Ribose-seq
રાઇબોઝ-સેક એ આનુવંશિક ડીએનએમાં એમ્બેડેડ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ, ખાસ કરીને રિબોન્યુક્લિયોસાઇડ મોનોફોસ્ફેટ (આરએનએમપી) ની સંપૂર્ણ રૂપરેખા નક્કી કરવા માટે આનુવંશિક સંશોધનમાં ઉપયોગમાં લેવાતી મેપિંગ તકનીક છે. એમ્બેડેડ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સને કોષોમાં ડીએનએમાં સૌથી સામાન્ય ફેરફાર માનવામાં આવે છે, અને જીનોમિક ડીએનએમાં તેમની હાજરી જીનોમ સ્થિરતાને અસર કરી શકે છે. જેમ કે તાજેતરના અભ્યાસોએ સૂચવ્યું છે કે ઉંદરના ડીએનએમાં રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ રોગવિજ્ઞાનને અસર કરી શકે છે, જીનોમિક ડીએનએમાં રિબોન્યુક્લિયોટાઇડનો સમાવેશ તબીબી આનુવંશિક સંશોધનનું એક મહત્વપૂર્ણ લક્ષ્ય બની ગયું છે. રાઇબોઝ-સેક વૈજ્ઞાનિકોને યુકેરીયોટિક અથવા પ્રોકેરીયોટિક ડીએનએમાં સમાવિષ્ટ કરવામાં આવેલા રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સનું ચોક્કસ સ્થાન અને પ્રકાર નક્કી કરવાની મંજૂરી આપે છે. આ તકનીક રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સના 2 'છેડે જોવા મળતા વધારાના હાઇડ્રોક્સિલ જૂથો (OH) ની હાજરીનો ઉપયોગ કરે છે, જે DNAને વિકૃત અને અસ્થિર કરી શકે છે. આ તકનીક જ્યોર્જિયા ઇન્સ્ટિટ્યૂટ ઓફ ટેક્નોલોજીના સંશોધકોના જૂથ સાથે સહયોગ દ્વારા વિકસાવવામાં આવી હતી જેમાં ફ્રાન્સેસ્કા સ્ટોરિસી અને ક્યુંગ ડુક કોહ (હવે યુનિવર્સિટી ઓફ કેલિફોર્નિયા સાન ફ્રાન્સિસ્કો ખાતે) અને યુનિવર્સિટી ઓફ કોલોરાડો એન્સચુટ્ઝ મેડિકલ સ્કૂલના જય હેસેલબર્થનો સમાવેશ થાય છે. ન્યુક્લિક એસિડ એ આવશ્યક મેક્રોમોલેક્યુલ્સ છે જે તમામ જીવન સ્વરૂપોમાં આનુવંશિક માહિતી ધરાવે છે. આ બાયોપોલિમરમાં ન્યુક્લિયોટાઇડ મોનોમર્સનો સમાવેશ થાય છે, જે કાર્બનિક અણુઓ છે જેમાં ફોસ્ફેટ જૂથ, નાઇટ્રોજન ધરાવતો આધાર અને પાંચ કાર્બન ખાંડ (રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સમાં રાઇબોઝ અને ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સમાં ડીઓક્સીરીબોઝ) નો સમાવેશ થાય છે. જ્યારે રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ સામાન્ય રીતે રિબોન્યુક્લિક એસિડ (આર. એન. એ.) માં સ્થિત હોય છે, ત્યારે તે ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિક એસિડ (ડી. એન. એ.) માં પણ મળી શકે છે. ડીએનએમાં જડિત રિબોન્યુક્લિયોસાઇડ મોનોફોસ્ફેટ (આરએનએમપી) ની પ્રથમ શોધ 1973માં લોરેન્સ ગ્રોસમેન, રોબર્ટ વોટસન અને જેરોમ વિનોગ્રેડ દ્વારા માઉસ અને માનવ કોષોમાંથી મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએમાં થઈ હતી. 2006 માં, સ્કિઝોસેકરોમાઇસીસ પોમ્બે ("ફિશન યીસ્ટ") ના પરમાણુ ડીએનએમાં આરએનએમપીની હાજરીની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી, અને ત્યારથી અન્ય પ્રજાતિઓમાં સંશોધન ચાલુ છે. ડીએનએમાં રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો સમાવેશ બહુવિધ અભ્યાસોએ એવી પદ્ધતિઓ ઓળખી છે જેના દ્વારા રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ ડીએનએમાં ઉમેરી શકાય છે, દૂર કરી શકાય છે અથવા ઉત્પન્ન કરી શકાય છે. મુખ્યત્વે, ડીએનએ સંશ્લેષણ પ્રક્રિયા દરમિયાન ડીએનએમાં રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો સમાવેશ થાય છે. ડીએનએ પ્રતિકૃતિ શરૂ કરવા માટે, ટૂંકા આરએનએ પ્રાઇમરને પૂરક ડીએનએ પર સંશ્લેષિત કરવામાં આવે છે જેથી પ્રાથમિક પ્રતિકૃતિ ઉત્સેચકો, ડીએનએ પોલિમરેઝની અનુગામી બંધન અને પ્રતિકૃતિ ક્રિયા માટે પરવાનગી મળે. લાક્ષણિક રીતે, આ પ્રાઇમર પછી ન્યુક્લીઝ ઉત્સેચકો, આર. એન. એસ. એચ. અથવા ફ્લેપ સ્ટ્રક્ચર-સ્પેસિફિક એન્ડોન્યુક્લીઝ 1 (એફ. ઇ. એન. 1) દ્વારા દૂર કરવામાં આવે છે. જેમ કે, ક્ષણિક આર. એન. એમ. પી. નું એકદમ નોંધપાત્ર પ્રમાણ છે જે આર. એન. એ. પ્રાઇમરના સ્વરૂપમાં ડીએનએમાં હાજર હોય છે અને પછી દૂર કરવામાં આવે છે. ડીએનએ પ્રતિકૃતિ શરૂ થયા પછી, આરએનએમપીને ડીએનએ પોલિમરેઝ દ્વારા ડીએનએમાં સંપૂર્ણ રીતે સમાવિષ્ટ કરી શકાય છે અને આ 1,000 ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડ દીઠ 1 થી વધુ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ સાથે ડીએનએમાં રિબોન્યુક્લિયોટાઇડના સમાવેશની મુખ્ય પદ્ધતિને રજૂ કરે છે. એમ્બેડેડ આર. એન. એમ. પી. ને ઘણીવાર રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ એક્સિશન રિપેર (આર. ઈ. આર.) પદ્ધતિ દ્વારા દૂર કરવા માટે લક્ષિત કરવામાં આવે છે. જો કે, જો આર. ઈ. આર. યોગ્ય રીતે કામ કરતું નથી, તો આ ડીએનએમાં જડિત આર. એન. એમ. પી. નો વધુ સતત સ્રોત બની શકે છે. અન્ય એક પદ્ધતિ જેના દ્વારા ડીએનએમાં આરએનએમપી ઉત્પન્ન થઈ શકે છે તે ઓક્સિડેટીવ સ્ટ્રેસ દ્વારા છે, જે ડીએનએમાં ડીઓક્સીરીબોઝ એકમને રાઇબોઝમાં બદલે છે. જ્યારે આર. ઈ. આર. માર્ગ એ ડીએનએમાંથી આર. એન. એમ. પી. ને દૂર કરવા માટેની સૌથી કાર્યક્ષમ પ્રક્રિયા છે, ત્યારે રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સને 3 '-5' એક્સોન્યુક્લીઝ પ્રવૃત્તિ દ્વારા પણ દૂર કરી શકાય છે જે ડીએનએ પ્રતિકૃતિ દરમિયાન ડીએનએ પોલિમરેઝની પ્રૂફરીડિંગ પ્રવૃત્તિઓ દ્વારા ગોઠવવામાં આવે છે. વધારાની આર. એન. એમ. પી. દૂર કરવાની પદ્ધતિઓમાં ચીસોનો સમાવેશ થાય છે જે આઇસોમરેઝ એન્ઝાઇમ, ટોપોઆઇસોમરેઝ I દ્વારા મધ્યસ્થી કરવામાં આવે છે. ડીએનએમાં રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સના પરિણામો જો દૂર કરવામાં ન આવે અને બદલવામાં ન આવે, તો ડીએનએમાં રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓ પર માળખાકીય, રાસાયણિક અને કાર્યાત્મક અસરો કરી શકે છે. જેમ કે સૌપ્રથમ ટી. એન. 1993માં જેસિહરી એટ અલ, રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સની હાજરી ડીએનએના હેલિકલ આકારને બી સ્વરૂપથી એ સ્વરૂપમાં બદલી શકે છે. આ, સંખ્યાબંધ અન્ય રાસાયણિક પરિણામો ઉપરાંત, ડીએનએ સાથે પ્રોટીનના બંધનને અસર કરી શકે છે અને ક્રોમેટિન ગતિશીલતા, ડીએનએ પ્રતિકૃતિ, અનુલેખન, સમારકામ અને અર્ધસૂત્રણ જેવી પ્રક્રિયાઓ માટે અસરો ધરાવે છે. વધુમાં, કેટલાક ડીએનએ પોલિમરેઝ ડીએનએ પ્રતિકૃતિ દરમિયાન એમ્બેડેડ આરએનએમપીને બાયપાસ કરવામાં અસમર્થ હોય છે, જે આરએનએમપીના લાંબા તારવાળા સ્થળો પર વધુ તીવ્ર બને છે. આ પ્રતિકૃતિ તણાવનું કારણ બની શકે છે જે સંભવિત રીતે અનુલેખન, રંગસૂત્ર વિભાજન અને ભાવિ પ્રતિકૃતિમાં દખલ કરી શકે છે. વધુમાં, આરઈઆર પ્રક્રિયામાં અમુક આડપેદાશો અથવા નિષ્ફળતાઓ પણ સંભવિત રીતે ડીએનએ વિરામ, પુનઃગોઠવણી અને જીનોમ અસ્થિરતા તરફ દોરી શકે છે. રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ મેપિંગ 2015 સુધીમાં, ડીએનએમાં આરએનએમપીના સમાવેશ માટેની કેટલીક પદ્ધતિઓ, તેના પરિણામો અને અંદાજિત દર વધુને વધુ સ્પષ્ટ થઈ રહ્યા હતા. જો કે, સમગ્ર જિનોમમાં આર. એન. એમ. પી. ના સ્થાનને ઓળખવાની તકનીકનો હજુ પણ અભાવ હતો. આગામી પેઢીની અનુક્રમણિકા તકનીકોની વધતી સુલભતાએ મોટા ભાગે સમગ્ર જીનોમિક ડીએનએમાં આરએનએમપીની વધુ ચોક્કસ ઓળખના લક્ષ્ય તરફની પ્રગતિને સરળ બનાવી છે. 2015માં, ક્યુંગ ડુક કોહ, સત્ય બાલાચંદર, જય આર હેસેલબર્થ અને ફ્રાન્સેસ્કા સ્ટોરિસીએ ડીએનએમાં આરએનએમપીની વ્યવસ્થિત રૂપરેખા માટે નવી વિકસિત તકનીક રાઇબોઝ-સેક રજૂ કરી હતી. તેઓએ સમગ્ર મિટોકોન્ડ્રીયલ અને ન્યુક્લિયર ડીએનએમાં આર. એન. એમ. પી. ની જીનોમ-વ્યાપી ઓળખ, આવર્તન અને સ્થાનિકીકરણનું દસ્તાવેજીકરણ કરવા માટે સેક્રોમાઇસીસ સેરેવિસિયા જિનોમમાં રાઇબોઝ-સેક લાગુ કર્યો. આ તારણો આખરે સમગ્ર જિનોમમાં આર. એન. એમ. પી. ના સમાવેશની પેટર્નમાં નવી સમજ પૂરી પાડે છે. રાઇબોઝ-સેકની સમાંતર, ડીએનએમાં જડિત આરએનએમપીની સાઇટ્સને પકડવા માટે અન્ય ત્રણ તકનીકો વિકસાવવામાં આવી હતીઃ એમરીબો-સેક, હાઈડેન-સેક અને પુ-સેક. રાઇબોઝ-સેક પ્રક્રિયા ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગની તૈયારીમાં રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સને પકડવા અને ટેગ કરવા માટે સંખ્યાબંધ અનન્ય સુવિધાઓનો ઉપયોગ કરે છે. આર. એન. એમ. પી. સાઇટ્સને સીધા લક્ષ્ય બનાવવા માટે, લેખકોએ આલ્કલી સારવાર પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કર્યો હતો જે આર. એન. એમ. પી. સાઇટ્સ પર ડીએનએને વિકૃત કરે છે અને વિભાજીત કરે છે. રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ પર હાજર વધારાના હાઈડ્રોક્સિલ જૂથને કારણે આ સ્થળોએ ક્લેવેજ માટેની વિશિષ્ટતા આ પ્રદેશમાં અણુની સંબંધિત સંવેદનશીલતા દ્વારા સંચાલિત થાય છે. આ નાના ટુકડાઓની સ્થિરતા અને સંવર્ધનને મંજૂરી આપવા અને પી. સી. આર. વિસ્તરણ પહેલાં ટી5 એક્સોન્યુક્લીઝ પાચનથી રક્ષણ આપવા માટે, સિંગલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ ટુકડાઓ-રસના આરએનએમપી અને એક અનન્ય મોલેક્યુલર આઇડેન્ટિફિકેશન નંબર ધરાવતા-સિંગલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ (એસએસડીએનએ) વર્તુળો રચવા માટે સ્વ-મર્યાદિત છે. આર. એન. એમ. પી. અને ડી. એન. એ. અંતના બંધનને સરળ બનાવવા માટે, કોહ એટ અલ. 2 '-ફોસ્ફેટ (આર. એન. એમ. પી. બાજુ) ને 5'-ફોસ્ફેટ (ડી. એન. એ. બાજુ) સાથે જોડવાની મંજૂરી આપવા માટે અરેબિડોપ્સિસ થાલિયાના ટી. આર. એન. એ. લિગેઝ (એ. ટી. આર. એન. એલ.) ની વિશિષ્ટ બંધન ક્રિયાનો ઉપયોગ કરો. છેવટે, આ તકનીકમાંથી સમગ્ર જનરેટેડ લાઈબ્રેરીનું હાઇ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ તમામ કેપ્ચર કરેલા એમ્બેડેડ આરએનએમપીના જીનોમિક કોઓર્ડિનેટ્સને ઓળખે છે. 2019 માં, સ્ટોરિસી લેબએ રાઇબોઝ-સેક્ માટે અદ્યતન અને વધુ ઑપ્ટિમાઇઝ પ્રોટોકોલ રજૂ કર્યો હતો. ફેરફારોમાં ટૂંકા મોલેક્યુલર બારકોડ એડેપ્ટર, નાના ટુકડાઓ, બદલાયેલ પી. સી. આર. સેટિંગ્સ અને જેલમાંથી કાપવા અને શુદ્ધ કરવા માટે સમાયોજિત કદ શ્રેણીનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. એકંદરે, એવું સૂચન કરવામાં આવ્યું હતું કે સુધારેલ પ્રોટોકોલ મોટા જીનોમમાં ઉપયોગ માટે પદ્ધતિની કાર્યક્ષમતામાં નોંધપાત્ર વધારો કરી શકે છે. પદ્ધતિઓ તૈયારી જીનોમિક ડીએનએ નિષ્કર્ષણ રસના કોષોમાંથી જીનોમિક ડીએનએ કાઢવા માટે, કોષોને પહેલા યાંત્રિક અથવા રાસાયણિક પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને જોડવા જોઈએ. આ દરેક કોષના કેન્દ્રમાંથી ડીએનએ મુક્ત કરે છે, જેનાથી તેને શુદ્ધ અને માત્રાત્મક કરી શકાય છે. રાઇબોઝ-સેક પ્રોટોકોલ માટે કુલ 10યુજી ડીએનએ જરૂરી છે. રાઇબોઝ-સેક એડેપ્ટરની તૈયારી રાઇબોઝ-સેક એડેપ્ટર એક ડીટી (ડીઓક્સિરાઇબોન્યુક્લિયોટાઇડ થાઇમિન) થી બનેલું હોય છે, ત્યારબાદ એનીલિંગ ક્રમ, બે પ્રાઇમર ક્રમ અને એક અનન્ય પરમાણુ ઓળખકર્તા (યુએમઆઈ) હોય છે. રાઇબોઝ-સેક એડેપ્ટર તૈયાર કરવા માટે, ત્રણ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (ઓલિગોસ) ને દ્રાવણમાં ઉમેરવામાં આવે છે અને 95-100 °C સુધી ગરમ કરવામાં આવે છે. આ તાપમાન પર, ઓલિગો સિક્વન્સ એકબીજા સાથે અથડાય છે, જે રાઇબોઝ-સેક્ એડપ્ટર્સનું સસ્પેન્શન બનાવે છે. પછી ડિસેલ્ટેડ ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ રાઇબોઝ-સેક એડેપ્ટરની માત્રાનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવે છે. રાઇબોઝ-સેક માટે 10 યુ. એમ. ની સાંદ્રતા જરૂરી છે. જીનોમિક ડીએનએના રાઇબોઝ-સેક ફ્રેગમેન્ટેશનને બ્લન્ટ-એન્ડેડ રીસ્ટ્રિકશન એન્ઝાઇમ પાચનનો ઉપયોગ કરીને વિભાજિત કરવામાં આવે છે. પાચન પછી, ખંડિત ડીએનએ શુદ્ધ થાય છે અને તેનું પ્રમાણ નક્કી થાય છે. આરએનએમપી કેપ્ચર તકનીકો (આરઈએસસીઓટી) માટે પ્રતિબંધ એન્ઝાઇમ સેટ અને સંયોજન ઓપ્ટિમાઇઝેશન ટૂલ્સ આરએનએમપી કેપ્ચર દરને મહત્તમ કરવા માટે વિકસાવવામાં આવ્યા હતા. પરિણામી દ્રાવણમાં 500-થી 3,000-બી. પી. જીનોમિક ટુકડાઓની વસ્તી હોય છે, જેનું સરેરાશ કદ ~ 1.5 કે. બી. હોય છે. અનુગામી ડી. એ.-ટેઇલિંગ અને એડેપ્ટર બંધન માટે ફ્રેગમેન્ટેડ જીનોમિક ડીએનએના 10ગની જરૂર પડે છે. ડી. એ.-ટેઇલિંગ અને એડેપ્ટર બંધન ડી. એ. અણુઓ દરેક ટુકડાની પૂંછડીઓ સાથે બંધાયેલા હોય છે, જે રાઇબોઝ-સેક એડેપ્ટરના ડી. ટી. ને અનુગામી પગલામાં તેની અનુરૂપ ડી. એ. પૂંછડીને બાંધવાની મંજૂરી આપે છે. આ પ્રક્રિયાને અનુસરીને, ડી. એ.-પૂંછડીના ડી. એન. એ. ને શુદ્ધ કરવામાં આવે છે અને પાણીથી દૂર કરવામાં આવે છે. રાઇબોઝ-સેક એડેપ્ટર, જેમાં તેનું રેન્ડમાઇઝ્ડ 8-બેઝ યુનિક મોલેક્યુલર આઇડેન્ટિફાયર (યુએમઆઈ) અને સિંગલ ડીટી ઓવરહેંગ હોય છે, તેને પછી રાતોરાત દ્રાવણને 15 ડિગ્રી સેલ્સિયસ સુધી ઠંડુ કરીને લક્ષ્ય ટુકડાના ડીએ અંત સાથે જોડવામાં આવે છે. ત્યારબાદ નમૂનાને શુદ્ધ કરવામાં આવે છે અને ક્ષારની સારવાર માટે તૈયાર કરવામાં આવે છે. ક્ષારની સારવાર ક્ષારની સારવાર દરમિયાન, ડબલ સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ (ડી. એસ. ડી. એન. એ.) ને સોડિયમ હાઇડ્રોક્સાઇડ સાથે સારવાર કરવામાં આવે છે, જે એક મજબૂત આધાર છે, જે ડી. એસ. ડી. એન. એ. ને વિકૃત કરે છે અને એમ્બેડેડ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ સાઇટ્સ પર ડીએનએને વિભાજીત કરે છે. આ ખુલ્લા બે છેડા સાથે સિંગલ-સ્ટ્રેન્ડેડ ડીએનએ (એસએસડીએનએ) ટુકડાઓ ઉત્પન્ન કરે છેઃ એક 2′, 3′-ચક્રીય ફોસ્ફેટ અંત અને વિરુદ્ધ 5′-હાઇડ્રોક્સિલ અંત. પછી આલ્કલાઇન દ્રાવણને તટસ્થ કરવામાં આવે છે, અને એસ. એસ. ડી. એન. એ. શુદ્ધ થાય છે. સ્વ-બંધન (પરિપત્ર) આગળ, એસ. એસ. ડી. એન. એ. ધરાવતા દ્રાવણને અરેબિડોપ્સિસ થાલિયાના ટી. આર. એન. એ. લિગેઝ (એ. ટી. આર. એન. એલ. 24) સાથે સેવન કરવામાં આવે છે. એ. ટી. આર. એન. એલ. આર. એન. એ. ના 2 ', 3'-ચક્રીય ફોસ્ફેટના છેડાઓને 2 '-ફોસ્ફેટમાં રૂપાંતરિત કરીને એ. થાલિનાના આર. આર. એન. એ. પરિપક્વતામાં મદદ કરે છે અને તેને આર. એન. એ. અથવા ડી. એન. એ. ના 5'-ફોસ્ફેટના છેડા સાથે જોડે છે. એ. ટી. આર. એન. એલ. ને એસ. એસ. ડી. એન. એ. દ્રાવણમાં રજૂ કરવાથી એસ. એસ. ડી. એન. એ. ના સ્વ-બંધનને ઉત્પ્રેરિત કરે છે કારણ કે 2 ', 3' ચક્રીય ફોસ્ફેટ સમાન એસ. એસ. ડી. એન. એ. સ્ટ્રાન્ડના 5 'ફોસ્ફેટના છેડા સુધી લંબાય છે. પરિણામી ચક્રીય એસ. એસ. ડી. એન. એ. માળખામાં લક્ષિત એમ્બેડેડ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ ક્રમ, એક યુ. એમ. આઈ. અને ઓલિગો ક્રમ હોય છે જે બાકીના ગોળાકાર એસ. એસ. ડી. એન. એ. માળખાને બનાવે છે. રેખીય એસ. એસ. ડી. એન. એ. ને દૂર કરવું સ્વ-બંધન દ્વારા બનાવવામાં આવેલી ગોળાકાર એસ. એસ. ડી. એન. એ. રચનાઓ એન્ઝાઇમ ટી5 એક્સોન્યુક્લીઝ દ્વારા અધોગતિ સામે પ્રતિરોધક છે. જો કે, અનિયમિત, રેખીય ssDNA નથી. તેથી, ઉત્પાદનો અને બાકીના ડીએનએ ટુકડાઓને T5 એક્સોન્યુક્લીઝ સાથે સારવાર કરવાથી પસંદગીયુક્ત રીતે અનિયમિત, રેખીય ssDNA સેરનું અધઃપતન થાય છે, જ્યારે સ્વ-મર્યાદિત ssDNA વર્તુળો અકબંધ રહે છે. આ રીતે, અનિચ્છનીય રેખીય ssDNA ટુકડાઓ અધોગતિ પામે છે અને માત્ર સફળતાપૂર્વક બંધાયેલા ssDNA વર્તુળો જ રહે છે. 2 'ફોસ્ફેટને દૂર કરવું પી. સી. આર. શક્ય બને તે પહેલાં, એસ. એસ. ડી. એન. એ. વર્તુળોના બંધાયેલા જોડાણો પરના 2' ફોસ્ફેટ જૂથોને દૂર કરવા આવશ્યક છે. આ પરિપૂર્ણ કરવા માટે, વર્તુળાકાર એસ. એસ. ડી. એન. એ. દ્રાવણને 2 'ફોસ્ફોટ્રાન્સફેરેઝ, ટી. પી. ટી. 1 સાથે પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે, જે બંધન જંક્શન પર બાકી રહેલા 2' ફોસ્ફેટને દૂર કરે છે. પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (પી. સી. આર.) રાઇબોઝ-સેક પછી, પી. સી. આર. એમ્પ્લીફિકેશનનો ઉપયોગ કરીને દરેક એસ. એસ. ડી. એન. એ. વર્તુળ પર એમ્પ્લીફિકેશન કરવામાં આવે છે. પી. સી. આર. ના પ્રથમ રાઉન્ડમાં, દ્રાવણમાં ક્રમાંકન પ્રાઇમર દાખલ કરવામાં આવે છે અને એસ. એસ. ડી. એન. એ. વર્તુળો વિસ્તૃત થાય છે. પસંદ કરેલ સિક્વન્સિંગ પ્રાઈમર્સ પસંદગીના ટાર્ગેટ લાઈબ્રેરી સાથે સુસંગત હોવા જોઈએ. વિગતો માટે અરજીઓ વિભાગ જુઓ. પી. સી. આર. ના બીજા રાઉન્ડમાં, વધુ ચોક્કસ સિક્વન્સિંગ પ્રાઈમર્સ રજૂ કરવામાં આવે છે, અને એસ. એસ. ડી. એન. એ. વર્તુળો વધુ વિસ્તૃત કરવામાં આવે છે. પોલીએક્રિલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ (PAGE) રાઇબોઝ-સેક લાયબ્રેરીની હાજરીની પુષ્ટિ કરવા અને હકારાત્મક અને નકારાત્મક નિયંત્રણોની તપાસ કરવા માટે કરવામાં આવે છે. કદની પસંદગી અને જેલ શુદ્ધિકરણ જેલ શુદ્ધિકરણનો ઉપયોગ અનુક્રમણિકા પહેલાં રાઇબોઝ-સેક લાઇબ્રેરીને શુદ્ધ કરવા માટે થાય છે. આ તબક્કે, રસના લક્ષ્ય કદની શ્રેણીની બહાર આવતા ટુકડાઓને દૂર કરવા માટે લંબાઈ દ્વારા ટુકડાઓ પસંદ કરવામાં આવે છે. ડાઉનસ્ટ્રીમ કાર્યક્રમો માટે ઉપયોગ રસના ક્રમને કબજે કર્યા પછી અને શુદ્ધ કર્યા પછી, નમૂનાઓને અનુક્રમિત કરી શકાય છે અને ડાઉનસ્ટ્રીમ કાર્યક્રમો માટે ઉપયોગ કરી શકાય છે. વિગતો માટે અરજીઓ વિભાગ જુઓ. રાઇબોઝ-સેક અસંખ્ય સંજોગોમાં અને વિવિધ યુકેરીયોટિક પ્રજાતિઓના ઘણા કોષ પ્રકારો માટે લાગુ કરી શકાય છે (જુઓઃ ફાયદા અને મર્યાદાઓ). પ્રારંભિક લાક્ષણિકતા રાઇબોઝ-સેકનો ઉપયોગ સૌપ્રથમ કોહ એટ અલ દ્વારા કરવામાં આવ્યો હતો. (2015) આર. એન. એસ.-એચ. 2-ની ઉણપ (આર. એન. એચ. 201) ઉભરતા યીસ્ટના મિટોકોન્ડ્રીયલ અને પરમાણુ ડીએનએમાં આર. એન. એમ. પી. ના સ્થાનની લાક્ષણિકતા દર્શાવવા માટે. તેમને જાણવા મળ્યું કે આર. એન. એમ. પી. પરમાણુ જિનોમમાં પ્રતિ કિલોબેઝ (કે. બી.) <આઇ. ડી. 1> આર. એન. એમ. પી. અને મિટોકોન્ડ્રીયલ જિનોમમાં પ્રતિ કે. બી. 19.5 આર. એન. એમ. પી. પર હાજર હતા. વધુમાં, કોહ એટ અલ. (2015) ડીએનએમાં આરસી અને આરજીના સમાવેશ માટે અસ્તિત્વમાં રહેલા સ્પષ્ટ પૂર્વગ્રહને ઓળખવામાં સક્ષમ હતા. તેમને જાણવા મળ્યું કે યીસ્ટના કોષોમાં, આર. સી. અને આર. જી. જીનોમિક ડી. એન. એ. માં આર. એ. અને આર. યુ. કરતા વધુ આવર્તન પર જાળવી રાખવામાં આવે છે, જે તમામ પાયાના સંબંધિત અપેક્ષિત આવર્તન સાથે સંબંધિત છે. પાયાના પ્રકારને ધ્યાનમાં લીધા વિના, આર. એન. એમ. પી. ઘણીવાર એવા સ્થળો પર હાજર હતા જે પરમાણુ અને મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએ બંનેમાં ડી. એ. ની તરત જ નીચેની તરફ હતા. આર. એન. એમ. પી. ના સમાવેશ માટે ઘણા વધારાના "હોટસ્પોટ" પણ ચોક્કસ જીનોમિક લક્ષણો (દા. ત.) ના સંદર્ભમાં ઓળખવામાં આવ્યા હતા. ચોક્કસ જનીન સ્થળો, સેર અથવા રંગસૂત્ર પ્રદેશોમાં). બહુ-પ્રજાતિઓની સરખામણીઓ પ્રારંભિક લાક્ષણિકતા પર વિસ્તરણ, બાલાચંદર એટ અલ. (2020) તેમના રાઇબોઝ-સેક પ્રોટોકોલને ઓપ્ટિમાઇઝ કર્યું અને તેનો ઉપયોગ બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ ટૂલ (રાઇબોઝ-મેપ, https://github.com/agombolay/ribose-map પર ઉપલબ્ધ) સાથે મળીને ત્રણ યીસ્ટ પ્રજાતિઓના બહુવિધ તાણના મિટોકોન્ડ્રીયલ અને ન્યુક્લિયર ડીએનએમાં આરએનએમપીનો નકશો બનાવવા માટે કર્યોઃ Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces paradoxus, અને Schizosaccharomyces pombe. આ દરેક પ્રજાતિઓ અને તાણમાંથી મિટોકોન્ડ્રીયલ ડીએનએ (એમટીડીએનએ) માં, એવું દર્શાવવામાં આવ્યું હતું કે આરએનએમપીનો પ્રકાર જે આપેલ જીનોમિક સ્થિતિમાં સમાવિષ્ટ છે તે ડીએનએમપી દ્વારા સૌથી વધુ પ્રભાવિત થાય છે જે તાત્કાલિક અપસ્ટ્રીમ સ્થિતિ (-1) પર સ્થિત છે. બહુવિધ જીનોમમાં રાઇબોઝ-સેકનો ઉપયોગ કરીને, બાલાચંદર એટ અલ. તેઓ યીસ્ટના પ્રકારો અને પ્રજાતિઓ વચ્ચેની વિવિધ સમાનતાઓ અને તફાવતોને પણ સ્પષ્ટ કરવામાં સક્ષમ હતા. તમામ જાતોના એમ. ટી. ડી. એન. એ. માં આર. એન. એમ. પી. પેટર્નમાં આર. યુ. ની ઓછી આવર્તન જોવા મળી હતી; જો કે, એસ. પેરાડોક્સસ અને એસ. સેરેવિસિયા આર. સી. માટે પસંદગીઓ સૂચવે છે જ્યારે એસ. પોમ્બેએ આર. જી. માટે પસંદગીઓ સૂચવી હતી. પરમાણુ ડીએનએમાં, ત્રણ યીસ્ટની પ્રજાતિઓ મોટાભાગે સમાન હતી. વધુમાં, આર. એન. એમ. પી. ટૂંકા-ન્યુક્લિયોટાઇડ પુનરાવર્તન ક્રમમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ હતા. રાઇબોઝ-સેકના આ ઉપયોગથી આરએનએમપી સમાવેશ પેટર્નની લાક્ષણિકતા અને અનુક્રમ સંદર્ભમાં આ પ્રક્રિયાના સંભવિત ડ્રાઇવરોની ઓળખ માટે મંજૂરી આપવામાં આવી હતી. યીસ્ટ જીનોમથી આગળ બિન-યીસ્ટ પ્રજાતિઓમાં હાથ ધરવામાં આવેલા પ્રથમ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ મેપિંગ અભ્યાસમાં, ફોટોસિન્થેટિક એકકોશિકીય લીલા આલ્ગા ક્લેમીડોમોનાસ રીન્હાર્ડ્ટીના પરમાણુ, મિટોકોન્ડ્રીયલ અને ક્લોરોપ્લાસ્ટ જીનોમમાં આર. એન. એમ. પી. ને મેપ કરવા માટે રાઇબોઝ-મેપ સાથે જોડાણમાં રાઇબોઝ-સેકનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. આ પ્રજાતિના મિટોકોન્ડ્રીયલ અને ક્લોરોપ્લાસ્ટ ડીએનએમાં, આરએ અન્ય પાયા પર પ્રાધાન્યપૂર્વક સમાવિષ્ટ હોવાનું જણાયું હતું, જ્યારે પરમાણુ ડીએનએએ આરજી અને આરસીના સમાવેશ તરફ પૂર્વગ્રહ દર્શાવ્યો હતો. તમામ સી. રીનહાર્ડ્ટી ઓર્ગેનેલ્સમાં, આરયુ સતત સૌથી ઓછું પ્રતિનિધિત્વ કરતું આરએનએમપી હતું, જે યીસ્ટ મિટોકોન્ડ્રિયાના તારણો સાથે સુસંગત છે. યીસ્ટ પ્રોફાઇલ્સની જેમ, સી. રીનહાર્ડ્ટીમાં આરએનએમપીનો સમાવેશ ડીએનએમપી દ્વારા તરત જ અપસ્ટ્રીમ (સ્થિતિ-1) દ્વારા સૌથી વધુ પ્રભાવિત થાય છે. આ સેટિંગમાં, રિબોઝ-સેકના ઉપયોગથી પ્રથમ વખત આ પ્રજાતિમાં આરએનએમપી સમાવેશ વિતરણ અને પેટર્નની ઓળખ માટે મંજૂરી આપવામાં આવી હતી. રાઇબોઝ-સેકના ફાયદા અને મર્યાદાઓ કારણ કે રાઇબોઝ-સેક ખાસ કરીને ડીએનએમાં જડિત રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સને લક્ષ્ય બનાવે છે, અને આરએનએ પ્રાઈમર્સ અથવા ઓકાઝાકીના ટુકડાઓ મેળવતું નથી, તે અત્યંત તબદીલીપાત્ર છે અને જીનોમિક ડીએનએની વિવિધતામાં એમ્બેડેડ રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ્સને અસરકારક રીતે લક્ષ્ય બનાવી શકે છે. તેથી, રાઇબોઝ-સેક પ્રમાણભૂત પ્રક્રિયાઓની જરૂર વગર નાના જીનોમિક અણુઓ અથવા મોટા પરમાણુ જીનોમ સહિત વિવિધ પ્રકારના જીનોમમાં આરએનએમપી મેપિંગ માટે પરવાનગી આપે છે. વધુમાં, રાઇબોઝ-સેકની વિશિષ્ટતા એવી પરિસ્થિતિઓમાં પણ આર. એન. એમ. પી. ના મેપિંગ માટે પરવાનગી આપે છે જેમાં ડીએનએ પર્યાવરણીય તાણના સંપર્કમાં આવે છે જે વિરામ અને/અથવા અબાસિક સાઇટ્સ ઉત્પન્ન કરીને ડીએનએને નુકસાન પહોંચાડે છે. રાઇબોઝ-સેક ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ માટે એડેપ્ટરમાં યુએમઆઈનો ઉપયોગ કરે છે જે સિક્વન્સિંગ રીડ્સની ડિડુપ્લિકેશન કરવાની મંજૂરી આપે છે, અને આમ આરએનએમપી હોટસ્પોટ્સની વધુ સચોટ શોધ પૂરી પાડે છે. રાઇબોઝ-સેક યીસ્ટના કોષો માટે વિશિષ્ટ નથી; આ તકનીક સંભવિત રીતે કોઈપણ પ્રજાતિના કોઈપણ કોષ પ્રકાર પર લાગુ કરી શકાય છે, જે તેને મોટાભાગના સજીવોમાં આર. એન. એમ. પી. ના સ્થાન અને પેટર્નને સ્પષ્ટ કરવા માટે ઉપયોગી સાધન બનાવે છે. રાઇબોઝ-સેક સામાન્ય પ્રયોગશાળાના સાધનો અને રીએજન્ટ્સનો ઉપયોગ કરે છે જે સ્રોત માટે એકદમ સરળ હોય છે, જે તેને ઘણી મોલેક્યુલર બાયોલોજી પ્રયોગશાળાઓમાં ઉપયોગ માટે સુલભ તકનીક બનાવે છે. રાઇબોઝ-સેકની મર્યાદાઓ કારણ કે તે સિંગલ આર. એન. એમ. પી. ને લક્ષ્ય બનાવે છે, રાઇબોઝ-સેક લાંબા રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ માર્ગને પકડી શકતો નથી. તેથી, આરએનએ પ્રાઈમર્સ અથવા ઓકાઝાકી ટુકડાઓના મેપિંગ માટે રાઇબોઝ-સેક યોગ્ય તકનીક નહીં હોય, જે ડીએનએ પ્રતિકૃતિ અથવા વિરામ દરમિયાન બની શકે છે. રિબોઝ-સેક જીનોમિક ડીએનએમાંથી આરએનએમપી લાઈબ્રેરીઓ તૈયાર કરવામાં લગભગ 4 દિવસ લે છે. પ્રોટોકોલ પણ પ્રમાણમાં જટિલ છે, જેમાં બહુવિધ પગલાંની જરૂર પડે છે. પૂરક પદ્ધતિઓ રાઇબોઝ-મેપ રાઇબોઝ-મેપ એ મોટા, જટિલ આરએનએમપી કાચા અનુક્રમણિકા ડેટાસેટ્સની પ્રક્રિયા અને વિશ્લેષણ માટે એક બાયોઇન્ફોર્મેટિક સાધન છે. રિબોઝ-મેપ રિબોઝ-સેક, એમરીબોસેક, પુ-સેક, આલ્ક-હાઈડેન-સેક અને આરએચઆઈઆઈ-હાઈડેન-સેક સાથે સુસંગત છે. (જુઓઃ આરએનએમપી કેપ્ચર માટેની અન્ય તકનીકો). RESCOT (રિસ્ટ્રિક્શન એન્ઝાઇમ સેટ એન્ડ કોમ્બિનેશન ઓપ્ટિમાઇઝેશન ટૂલ્સ) એ એક કોમ્પ્યુટેશનલ પદ્ધતિ છે જે પ્રતિબંધ ઉત્સેચકોની આપેલ પસંદગી માટે RNMP-કબજે કરેલા પ્રદેશોના જીનોમિક કવરેજની ગણતરી કરે છે અને પછી RE સમૂહોને શ્રેષ્ઠ બનાવે છે અને rNMP કેપ્ચર દરને મહત્તમ કરવા માટે ઉચ્ચતમ કવરેજ સાથે RE સમૂહો પસંદ કરે છે. આર. એન. એમ. પી. કેપ્ચર એમરીબોસેક માટેની અન્ય તકનીકોઃ 5 'બાજુથી એમ્બેડેડ આર. એન. એમ. પી. ના અપસ્ટ્રીમમાં ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડને પકડવા માટે માનવ આર. એન. એસ. એચ. 2 અને ટી. 4 ક્વિક લિગેઝનો ઉપયોગ કરે છે. આરએચઆઈઆઈ-હાઈડેન-સેકઃ એસ્ચેરીચીયા કોલી આરએનએઝ એચઆઈઆઈ અને ટી4 આરએનએ લિગેઝનો ઉપયોગ તેની 5 'બાજુથી જડિત આરએનએમપીને પકડવા માટે કરે છે. આર. એચ. આઈ. આઈ.-હાઈડેન-સેક આર. એન. એમ. પી. અને ઓકાઝાકી ટુકડાઓ સાથે સમાપ્ત થયેલ ડીએનએ ક્રમને પણ પકડી શકે છે. પુ-સેકઃ 3 'બાજુથી એમ્બેડેડ આર. એન. એમ. પી. ના ડાઉનસ્ટ્રીમમાં ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડને પકડવા માટે આલ્કલાઇન પરિસ્થિતિઓ અને ટી4 આર. એન. એ. લિગેઝનો ઉપયોગ કરે છે. ઓકાઝાકીના ટુકડાઓ પકડી શકે છે. આલ્ક-હાઈડેન-સેકઃ 3 'બાજુથી એમ્બેડેડ આર. એન. એમ. પી. ના ડાઉનસ્ટ્રીમમાં ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડને પકડવા માટે આલ્કલાઇન પરિસ્થિતિઓ અને ટી4 આર. એન. એ. લિગેઝનો ઉપયોગ કરે છે. તે ઓકાઝાકીના ટુકડાઓ પણ પકડી શકે છે. આર. આઈ. એસ. ક્યુ.-સે. ક્યુ. (રિબોન્યુક્લિયોટાઇડ સ્કેનીંગ ક્વોન્ટિફિકેશન સિક્વન્સિંગ): આર. એન. એમ. પી. ના અપસ્ટ્રીમ પડોશી ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડને પકડવા માટે સંપૂર્ણ જથ્થાનો ઉપયોગ કરે છે. સંદર્ભો રિબોન્યુક્લીઝ આનુવંશિક નકશા