Deterministic Barcoding in Tissue for Spatial Omics Sequencing
સ્થાનિક ઓમિક્સ સિક્વન્સિંગ (DBiT-SEQ) માટે ટિશ્યુમાં નિર્ધારિત બારકોડિંગ 2020 માં યેલ યુનિવર્સિટીમાં રોંગ ફેન અને સહકર્મીઓ દ્વારા પેશીના નમૂનામાં અવકાશી જનીન અભિવ્યક્તિ હેટેરોજેનિસિટીનો અભ્યાસ કરવા માટે બહુ-ઓમિક્સ અભિગમ બનાવવા માટે વિકસાવવામાં આવ્યું હતું. આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ તાજા અથવા ફ્રોઝન ફોર્મેલ્ડિહાઇડ-ફિક્સ્ડ પેશીઓના નમૂનાઓમાં નજીકના સિંગલ-સેલ રિઝોલ્યુશન પર સહ-મેપિંગ એમઆરએનએ અને પ્રોટીન સ્તરો માટે થઈ શકે છે. DBiT-SEQ નેક્સ્ટ જનરેશન સિક્વન્સિંગ (NGS) અને માઇક્રોફ્લુઇડિક્સનો ઉપયોગ કરે છે. આ પદ્ધતિ પેશીના નમૂનાના એક સાથે અવકાશી ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટિઓમિક વિશ્લેષણ માટે પરવાનગી આપે છે. ડીબીઆઇટી-સેક પિક્સેલ દીઠ શોધી શકાય તેવા જનીનોની સંખ્યામાં વધારો કરીને, સેલ્યુલર રિઝોલ્યુશનમાં વધારો કરીને અને અમલીકરણની સરળતા દ્વારા હાઇ-ડેફિનેશન સ્પેસિયલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ (એચડીએસટી) અને સ્લાઇડ-સેક જેવી અગાઉની અવકાશી ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ એપ્લિકેશનોમાં સુધારો કરે છે. બહુકોશિક પ્રણાલીઓમાં દરેક વ્યક્તિગત કોષના કાર્યને તેમના અવકાશી સ્થાન અને આસપાસના વાતાવરણ દ્વારા અસર થાય છે. આમ, અવકાશી સંદર્ભમાં પેશીઓમાં એમ. આર. એન. એ. અને પ્રોટીન બંને સ્તરની રૂપરેખા તૈયાર કરવા માટે ડી. બી. આઈ. ટી.-સે. ક્યુ. ના અમલીકરણથી ઘણી જૈવિક પ્રક્રિયાઓની વધુ સારી સમજણ થઈ શકે છે. DBiT-SEQ નો ઉપયોગ ઓન્કોલોજી, વિકાસલક્ષી જીવવિજ્ઞાન અને પેથોલોજી જેવા ઘણા વિવિધ ક્ષેત્રોમાં થઈ શકે છે. વિકાસલક્ષી જીવવિજ્ઞાનમાં ઉપયોગ કેવી રીતે ઓર્ગેનોજેનેસિસ થાય છે તેની વધુ સારી સમજણ તરફ દોરી શકે છે, અને ઓન્કોલોજીમાં તે ટ્યુમરિજેનેસિસ અને પ્રગતિમાં વિજાતીયતાની ભૂમિકાની વધુ સમજ આપી શકે છે. પદ્ધતિ DBiT-SEQ ચોક્કસ નિયંત્રિત પેટર્નમાં ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ બારકોડ પહોંચાડવા માટે માઇક્રોફ્લુઇડિક્સ સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરે છે. સિસ્ટમ એ1બી1, એ1બી2 અને તેથી વધુ લેબલવાળા વિભાગમાં અનન્ય બારકોડ્સની ગ્રીડ બનાવવા માટે લંબ રીતે ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ બારકોડ્સ (એ1-એ50 અને બી1-બી50) ના બે સેટ લાગુ કરે છે. ઉપકરણની તૈયારી DBiT-SEQ માટે બારકોડ પહોંચાડવા માટે ખાસ રચાયેલ માઇક્રોફ્લુઇડિક્સ ઉપકરણની જરૂર પડે છે. માઇક્રોફ્લુઇડિક્સ માઇક્રોન સ્કેલ પર પ્રવાહીની ચોક્કસ હેરફેરને સક્ષમ કરે છે. DBiTseq ઉપકરણ સિલિકોન વેફર મોલ્ડમાં પોલીડીમિથાઇલસિલોક્સેન (PDMS) કાસ્ટનો ઉપયોગ કરીને તૈયાર કરવામાં આવે છે. આ ઉપકરણ વપરાશકર્તાને કોઈ વિશેષ ઉપકરણો વિના મેક્રો સ્કેલ પર યોગ્ય ચેનલોમાં પ્રવાહી રીએજન્ટ્સ જમા કરવાની મંજૂરી આપે છે. આ રીએજન્ટ્સ પછી પેશી વિભાગની સપાટી પર 10,25 અથવા 50 માઇક્રોન પહોળી ચેનલો દ્વારા વેક્યૂમ દ્વારા દોરવામાં આવે છે. DBiT-SEQ ઉપકરણના અન્ય ઘટકો બે PDMS જળાશયો અને ઉપકરણને પેશીઓ પર ફ્લશ રાખવા માટે એક્રેલિક ક્લેમ્પ સિસ્ટમ છે. પેશીઓની તૈયારી અને એન્ટિબોડી સ્ટેનિંગ DBiT-SEQ નો ફાયદો એ છે કે ટીશ્યુ ફિક્સિંગ તરીકે ઓળખાતી પ્રક્રિયામાં ફોર્મેલ્ડિહાઇડ સાથે સંરક્ષિત ટીશ્યુ સ્લાઇડ્સ પર તેનો ઉપયોગ કરવાની ક્ષમતા છે, જે અન્ય અવકાશી ઓમિક્સ પધ્ધતિઓ સાથે અસંગત છે. પેશીઓ સ્થિર થાય છે, સ્થિર થાય છે અને ખૂબ જ પાતળા સ્લાઇસેસમાં વિભાજિત થાય છે જે કાચની સ્લાઇડ્સ પર માઉન્ટ થયેલ હોય છે. જો નમૂનામાં પ્રોટીન વિશેની માહિતી ઇચ્છિત હોય, તો પેશીઓને પ્રથમ એન્ટિબોડી-વ્યુત્પન્ન ડીએનએ ટેગ (એડીટી) સાથે રંગીન કરવામાં આવે છે. એડીટી એક વિશિષ્ટ બારકોડ ક્રમ અને પોલી-એ પૂંછડી ક્રમ ધરાવતી ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ સાથે જોડાયેલી એન્ટિબોડીથી બનેલી હોય છે. પોલી-એ પૂંછડીને બારકોડ એ પર પોલી-ટી ક્રમ દ્વારા ઓળખવામાં આવશે, જેનાથી તે અવકાશી સ્થાન સાથે સંકળાયેલ હશે. એન્ટિબોડી સ્ટેનિંગ પછી (જો ઇચ્છિત હોય તો), પ્રથમ માઇક્રોફ્લુઇડિક્સ ચિપનો ઉપયોગ કરીને પેશીના નમૂના પર 50 બારકોડનો પ્રથમ સમૂહ લાગુ કરવામાં આવે છે. દરેક 'એ' પ્રાઇમરમાં એક અનન્ય બારકોડ ક્રમ, બંધન લિંકર અને પોલી ટી ક્રમ હોય છે. પોલી-ટી ક્રમ પેશીના નમૂનામાં અને અગાઉ લાગુ કરાયેલ એડીટી પર એમઆરએનએ પર પોલી-એ પૂંછડી સાથે જોડાય છે. રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પછી બારકોડ અને mRNA અથવા એન્ટિબોડી ટેગ ક્રમ ધરાવતી પ્રથમ cDNA સ્ટ્રાન્ડ પેદા કરે છે. ચિપ બી પછી તે જ પેશીની સ્લાઇડ પર લાગુ કરવામાં આવે છે. ચિપ બી પ્રથમને લંબરૂપ બારકોડ્સનો બીજો સમૂહ પહોંચાડશે, જે ગ્રીડ પેટર્ન બનાવશે. દરેક 'બી' ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડમાં એક અનન્ય બારકોડ ક્રમ, એક પી. સી. આર. હેન્ડલ, બંધન લિંકર અને સી. ડી. એન. એ. શુદ્ધિકરણ માટે બાયોટિન હોય છે. બંધન લિંકર સિક્વન્સનો ઉપયોગ બારકોડ એ અને બી ને એક જ ડીએનએ સ્ટ્રાન્ડમાં જોડવા માટે થાય છે. છેવટે, લિસિસ પગલું પેશીઓમાંથી સી. ડી. એન. એ. ને એકત્રિત નમૂનામાં કાઢે છે જેમાં તમામ બારકોડેડ સેર હોય છે. પુસ્તકાલયની તૈયારી અને અનુક્રમણિકા પગલું 3 માં ઉત્પાદિત સી. ડી. એન. એ. લાઇસેટને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન મણકાનો ઉપયોગ કરીને શુદ્ધ કરવામાં આવે છે જે બારકોડ બી પર બાયોટિનને ઓળખે છે. પૂરક સી. ડી. એન. એ. સ્ટ્રાન્ડને પછી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન દ્વારા સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે, ત્યારબાદ પી. સી. આર. એમ્પ્લીફિકેશન અને લાઇબ્રેરીનું અંતિમ શુદ્ધિકરણ થાય છે. ત્યારબાદ લાઈબ્રેરીને આગામી પેઢી (ઈલુમિના) ક્રમનો ઉપયોગ કરીને અનુક્રમિત કરવામાં આવે છે. માહિતીનું વિશ્લેષણ બારકોડ્સમાંથી મેળવેલી અવકાશી માહિતીના ચોક્કસ જોડાણને સક્ષમ કરવા માટે દરેક બારકોડિંગ પગલા પહેલા, દરમિયાન અને પછી ટીશ્યુ સ્લાઇડની છબી લેવામાં આવે છે. દરેક એમ. આર. એન. એ. ક્રમ સાથે બારકોડ્સને સાંકળવાથી પેશીઓનો અવકાશી ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ નકશો મળે છે. જ્યારે કે આ એક-કોષ પદ્ધતિ નથી, 10 યુ. એમ. ચેનલો ચોરસ દીઠ માત્ર 1-2 કોષો મેળવે છે, જે નજીકના એક-કોષ રીઝોલ્યુશન પેદા કરે છે. એડીટી સિક્વન્સ અવકાશી પ્રોટીઓમિક માહિતી મેળવે છે જેની ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક માહિતી સાથે સરખામણી કરી શકાય છે. ચોક્કસ કોષોની વસ્તીને બે રીતે ઓળખી શકાય છે. પ્રથમ, દરેક કોષ પ્રકાર માટે ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમને અગાઉના સિંગલ-સેલ આર. એન. એ.-સેક (એસ. સી. આર. એન. એ.-સેક) રૂપરેખાઓ સાથે સરખાવીને. બીજું, અવકાશી વિભેદક અભિવ્યક્તિ (સ્પેટિઅલડીઇ) નો ઉપયોગ કરીને, એક પેટર્ન ઓળખ સોફ્ટવેર જે એસ. સી. આર. એન. એ.-એસ. ઈ. ક્યુ. ડેટા વિના પેશીઓના પ્રકારોને અલગ કરી શકે છે. ફાયદા અને મર્યાદાઓ DBiT-SEQ એ mRNA અને પ્રોટીનના સહ-મેપિંગને મંજૂરી આપીને અન્ય અવકાશી-ઓમિક્સ તકનીકો પર ફાયદો પૂરો પાડે છે. આ વિશ્લેષણ માટે ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટિઓમિક ડેટા બંને પ્રદાન કરે છે. આ તકનીક સરળતાથી અમલમાં મૂકી શકાય છે અને સંશોધકની જરૂરિયાતો અને રસના પ્રોટીનને અનુરૂપ થઈ શકે છે. આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ એચ એન્ડ ઇ અને ઇમ્યુનોસ્ટેઇન પેશીઓના નમૂનાઓ પર તેમજ ફોર્મેલ્ડિહાઇડ-ફિક્સ્ડ પેશીઓના નમૂનાઓ સાથે સફળતાપૂર્વક થઈ શકે છે. બારકોડિંગ માટે ઉપયોગમાં લેવાતી ચેનલોને 10 માઇક્રોન, 25 માઇક્રોન અને 50 માઇક્રોનથી રિઝોલ્યુશન જરૂરિયાતોને સમાયોજિત કરવા માટે બદલી શકાય છે. મર્યાદાઓ DBiT-SEQ ના રિઝોલ્યુશનમાં સિંગલ સેલ રિઝોલ્યુશન નથી, પરંતુ તે સિંગલ સેલ રિઝોલ્યુશનની નજીક છે. પિક્સેલના કદની સૈદ્ધાંતિક મર્યાદા ~ 5 માઇક્રોન છે, જે એક કોષના અવલોકનના એક અથવા અપૂર્ણાંકને મંજૂરી આપવા માટે પૂરતી નાની છે પરંતુ તેનો અમલ કરવામાં આવ્યો નથી. વર્તમાન ચેનલ રૂપરેખાંકનો સાથે પેશી પર મેપિંગ વિસ્તારની કદ મર્યાદા છે, 10 માઇક્રોન ચેનલોનો ઉપયોગ કરીને આ પેશીના માત્ર 1 મીમી × 1 મીમી વિસ્તારને મેપ કરવાની મંજૂરી આપે છે. આ મર્યાદાને દૂર કરવા માટે વિસ્તાર વધારવા માટે વધારાની બારકોડિંગ ચેનલો ઉમેરી શકાય છે. સારાંશ પેશીઓ કોષોની વિજાતીય વસ્તીથી બનેલી હોય છે. કેન્સર સંશોધન અને વિકાસલક્ષી જીવવિજ્ઞાન જેવા ક્ષેત્રોમાં આ કોષો એક સાથે કેવી રીતે કામ કરે છે અને પેશીઓમાં દરેક કોષની ભૂમિકાને સમજવી મહત્વપૂર્ણ છે. જ્યારે સિંગલ સેલ ઓમિક્સ તકનીકોમાં પ્રગતિએ આ જટિલ વાતાવરણને સમજવાના અમારા પ્રયાસોમાં સુધારો કર્યો છે, ત્યારે અવકાશી માહિતીનો નોંધપાત્ર અભાવ છે. અવકાશી ઓમિક્સના આગમનથી આમાં સુધારો થયો છે. DBiT-SEQ સ્થિર અથવા તાજા પેશી વિભાગોમાંથી અવકાશી ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક માહિતી મેળવવા માટે સુલભ પદ્ધતિ પ્રદાન કરે છે. 10, 25 અથવા 50 માઇક્રોન રિઝોલ્યુશન સાથે, DBiT-SEQ લગભગ સિંગલ સેલ રિઝોલ્યુશન પ્રદાન કરે છે અને અત્યંત વિશિષ્ટ ઇમેજિંગ સાધનોની જરૂર વગર અવકાશી ઓમિક્સ ડેટા પ્રદાન કરે છે. સંદર્ભો ઓમિક્સ ડીએનએ બારકોડિંગ