Cycloheximide chase
સાયક્લોહેક્સિમાઇડ ચેઝ એસેઝ એ એક પ્રાયોગિક તકનીક છે જેનો ઉપયોગ મોલેક્યુલર અને સેલ્યુલર બાયોલોજીમાં સ્થિર સ્થિતિ પ્રોટીન સ્થિરતાને માપવા માટે થાય છે. સાયક્લોહેક્સિમાઇડ એક એવી દવા છે જે યુકેરીયોટિક પ્રોટીન ટ્રાન્સલેશનમાં વિસ્તરણના પગલાને અટકાવે છે, જેનાથી પ્રોટીન સંશ્લેષણ અટકાવવામાં આવે છે. સંવર્ધિત કોષોમાં સાયક્લોહેક્સિમાઇડનો ઉમેરો અને ત્યારબાદ બહુવિધ સમય બિંદુઓ પર પ્રોટીન લિસિસ સમય જતાં પ્રોટીનના અધઃપતનનું નિરીક્ષણ કરવા માટે હાથ ધરવામાં આવે છે અને તેનો ઉપયોગ પ્રોટીનનું અર્ધ-જીવન નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે. આ પરીક્ષણોને ઘણીવાર પ્રોટીનની વિપુલતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ દ્વારા અનુસરવામાં આવે છે અને ઇમેજજે જેવા માત્રાત્મક સાધનોનો ઉપયોગ કરીને તેનું વિશ્લેષણ કરી શકાય છે. અમલીકરણ સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પીછો પરીક્ષણો યીસ્ટ અને સસ્તન કોષ રેખાઓ જેવા વિવિધ પ્રકારના કોષોનો ઉપયોગ કરીને હાથ ધરવામાં આવ્યા છે. વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગમાં લેવાતી કોષ પ્રણાલીના આધારે, પરીક્ષણ ઉપયોગ અને સમયના ક્રમમાં બદલાઈ શકે છે. ઉદાહરણ તરીકે, રસના પ્રોટીન સબસ્ટ્રેટને વ્યક્ત કરતા યીસ્ટના કોષોને સામાન્ય રીતે 90 મિનિટ સુધી ચાલતા સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પીછોની જરૂર પડે છે જેથી પ્રોટીનનું ટર્નઓવર થઈ શકે. તેનાથી વિપરીત, સસ્તન પ્રાણીઓની કોષ રેખાઓમાં વ્યક્ત થતા પ્રોટીન સ્થિર સ્થિતિમાં વધુ સ્થિર હોય છે અને 3 થી 8 કલાક સુધી પીછો કરવાની જરૂર પડી શકે છે. પ્રોટીનની જટિલતાને આધારે અને તે મોડેલ સિસ્ટમ માટે વધુ પડતું અભિવ્યક્ત અથવા અંતર્જનિત છે કે કેમ તેના આધારે, પીછો કરવાની જરૂરી લંબાઈ બદલાઈ શકે છે. સમગ્ર પીછો દરમિયાન પ્રોટીન સંશ્લેષણ અટકાવવામાં આવે છે તેની ખાતરી કરવા માટે, સાયક્લોહેક્સિમાઇડ ઘણીવાર દર થોડા કલાકોમાં નમૂનામાં ઉમેરવામાં આવે છે. યીસ્ટમાં, સાઇક્લોહેક્સિમાઇડ પીછો સાથે સમય જતાં પ્રોટીનની સ્થિરતાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે કાઢી નાંખવાના તાણનો વારંવાર ઉપયોગ થાય છે. ઉદાહરણ તરીકે, ચેપરોન, ઇ 3 લિગેસ અને વેક્યૂલર પ્રોટીન જેવી નિર્ણાયક અધોગતિ મશીનરીનો અભાવ ધરાવતા યીસ્ટના તાણનો ઉપયોગ ઘણીવાર રસના પ્રોટીન સબસ્ટ્રેટ માટે અધોગતિ માટેની પદ્ધતિ નક્કી કરવા માટે થાય છે. ડ્રગ સારવાર (જેમ કે એમજી132) નો ઉપયોગ અધોગતિના પગલાંને રોકવા માટે પણ થાય છે, ત્યારબાદ રસના પ્રોટીનની સ્થિરતા કેવી રીતે પ્રભાવિત થાય છે તેનું નિરીક્ષણ કરવા માટે સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પીછો કરવામાં આવે છે. આ પ્રયોગો સસ્તન પ્રાણીઓના કોષોમાં યીસ્ટ દૂર કરવાના તાણના સ્થાને સુસંગત નોકડાઉન પ્રક્રિયાઓના અમલીકરણ સાથે હાથ ધરવામાં આવી શકે છે. વિવિધ પરિવર્તન પ્રોટીનની સ્થિરતાને કેવી રીતે અસર કરે છે તેનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પીછો પણ મૂલ્યવાન છે. પ્રોટીનની સ્થિરતા માટે જરૂરી નિર્ણાયક અવશેષો અને રોગ-સંબંધિત પરિવર્તન કોષની અંદર પ્રોટીનના અર્ધ-જીવનને કેવી રીતે અસર કરી શકે છે તે નક્કી કરવા માટે યીસ્ટ અને સસ્તન પ્રાણીઓના કોષોમાં પ્રયોગો હાથ ધરવામાં આવ્યા છે. આ માહિતી પ્રોટીન ફોલ્ડિંગની જટિલતાઓને સમજવા માટે અને તે જે રોગો સાથે સંકળાયેલા છે તેના પેથોજેનેસિસમાં પરિવર્તન કેવી રીતે ફાળો આપે છે તે સમજવા માટે મૂલ્યવાન છે. ફાયદા પ્રોટીનની સ્થિરતાનું મૂલ્યાંકન કરતી અન્ય પદ્ધતિઓના વિરોધમાં સાયક્લોહેક્સિમાઇડ ચેઝ એસેઝનો ઉપયોગ કરવાના ઘણા ફાયદા છે. સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પીછો વિવિધ પ્રકારની મોડેલ સિસ્ટમો સાથે વાપરી શકાય છે અને લગભગ કોઈપણ પ્રોટીન સબસ્ટ્રેટનો અભ્યાસ કરવા માટે અમલ કરી શકાય છે. અન્ય દવાઓની સરખામણીમાં સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પ્રમાણમાં સસ્તું સંયોજન છે અને ટૂંકા ગાળા માટે ઓછી માત્રામાં ઉપયોગમાં લેવાતી વખતે તે અસરકારક છે. પલ્સ ચેઝ એસેઝ એ સાયક્લોહેક્સિમાઇડ ચેઝ એસેઝની વૈકલ્પિક પદ્ધતિ છે અને તેમાં નવા અનુવાદિત પ્રોટીનના કિરણોત્સર્ગી લેબલિંગનો સમાવેશ થાય છે અને ત્યારબાદ સમાન "ચેઝ" સમયગાળો આવે છે. જ્યારે આ પદ્ધતિ માહિતીપ્રદ છે અને નવજાત પ્રોટીનની વિપુલતાના નિરીક્ષણનો લાભ પૂરો પાડે છે, ત્યારે તેને જરૂરી કિરણોત્સર્ગી સામગ્રી ટૂંકા શેલ્ફ-લાઇફ સાથે મોંઘી છે અને સાયક્લોહેક્સિમાઇડ કરતાં વધુ સાવધાની રાખવાની માંગ કરે છે. ગેરફાયદા સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પીછો પરીક્ષણો કરવાના કેટલાક ગેરફાયદાઓમાં સાયક્લોહેક્સિમાઇડની ઝેરી પ્રકૃતિનો સમાવેશ થાય છે. જ્યારે લાંબા સમય સુધી ઉચ્ચ સાંદ્રતામાં ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, ત્યારે સાયક્લોહેક્સિમાઇડ કોષની અંદરના ડીએનએને નુકસાન પહોંચાડશે અને નિર્ણાયક કોષીય કાર્યને નુકસાન પહોંચાડશે. આ કારણોસર, સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પીછો સામાન્ય રીતે 12 કલાકથી વધુ સમય સુધી ચાલતો નથી. જો ખાસ કરીને સ્થિર પ્રોટીનના ટર્નઓવરનો અભ્યાસ કરવામાં આવે તો આ એક મર્યાદા રજૂ કરે છે. વધુમાં, સાયક્લોહેક્સિમાઇડ પીછો માત્ર પલ્સ પીછો જેવા નવા અનુવાદિત પ્રોટીન સ્તરોના વિરોધમાં સ્થિર સ્થિતિ પ્રોટીન સ્તરને જોવાની ક્ષમતા પ્રદાન કરે છે. તેથી, માત્ર પ્રોટીનનું અધઃપતન જોઇ શકાય છે અને પ્રોટીનની પરિપક્વતા નહીં. સંદર્ભો પ્રયોગો મોલેક્યુલર બાયોલોજી સેલ બાયોલોજી પ્રોટીન