ScGET-seq
સિંગલ-સેલ જીનોમ અને એપિજેનોમ બાય ટ્રાન્સપોઝેસ સિક્વન્સિંગ (એસસીજીઈટી-સેક) એ ખુલ્લા અને બંધ ક્રોમેટિનની રૂપરેખા માટે ડીએનએ સિક્વન્સિંગ પદ્ધતિ છે. ટ્રાન્સપોઝેસ-ઍક્સેસિબલ ક્રોમેટિન વિથ સિક્વન્સિંગ (સ્કેટેક-સેક) માટે સિંગલ-સેલ એસેથી વિપરીત, જે ફક્ત સક્રિય યુક્રોમેટિનને લક્ષ્ય બનાવે છે. SCGET-SEQ નિષ્ક્રિય હેટેરોક્રોમેટિનની તપાસ કરવામાં પણ સક્ષમ છે. આ ટી. એન. એચ. ના ઉપયોગ દ્વારા પ્રાપ્ત થાય છે, જે હેટેરોક્રોમેટિન પ્રોટીન-1-આલ્ફા (એચ. પી.-1) ના ક્રોમોડોમેન (સી. ડી.) ને ટી. એન. 5 ટ્રાન્સપોઝેસ સાથે જોડીને બનાવવામાં આવે છે. TnH પછી હિસ્ટોન 3 લાઇસિન 9 ટ્રાઇમિથાઇલેશન (H3K9me3) ને લક્ષ્ય બનાવવામાં સક્ષમ છે, જે હેટેરોક્રોમેટિન માટેનું માર્કર છે. અકિનથી આર. એન. એ. વેગ, જે સેલ્યુલર વિકાસ દરમિયાન જનીન અભિવ્યક્તિમાં ફેરફારોના ગતિશાસ્ત્રનું અનુમાન કરવા માટે સ્પ્લાઇસડ અને અનસ્પ્લાઇસડ આર. એન. એ. ના ગુણોત્તરનો ઉપયોગ કરે છે, એસસીજીઈટી-સેકમાંથી મેળવેલા ટીએનએચ અને ટીએન5 સંકેતોના ગુણોત્તરનો ઉપયોગ ક્રોમેટિન વેગની ગણતરી કરવા માટે કરી શકાય છે, જે સેલ્યુલર વિકાસલક્ષી માર્ગો દરમિયાન ક્રોમેટિનની સુલભતાની ગતિશીલતાને માપે છે. ઇતિહાસ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ નિયમન ક્રોમેટિન સ્થિતિઓ સાથે ચુસ્ત રીતે જોડાયેલું છે. ક્રોમેટિન કે જે ખુલ્લું હોય છે, અથવા અનુલેખન માટે અનુકૂળ હોય છે, તે જીનોમનું માત્ર 2-3% બનાવે છે, પરંતુ અનુલેખન પરિબળ બંધનકર્તા સાઇટ્સના 94.4% ને આવરી લે છે. તેનાથી વિપરીત, વધુ ચુસ્ત રીતે ભરેલા ડીએનએ અથવા હેટેરોક્રોમેટિન, જીનોમ સંગઠન અને સ્થિરતા માટે જવાબદાર છે. કોષીય વિભેદન પ્રક્રિયાઓ દરમિયાન ક્રોમેટિનની ઘનતા પણ બદલાય છે, પરંતુ હેટરોક્રોમેટિનનું સીધું પરીક્ષણ કરવા માટે ઉચ્ચ-થ્રુપુટ અનુક્રમણિકા પદ્ધતિઓનો અભાવ છે. કેન્સર જેવા ઘણા જીનોમિક-સંબંધિત રોગો તેમના એપિજેનોમમાં ફેરફારો સાથે ખૂબ જોડાયેલા છે. કેન્સર ખાસ કરીને સિંગલ-સેલ વિજાતીયતા દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે, જે મેટાસ્ટેસિસ અને સારવાર પ્રતિકારને ચલાવી શકે છે. આ પ્રક્રિયાઓને આધાર આપતી પદ્ધતિઓ હજુ પણ મોટાભાગે અજ્ઞાત છે, જો કે સિંગલ-સેલ એપિજેનોમિક્સ સહિત સિંગલ-સેલ તકનીકોના આગમનથી તેમના સ્પષ્ટીકરણમાં મોટો ફાળો આપ્યો છે. 2015માં, એ. ટી. એ. સી.-એસ. ઈ. ક્યુ., જે ટી. એન. 5 ટ્રાન્સપોઝેસનો ઉપયોગ ટુકડામાં કરે છે અને સુલભ ક્રોમેટિન અથવા યુક્રોમેટિનને અનુક્રમણિકા માટે ટેગ કરે છે, તે સિંગલ-સેલ રિઝોલ્યુશન પર શક્ય બન્યું હતું. એસસીજીઈટી-સેક દરેક કોષની અંદર ક્રોમેટિન માળખું અને ગતિશીલતા પર વધુ વ્યાપક દેખાવ પ્રદાન કરીને હેટેરોક્રોમેટિન પર માહિતી પ્રદાન કરીને આ તકનીક પર નિર્માણ કરે છે. પદ્ધતિઓ નમૂના તૈયાર કરવા SCGET-SEQ માટે નમૂનાની તૈયારી પ્રારંભિક સામગ્રી માટે યોગ્ય પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કોષોમાંથી ન્યુક્લિયસનું સસ્પેન્શન મેળવવાની સાથે શરૂ થાય છે. આગળનું પગલું ટી. એન. એચ. ટ્રાન્સપોઝેસનું ઉત્પાદન કરવાનું છે. ટી. એન. 5 એ એક ટ્રાન્સપોઝેઝ છે જે ન્યુક્લિયોસોમ્સ (ઓપન ક્રોમેટિન) દ્વારા અનબાઉન્ડ જીનોમિક પ્રદેશોમાં એડેપ્ટરને કાપી નાખે છે અને જોડે છે. HP-1a એ HP1 પરિવારનો સભ્ય છે અને તે H3K9me3 ને ઓળખવા અને ખાસ કરીને જોડવામાં સક્ષમ છે. તેના ક્રોમોડોમેન આ ક્રોમેટિન ફેરફારને ઓળખવા માટે પ્રેરિત-ફિટ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરે છે. ત્રણ પોલી-ટાયરોસિન-ગ્લાયસીન-સેરીન (TGS) લિંકરનો ઉપયોગ કરીને ક્રોમોડોમેન ધરાવતા HP-1a ના પ્રથમ 112 એમિનો એસિડને Tn5 સાથે જોડવાથી TnH ટ્રાન્સપોઝેસની રચના થાય છે, જે H3K9me3 દ્વારા ચિહ્નિત હેટેરોક્રોમેટિનને લક્ષ્ય બનાવવામાં સક્ષમ છે. લાઇબ્રેરીની તૈયારી સિંગલ-સેલ એટીએસી-સેક માટે સુધારેલા પ્રોટોકોલનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે, જ્યાં ન્યુક્લિયસ સસ્પેન્શનને અનુક્રમે પહેલા ટીએન 5 ટ્રાન્સપોઝેસ અને પછી ટીએનએચ સાથે સેવન કરવામાં આવે છે. ડેટા વિશ્લેષણ ડેટા વિશ્લેષણના લક્ષ્યાંકો છેઃ ક્લસ્ટરિંગનો ઉપયોગ કરીને અલગ કોષોની વસ્તીને ઓળખવી અને લાક્ષણિકતા દર્શાવવી સમગ્ર જિનોમમાં ક્રોમેટિનની સુલભતાને પ્રોફાઇલ કરવા માટે કોપી-નંબર વેરિએન્ટ્સ અને સિંગલ-ન્યુક્લિયોટાઇડ વેરિએન્ટ્સની આગાહી કરવા માટે પ્રી-પ્રોસેસિંગ પોસ્ટ-સિક્વન્સિંગ, રીડ્સને ડિમલ્ટીપ્લેક્સ કરવાની જરૂર છે અને યોગ્ય સંદર્ભ જિનોમ સાથે મેપ કરવાની જરૂર છે. ડુપ્લિકેટ રીડ્સ ઓળખવામાં આવે છે અને દૂર કરવામાં આવે છે. "શિખરો" અથવા નકશા કરેલા વાંચનની સંખ્યામાં સમૃદ્ધ ડીએનએના પ્રદેશોને ઓળખવામાં આવે છે. ગુણવત્તા નિયંત્રણ કરવામાં આવે છે, અને ઓછી સંખ્યામાં વાંચન અથવા થોડા શોધાયેલ લક્ષણો ધરાવતા કોષોને ફિલ્ટર કરવામાં આવે છે. ચાર ગણતરી મેટ્રિક્સ (મેટ્રિક્સ જ્યાં દરેક સ્તંભ એક કોષ છે અને દરેક પંક્તિ એક લક્ષણ છે) ઉત્પન્ન થાય છેઃ Tn5-dhs, Tn5-પૂરક, TnH-dhs અને TnH-પૂરક, જે સુલભ અને સઘન ક્રોમેટિનમાંથી સંકેત રજૂ કરે છે. વિશ્લેષણ પરિમાણમાં ઘટાડો, વિઝ્યુલાઇઝેશન અને ક્લસ્ટરિંગ દરેક મેટ્રિસીસને વહેંચાયેલા પ્રદેશોમાંથી ફિલ્ટર કરવામાં આવે છે અને પછી સામાન્ય કરવામાં આવે છે અને લોગ 2 રૂપાંતરિત થાય છે. મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (પીસીએ) નો ઉપયોગ કરીને રેખીય પરિમાણમાં ઘટાડો કરવામાં આવે છે. કોષોના જૂથોને કે-એનએન અલ્ગોરિધમ અને લીડેન અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરીને ઓળખવામાં આવે છે. છેવટે, ચાર મેટ્રિક્સને મેટ્રિક્સ ફેક્ટરાઇઝેશન અને યુએમએપી રિડક્શનનો ઉપયોગ કરીને જોડવામાં આવે છે. કોષ ઓળખ એનોટેશન કોષ ઓળખ એનોટેશન માટે બે અભિગમો છેઃ એ. ટી. એ. સી. શિખરોના લક્ષણ એનોટેશન પર આધારિત એનોટેશન અને સંદર્ભ એસ. સી. આર. એન. એ.-એસ. ઈ. ક્યુ. ડેટા સાથે એકીકરણ પર આધારિત એનોટેશન. Tn5 થી TnH સંકેતોના ગુણોત્તરનો ઉપયોગ કરીને, ક્રોમેટિનનું પુનઃરચના કેટલી ઝડપથી અને કઈ દિશામાં થઈ રહ્યું છે તે વર્ણવતા માત્રાત્મક મૂલ્યોની ગણતરી કરી શકાય છે (ક્રોમેટિન વેગ). સૌથી વધુ ગતિશીલ પ્રદેશોને અલગ કરીને અને કયા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળો ત્યાં જોડાય છે તે ઓળખીને, ક્રોમેટિન વેગનો ઉપયોગ આપેલ કોષની અંદર થતી ગતિશીલ એપિજેનેટિક પ્રક્રિયાઓ અને તે પ્રક્રિયાઓમાં વિવિધ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોના યોગદાનનું અનુમાન કરવા માટે થઈ શકે છે. ભવિષ્યનું ક્રોમેટિન રિમોડેલિંગ જનીન અભિવ્યક્તિમાં ફેરફારો પહેલા થાય છે અને કોષીય ફેરફારોના માર્ગ અને પદ્ધતિઓની સમજણમાં વધારો કરે છે. આમ, મલ્ટીમોડલ ડેટાના એકીકરણ માટેના પ્લેટફોર્મ અને સાધનો સક્રિય સંશોધનના ક્ષેત્રો છે, જેમાં આર. એન. એ. વેગ સાથે ક્રોમેટિન વેગના એકીકરણ દ્વારા અસ્થાયી અને દિશાત્મક તત્વોનો સમાવેશ કરવામાં આવ્યો છે, જે તફાવત માર્ગો વિશે વધુ માહિતી જાહેર કરે છે. મર્યાદાઓ SCGET-SEQ માં કેટલીક મર્યાદાઓ SCATAC-SEQ જેવી જ છે. બંને પ્રક્રિયાઓ માટે વ્યવહારુ કોષોમાંથી ન્યુક્લિયસ નમૂનાઓ અને ઉચ્ચ સેલ્યુલર સદ્ધરતા જરૂરી છે. ઓછી સેલ્યુલર સદ્ધરતા ઉચ્ચ પૃષ્ઠભૂમિ ડીએનએ દૂષણ તરફ દોરી જાય છે જે અધિકૃત જૈવિક સંકેતોને સચોટ રીતે રજૂ કરતા નથી. વધુમાં, SCATAC-SEQ અને SCGET-SEQ ડેટાની અસ્પષ્ટતા અને ઘોંઘાટીયા પ્રકૃતિ વિશ્લેષણને પડકારજનક બનાવે છે, અને આ ડેટાને શ્રેષ્ઠ રીતે કેવી રીતે સંચાલિત કરવો તે અંગે હજુ સુધી કોઈ સર્વસંમતિ નથી. બલ્ક એક્સોમ સિક્વન્સિંગ અને એસ. સી. જી. ઈ. ટી.-એસ. ઈ. ક્યુ. પરિણામો વચ્ચે પરિવર્તનોનો ઉચ્ચ સહસંબંધ હોવા છતાં, એસ. સી. જી. ઈ. ટી.-એસ. ઈ. ક્યુ. તમામ એક્સોમ એસ. એન. વી. ને પકડવામાં નિષ્ફળ જાય છે. સંદર્ભો મોલેક્યુલર બાયોલોજી તકનીકો