (વેસલ આઇસોલેશન એન્ડ ન્યુક્લી એક્સટ્રેક્શન ફોર સિક્વન્સિંગ) એ સિંગલ-ન્યુક્લી રિઝોલ્યુશન પર માનવ મગજના માઇક્રોવેસેલ્સના વેસ્ક્યુલર અને પેરિવાસ્ક્યુલર કોષોને અલગ અને મોલેક્યુલર રીતે લાક્ષણિકતા આપવાની એક પદ્ધતિ છે. આ તકનીક વિવિધ જાણીતી પ્રયોગશાળા-આધારિત વ્યૂહરચનાઓને જોડીને પ્રાપ્ત કરવામાં આવે છે જેમાં મગજના પેશીઓના નમૂનાઓને એક કોષમાં યાંત્રિક રીતે અલગ કરવા, ઘનતા ઢાળ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન અને માઇક્રોવેસેલ્સના ન્યુક્લિયસને અલગ કરવા માટે ગાળણક્રિયા, સેલ્યુલર વસ્તીના ફ્લોરોસન્સ-એક્ટિવેટેડ સેલ સોર્ટિંગ (એફ. એ. સી.) અને ટીપાં આધારિત સિંગલ-ન્યુક્લિય આર. એન. એ. સિક્વન્સિંગ (ડ્રોપ-એસ. એન. આર. એન. એ.-એસ. ક્યુ.) નો સમાવેશ થાય છે. એકંદરે, આ મગજના વાસ્કુલેચરમાં હાજર વિવિધ પ્રકારના કોષોની સિંગલ-ન્યુક્લી ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક રૂપરેખા પેદા કરે છે. સિંગલ-ન્યુક્લી ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક ડેટાની પ્રક્રિયા અને વિશ્લેષણ દ્વારા, માનવ મગજના વાસ્કુલેચરના મોલેક્યુલર લેન્ડસ્કેપનું નિર્માણ કરવા માટે કોષના પ્રકારોની અંદર અને વચ્ચેની વિજાતીયતાને અલગ કરી શકાય છે જે અગાઉ કરવામાં આવ્યું ન હતું. પૃષ્ઠભૂમિ મગજના સ્વાસ્થ્યનું કેન્દ્રિય લક્ષણ જટિલ વાસ્કુલેચરની જાળવણી છે જે આવશ્યક ચયાપચય, ઓક્સિજન, પોષક તત્ત્વો અને કચરાને માનવ મગજમાં અને ત્યાંથી પરિવહન કરવા માટે કાર્ય કરે છે. વાસ્કુલેચરમાં વિક્ષેપ અલ્ઝાઇમર રોગ અને સ્ટ્રોક જેવી ન્યુરોલોજીકલ વિકૃતિઓ તરફ દોરી શકે છે. વાસ્કુલેચર એ એન્ડોથેલિયલ કોષો, પેરીસાઇટ્સ, એસ્ટ્રોસાઇટ્સ અને લ્યુકોસાઇટ્સ સહિત પરંતુ તે મર્યાદિત નહીં હોય તેવા કોષ પ્રકારોના વિજાતીય જૂથનું ઘર છે. જો કે વર્ષોથી વાસ્કુલેચરમાં સેલ્યુલર વિવિધતાને સમજવાના ઘણા પ્રયાસો થયા છે, પદ્ધતિસરની અને તકનીકી મર્યાદાઓએ મગજના જટિલ અસ્તિત્વને ડીકોડ કરવાની આપણી ક્ષમતામાં અવરોધ ઊભો કર્યો છે. તેથી, આ જટિલ વાતાવરણમાં વેસ્ક્યુલર અને પેરિવાસ્ક્યુલર કોશિકાઓના અપૂર્ણ લાક્ષણિકતાને કારણે ન્યુરોલોજીકલ ડિસઓર્ડર્સ માટેના અમારા સારવાર વિકલ્પો અપૂરતા રહ્યા છે. સિંગલ-સેલ આર. એન. એ. સિક્વન્સિંગ (એસ. સી. આર. એન. એ.-એસ. ઈ. ક્યુ.) માં તાજેતરની પ્રગતિ દ્વારા, ઉંદરમાં મગજના વાસ્કુલેચરના મોલેક્યુલર એટલાસને ડીકોડ કરવામાં આવ્યું છે અને માનવ મગજમાં જોવા મળતા કોષ પ્રકારોની અંદરની વિજાતીય પ્રકૃતિ ધીમે ધીમે ખુલ્લી પડી છે. આ સિદ્ધિઓ હોવા છતાં, મ્યુરિન મગજની વાસ્કુલેચર માનવ મગજની વાસ્કુલેચરને સંપૂર્ણપણે પુનરાવર્તિત કરી શકતી નથી, જે અનુવાદની ક્ષમતાની ચિંતા તરફ દોરી જાય છે. વધુમાં, માનવ મગજના એસ. સી. આર. એન. એ.-સેક પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરતા અગાઉના ઘણા અભ્યાસો વાસ્કુલેચરમાં સેલ્યુલર વિજાતીયતાની લાક્ષણિકતા દર્શાવતા નથી. VINE-SEQ નામની નવીન પદ્ધતિ રજૂ કરીને, એક સંશોધન જૂથે મગજના સૂક્ષ્મ વાહિનીઓમાંથી અખંડ કેન્દ્રકને અલગ કરવાની પદ્ધતિ વિકસાવી. આ પરિપૂર્ણ કરવા માટે, તેમને ન્યુક્લિયસને નુકસાન પહોંચાડ્યા વિના માઇક્રોવેસેલ્સની આસપાસના બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સ (ઇસીએમ) ને દૂર કરવાના પડકારને દૂર કરવો પડ્યો હતો. હિપ્પોકેમ્પસ અને આચ્છાદનમાંથી સ્થિર મગજની પેશીઓ પર VINE-SEQ નો ઉપયોગ કરીને, તેઓએ સિંગલ-ન્યુક્લી રિઝોલ્યુશન પર માનવ મગજના વાસ્કુલેચરમાં વિવિધ પ્રકારના કોષોની પ્રથમ લાક્ષણિકતા પ્રદાન કરી. પદ્ધતિશાસ્ત્ર વાઇન-સેક એ માનવ મગજના વાસ્કુલેચરને વિગતવાર જણાવવા માટેની એક નવીન પદ્ધતિ છે. તે મગજની અંદર વાહિની અને પેરિવાસ્ક્યુલર કોષ પ્રકારોના એટલાસની રચના કરવા માટે સિંગલ-ન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ સાથે પ્રયોગશાળા પદ્ધતિઓના સંયોજનનો ઉપયોગ કરે છે. નીચેના પગલાંઓ VINE-Seq પ્રોટોકોલના આધારની વિગત આપે છેઃ પ્રોટોકોલના પ્રારંભિક ભાગમાં સ્પ્લેનોસાઇટ અલગતા અને નમૂનાની સફાઇમાંથી સ્વીકારવામાં આવેલી પદ્ધતિનો સમાવેશ થાય છે. વાઇન-સેક માટે, માનવ મગજની પેશીઓ શરૂઆતમાં પોસ્ટમોર્ટમ પછી કાઢવામાં આવે છે. સંશોધકોએ હિપ્પોકેમ્પસ અને બહેતર આગળના આચ્છાદનમાંથી મગજની પેશીઓ કાઢી હતી. જ્યાં સુધી સંપૂર્ણપણે મિશ્રિત ન થાય અને કોઈ દૃશ્યમાન પેશી ન રહે ત્યાં સુધી પેશીના નમૂનાઓને એકરૂપ કરવામાં આવે છે. એચ. બી. એસ. એસ. માં નમૂનાઓને 32 ટકા ડેક્સટ્રાન દ્રાવણ સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવે છે. કન્ડેન્સ્ડ વેસ્ક્યુલેચર ધરાવતી ગોળી સાથે સેલ્યુલર સ્તરોને અલગ કરવા માટે 20 મિનિટ માટે 4,400 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન કરવામાં આવે છે. પેલેટને ખલેલ પહોંચાડ્યા વિના માઇલિન અને પેરેન્કાઇમલ કોષોના બાકીના સ્તરો એસ્પિરેટેડ થાય છે. ગોળીઓને ડેક્સ્ટ્રાન દ્રાવણમાં ફરીથી સ્થગિત કરવામાં આવે છે. સેલ્યુલર કાટમાળમાંથી ગોળીને વધુ શુદ્ધ કરવા માટે પી. બી. એસ. સાથે ધોવાની શ્રેણી કરવામાં આવે છે. સૂક્ષ્મ જહાજો ખુલ્લા પાડવામાં આવે છે અને બાકીના કોષીય કાટમાળને દૂર કરવામાં આવે છે. માઉસ સ્પ્લેનોસાઇટ્સને બહાર કાઢવા માટે રચાયેલ પદ્ધતિને અપનાવવામાં આવી હતી અને બાકીના વાહિની કોષોમાંથી કેન્દ્રકને અલગ કરવામાં મદદ કરવા માટે કરવામાં આવી હતી. 10 મિનિટ માટે 500 ગ્રામ પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન વેસ્ક્યુલર કોષોને ન્યુક્લિયસથી અલગ કરવા માટે કરવામાં આવે છે અને લિસિસ બફર, આરએનએઝ અવરોધક અને ઇડીટીએ-મુક્ત પ્રોટીઝ અવરોધકના દ્રાવણમાં ફરીથી સ્થગિત કરવામાં આવે છે. ત્યારબાદ કાચ ડાઉન્સર્સનો ઉપયોગ કરીને ન્યુક્લિયસને એકરૂપ કરવામાં આવે છે. સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા નમૂનાઓને ફરી એકવાર પેલેટ કરવામાં આવે છે. બાકીના કોષીય કાટમાળ અને આડપેદાશોને સુક્રોઝ ગ્રેડિયન્ટ વોશ અને ફ્લોરોસન્સ-એક્ટિવેટેડ સેલ સોર્ટિંગ (એફએસીએસ) નો ઉપયોગ કરીને ઘટાડવામાં આવે છે. ગોળીઓને ઉચ્ચ ગુણવત્તાની માહિતી આપવામાં મદદ કરવા માટે શુદ્ધ કરવામાં આવે છે. ફ્લો સાયટોમેટ્રીનો ઉપયોગ બાકીના ન્યુક્લિયસ માટે થાય છે. આ તકનીકનો ઉપયોગ વેસ્ક્યુલર ન્યુક્લિયસના ભૌતિક અને રાસાયણિક ગુણધર્મો નક્કી કરવા માટે થાય છે. ફ્લો સાયટોમેટ્રીના પ્રયોગશાળા રન અપેક્ષિત મૂલ્યોથી 3.4 ગણા વધુ પડતા અંદાજિત છે. જવાબમાં, સંશોધકોએ નમૂના દીઠ આશરે 10,000 ન્યુક્લિયસ મેળવવા માટે વધુ ન્યુક્લિયસને અલગ અને સૉર્ટ કર્યા. ફ્લો સોર્ટિંગ પછી, ટીપાં આધારિત એસ. એન. આર. એન. એ.-એસ. ઈ. ક્યુ. લાઈબ્રેરીઓ કરવા માટે નમૂના દીઠ 10,000 ન્યુક્લિયસની જરૂર પડે છે. અનુક્રમણિકા માટે ટીપાં આધારિત એસ. એન. આર. એન. એ.-એસ. ઈ. ક્યુ. પુસ્તકાલયો તૈયાર કરવામાં આવે છે. પી. સી. આર. ના 15 ચક્ર પછી પર્યાપ્ત સી. ડી. એન. એ. મેળવવામાં આવે છે. સંશોધકોએ નોવાસેક 6000 પર S4 લેન પર વેસ્ક્યુલર ન્યુક્લિયસને સફળતાપૂર્વક અનુક્રમિત કર્યા. એપ્લિકેશન્સ બ્રેઇન મેપિંગ તેમના પ્રયોગો અને ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક વિશ્લેષણ દ્વારા, વાઇન-સેકના લેખકો અને નિર્માતાઓએ શોધ્યું કે પદ્ધતિઓની શ્રેણી તંદુરસ્ત માનવ મગજની પેશીઓમાં ધમનીની સંસ્થામાં હાજર વેસ્ક્યુલર એન્ડોથેલિયલ અને સરળ સ્નાયુ કોશિકાઓની ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અભિવ્યક્તિને સ્પષ્ટ કરવામાં સક્ષમ હતી. વધુમાં, VINE-SEQ મેટ્રિક્સ પેરીસાઇટ્સ અને પરિવહન પેરીસાઇટ્સ તરીકે ઓળખાતી પેરીસાઇટ્સની બે નવીન પેટા વસ્તીને કબજે કરવામાં સક્ષમ હતી, જે અનુક્રમે ઇસીએમ મોડ્યુલેશન અને ટ્રાન્સમેમ્બ્રેન પરિવહનમાં સામેલ હોઈ શકે છે. અલ્ઝાઇમર રોગ VINE-SEQ નો ઉપયોગ કરીને, આ સંશોધકો અલ્ઝાઇમર રોગ (AD) માં માનવ મગજના વાસ્કુલેચરના પરમાણુ આધારને ઉઘાડું કરવામાં મદદ કરવામાં સક્ષમ હતા. તેઓએ દર્શાવ્યું હતું કે એડી-સંકળાયેલ જનીનો વેસ્ક્યુલર કોષના પ્રકારોમાં ખૂબ જ વ્યક્ત થયા હતા અને સામાન્ય મગજના નમૂનાઓની તુલનામાં એડી મગજના નમૂનાઓમાં એન્ડોથેલિયલ કોષો, સરળ સ્નાયુ કોષો અને પેરિવાસ્ક્યુલર ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ કોષોની વિપુલતામાં જનીન અભિવ્યક્તિમાં ફેરફાર અથવા નુકસાન થાય છે. વધુ એપ્લિકેશનો વાઇન-સેક મૂળરૂપે માનવ મગજના વાસ્કુલેચરનો નકશો બનાવવા માટે બનાવવામાં આવ્યો હતો, કારણ કે હાલમાં કોઈ પરમાણુ નકશો અસ્તિત્વમાં નથી. જ્યારથી 2021 માં VINE-SEQ રજૂ કરતા પેપરની પ્રી-પ્રિન્ટ ઉપલબ્ધ થઈ ત્યારથી, મગજના વાસ્કુલેચર વિશેના આપણા જ્ઞાનને વિસ્તૃત કરવામાં તેના યોગદાન માટે મોલેક્યુલર નકશાને માન્યતા આપવામાં આવી છે, જે મગજના રોગોના વધુ ઊંડાણપૂર્વકના અભ્યાસને મંજૂરી આપશે અને સંભવિત રીતે મગજમાં દવા પહોંચાડવાના પડકારને દૂર કરશે. VINE-SEQ દ્વારા પેદા થયેલા ડેટાની કેટલીક એપ્લિકેશનોએ AD, ડિમેન્શિયા, ઇસ્કેમિક સ્ટ્રોક અને મગજ પર ગંભીર COVID-19 ની અસરોના પેથોજેનેસિસમાં આપણા જ્ઞાનને આગળ વધારવામાં ફાળો આપ્યો છે. ફાયદા અને ગેરફાયદા અગાઉની સિંગલ-ન્યુક્લી અલગતા તકનીકો કરતાં વધુ સેરેબ્રોવાસ્ક્યુલર ન્યુક્લીઓને અલગ પાડે છે ન્યુક્લીના વધુ સારા અલગતાને કારણે વાસ્કુલેચરમાં દુર્લભ કોષોને પકડે છે એન્ઝાઇમેટિક વિયોજનને ટાળીને જનીન અભિવ્યક્તિમાં ફેરફારની અસરને ઘટાડે છે સ્થિર સંગ્રહિત મગજની પેશીઓને લાગુ પડે છે ગેરફાયદા કોષના પ્રકારોની લાક્ષણિકતા જાણીતા પરમાણુ માર્કર્સ સુધી મર્યાદિત છે ન્યુક્લીને અલગ કરીને સાયટોપ્લાઝમિક ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક માહિતીની ખોટ આરએનએના પરમાણુ છિદ્રોમાંથી સંભવિત લીકને કારણે, આમ કેટલાક નિર્ણાયક આરએનએ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ સંદર્ભો ડીએનએ સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિઓ ગુમાવે છે