Ribonucleoprotein Networks Analyzed by Mutational Profiling
રિબોન્યુક્લિયોપ્રોટીન નેટવર્ક્સ એનાલાઈઝ્ડ બાય મ્યુટેશનલ પ્રોફાઇલિંગ (આર. એન. પી.-એમ. એ. પી.) એ ન્યુક્લિયોટાઇડ રિઝોલ્યુશન પર આર. એન. એ.-પ્રોટીન નેટવર્ક અને પ્રોટીન બંધનકર્તા સ્થળોની તપાસ કરવાની વ્યૂહરચના છે. આરએનપી એસેમ્બલી અને કાર્ય વિશેની માહિતી જૈવિક પદ્ધતિઓની વધુ સારી સમજણને સરળ બનાવી શકે છે. આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. આર. એન. એ.-બાઉન્ડ પ્રોટીનને સ્થિર કરવા માટે એન. એચ. એસ.-ડાયઝિરિન (એસ. ડી. એ.) નો ઉપયોગ કરે છે, જે એક હેટેરો-બાયફંક્શનલ ક્રોસ લિંકર છે. એકવાર આર. એન. એ.-પ્રોટીન ક્રોસ લિંક્સની રચના થઈ જાય પછી, એમ. એ. પી. રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પછી પ્રોટીન-બાઉન્ડ આર. એન. એ. ને રિવર્સલી ટ્રાન્સક્રિપ્ટ કરવા તેમજ આર. એન. એ.-પ્રોટીન ક્રોસ લિંક્સના સ્થળ પર પરિવર્તન લાવવા માટે હાથ ધરવામાં આવે છે. સી. ડી. એન. એ. ના અનુક્રમ પરિણામો પ્રોટીન-આર. એન. એ. ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નેટવર્ક અને પ્રોટીન બંધનકર્તા સ્થળો બંને વિશેની માહિતી જાહેર કરે છે. વ્યૂહરચના ઘટકો આર. એન. એ.-એમ. એ. પી. માં ત્રણ મુખ્ય ઘટકોનો સમાવેશ થાય છેઃ રિબોન્યુક્લિયોપ્રોટીન (આર. એન. પી.): આર. એન. એ. અને આર. એન. એ.-બંધનકર્તા પ્રોટીન (આર. બી. પી.) એન. એચ. એસ.-ડાયઝિરિન (એસ. ડી. એ.) થી બનેલા સંકુલઃ એક કોષ પારગમ્ય ક્રોસ-લિંકિંગ રીએજન્ટ. એસ. ડી. એ. માં બે પ્રતિક્રિયાશીલ જૂથો છે-એક ડાયઝિરિન અને એક સુકિનિમિડાઇલ એસ્ટર. સુકિનિમિડાયલ એસ્ટર અને એમાઇન જૂથો વચ્ચેની પ્રતિક્રિયા (દા. ત. લાઇસિન બાજુની સાંકળો) પેપ્ટાઇડ બોન્ડ્સ (અથવા એમાઇડ બોન્ડ્સ) માં પરિણમે છે. જ્યારે 365 એનએમની તરંગલંબાઇ સાથે યુવી પ્રકાશના સંપર્કમાં આવે છે, ત્યારે મધ્યવર્તી ન્યુક્લિયોટાઇડ રાઇબોઝ અને પાયા તરફ વ્યાપક રીતે પ્રતિક્રિયાશીલ બને છે. પરિણામે, એસ. ડી. એ. લિંકર દ્વારા પ્રોટીનને આર. એન. એ. સાથે જોડવામાં આવે છે. મ્યુટેશનલ પ્રોફાઇલિંગ (એમ. એ. પી.): પ્રોટીન-આર. એન. એ. બંધનકર્તા સ્થળો પર સુધારેલા અવશેષોનો સમાવેશ કરવા માટે રિલેક્સ્ડ ફિડેલિટી સાથે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરતી પદ્ધતિ. કાર્યપ્રવાહ લાંબા તરંગલંબાઇના યુવી અને એસડીએ રીએજન્ટ્સ સૌપ્રથમ જીવંત કોષોને પ્રોટીન અવશેષોને આરએનએ સાથે ક્રોસ લિંક કરવા માટે લાઇસિન (અથવા આર્જિનિન) અવશેષો અને સુકિનિમિડાઇલ એસ્ટરના એમાઇન જૂથો વચ્ચે એમાઇડ બોન્ડ્સ બનાવીને પૂરા પાડવામાં આવે છે. આગળ, ક્રોસ-લિંક્ડ આર. એન. પી. ધરાવતા કોષોને લીઝ્ડ કરવામાં આવે છે અને આર. એન. એ.-બાઉન્ડ પ્રોટીનને પેપ્ટાઇડ એડક્ટ્સમાં પચાવવામાં આવે છે. એમએપી રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પછી પેપ્ટાઇડ એડક્ટ-પ્રેરિત પરિવર્તન દ્વારા પ્રોટીન-આરએનએ બંધનકર્તા સાઇટ્સને લેબલ કરવા માટે કરવામાં આવે છે. મ્યુટેશન ધરાવતા સી. ડી. એન. એ. ઉત્પાદનનો ક્રમ મ્યુટેશન સાઇટ્સ (અથવા આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. સાઇટ્સ) જાહેર કરશે અને આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. સાઇટ્સ વચ્ચેના સહસંબંધો 3-ન્યુક્લિયોટાઇડ વિંડોઝનો ઉપયોગ કરીને ગણતરીત્મક રીતે નક્કી કરવામાં આવે છે. વિશ્લેષણ આરએનપી-એમએપી સાઇટ ઓળખ આરએનપી-એમએપી સાઇટ્સને પ્રોટીન બાઉન્ડ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે. એસડીએ અને યુવી સારવાર કરાયેલ અને યુવી માત્ર સારવાર કરાયેલ નમૂના ક્રમ વાંચન ગોઠવાયેલ છે અને પરિવર્તનની ગણતરી શેપમેપર2 સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે. ન્યુક્લિયોટાઇડ માટે એસ. ડી. એ. અથવા આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. પ્રતિક્રિયા એ ક્રોસ-લિંક્ડ (એસ. ડી. એ. અને યુવી સારવાર) મ્યુટેશનલ આવર્તન અને અન-ક્રોસ-લિંક્ડ (યુવી માત્ર) મ્યુટેશન આવર્તનનો ગુણોત્તર છે. વિભેદક મ્યુટેશનલ સિગ્નેચરનો ઉપયોગ કરીને, RNP-MaP સાઇટ્સની ઓળખ સાર્વત્રિક સામાન્યકરણ પરિબળો અને જાણીતા માળખાના રિબોન્યુક્લિયોપ્રોટીનના વિશ્લેષણમાંથી મેળવેલા દરેક RNA ન્યુક્લિયોટાઇડ (U, A, C અને G) પર થ્રેશોલ્ડના આધારે કરવામાં આવે છે. ન્યુક્લિયોટાઇડને આરએનપી-એમએપી સાઇટ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે જો તે ત્રણ ગાળકો પસાર કરે છેઃ એસડીએ + યુવી-સારવાર નમૂનામાં પરિવર્તનની ઘટનાઓની સંખ્યા યુવી-સારવાર નમૂના કરતાં ઓછામાં ઓછી 50 વધારે હોય છે. સાઇટ પ્રતિક્રિયાઓ ન્યુક્લિયોટાઇડ-આધારિત થ્રેશોલ્ડ () ને ઓળંગી જવી જોઈએ જેને પ્રયોગમૂલક રીતે આ રીતે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છેઃ જ્યાં ન્યુક્લિયોટાઇડ યુ, એ, સી, અથવા જી એ પૃષ્ઠભૂમિ થ્રેશોલ્ડ છે જે ન્યુક્લિયોટાઇડના 90 ટકા પ્રતિક્રિયા મૂલ્યો દ્વારા વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે જે> 10 Å જૂથમાં છે તે તમામ ન્યુક્લિયોટાઇડ માટે તમામ પ્રતિક્રિયાઓનું મધ્ય છે જે તમામ ન્યુક્લિયોટાઇડ માટે પ્રતિક્રિયાઓનું પ્રમાણભૂત વિચલન છે ગણતરી કરેલ ઝેડ-પરિબળ શૂન્ય કરતા વધારે છે ગણતરી કરેલ ઝેડ-પરિબળને આ રીતે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે, જ્યાં એસડીએ અને યુવી સાથે સારવાર કરાયેલ ન્યુક્લિયોટાઇડનો પરિવર્તન દર છે અને તે માત્ર યુવી સાથે સારવાર કરાયેલ ન્યુક્લિયોટાઇડનો પરિવર્તન દર છે, જ્યાં સારવાર (એસડીએ + યુવી અથવા યુવી માત્ર) પ્રોટીન-આરએનએ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા નેટવર્ક છે. આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. સહસંબંધો આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. સ્થળોથી સ્વતંત્ર આર. એન. એ. સાથે પ્રોટીન બંધનનું પૂરક માપ પ્રદાન કરે છે. તેમને રિંગમેપર તરીકે ઓળખાતા જી-ટેસ્ટ માળખાનો ઉપયોગ કરીને ઓળખવામાં આવે છે. આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. સહસંબંધ માટે એક જ આર. એન. એ. પરમાણુને ઓછામાં ઓછી બે આંતરજોડાણો બનાવવાની જરૂર પડે છે અને તે ત્રણમાંથી કોઈપણ પરિસ્થિતિમાંથી ઉદ્ભવે છેઃ એક પ્રોટીન એક આર. એન. એ. ના બે સ્થાનો સાથે જોડાય છે બે પ્રોટીન કે જે એક આર. એન. એ. પર બે સ્થાનો સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે અને જોડાય છે બે પ્રોટીન એક આર. એન. એ. પર બે સ્થાનો પર સંકલિત એસેમ્બલી પ્રક્રિયા દ્વારા જમા થાય છે. આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. સહસંબંધોનો ઉપયોગ કરીને, પ્રોટીન-આર. એન. એ. ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સ્થળોનું નેટવર્ક મળી આવે છે અને પછી તેનો ઉપયોગ કાર્યાત્મક વિશ્લેષણ માટે થઈ શકે છે. સંબંધિત પદ્ધતિઓ ક્રોસ-લિંકિંગ ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન (સી. એલ. આઈ. પી.) સી. એલ. આઈ. પી. યુવી ક્રોસ-લિંકિંગ અને ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશનને જોડીને આર. એન. એ. સાથે પ્રોટીનની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનું વિશ્લેષણ કરે છે. સી. એલ. આઈ. પી. આધારિત તકનીકો જીનોમ-વાઇડ સ્કેલ પર રસના આર. એન. એ. બંધનકર્તા પ્રોટીન બંધનકર્તા સ્થળોનો નકશો બનાવવામાં સક્ષમ છે. ઘણી સી. એલ. આઈ. પી. આધારિત પદ્ધતિઓ છે જેમાં નીચેનાનો સમાવેશ થાય છેઃ એચ. આઈ. ટી. એસ.-સી. એલ. આઈ. પી. (ક્રોસ-લિંકિંગ ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન અથવા સી. એલ. આઈ. પી.-સેક્ દ્વારા અલગ કરાયેલ આર. એન. એ. નું ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ) પી. એ. આર.-સી. એલ. આઈ. પી. (ફોટોએક્ટિવેટેબલ રિબોન્યુક્લિયોસાઇડ-ઉન્નત ક્રોસ-લિંકિંગ અને ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન) આઈ. સી. એલ. આઈ. પી. (વ્યક્તિગત ન્યુક્લિયોટાઇડ-રીઝોલ્યુશન ક્રોસ-લિંકિંગ અને ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન) ઈ. સી. એલ. આઈ. પી. (ઉન્નત ક્રોસ-લિંકિંગ અને ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન પછી ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિક્વન્સિંગ) એસ. સી. એલ. આઈ. પી. (સરળ ક્રોસ-લિંકિંગ અને ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન) માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી ક્વોન્ટિટેટિવ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (એમ. એસ.) લેબલિંગ એમએસ પદ્ધતિઓમાં સ્થિર આઇસોટોપ લેબલ્સનો વિભેદક ઉપયોગ અથવા નમૂનાઓ અને નિયંત્રણોમાં પ્રોટીનનું રાસાયણિક ટેગિંગ સામેલ છે. આનો ઉપયોગ લેબલ થયેલ પેપ્ટાઇડ્સના ગુણોત્તર દ્વારા સંવર્ધન સ્કોર્સ અને સાચા બંધનકર્તા ભાગીદારો મેળવવા માટે થાય છે. લેબલ-મુક્ત એમએસ પદ્ધતિઓ નમૂનાઓ અને નિયંત્રણોમાં પ્રોટીનને ઓળખવામાં સક્ષમ છે. બિન-વિશિષ્ટ પ્રોટીન માટે સાચા બંધનકર્તા ભાગીદારોને અલગ પાડવા માટે, બિન-માત્રાત્મક એમ. એસ. માંથી વર્ણપટ ગણતરી ડેટાની સાથે ઉપયોગમાં લેવાતા વિશ્લેષણાત્મક સાધનોનો ઉપયોગ સાચા આર. બી. પી.-આર. એન. એ. ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની સંભાવનાને સ્કોર કરવા માટે થાય છે ફાયદા અને મર્યાદાઓ આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. બંધનકર્તા સ્થળની ઘનતા દ્વારા કાર્યાત્મક રીતે મહત્વપૂર્ણ આર. એન. એ.-પ્રોટીન બંધનકર્તા નેટવર્કને જાહેર કરવામાં મદદ કરી શકે છે અને ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા પ્રોટીનના અગાઉના જ્ઞાનથી સ્વતંત્ર છે. વિશ્લેષણની નિષ્પક્ષ પ્રકૃતિને કારણે, આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. પ્રજાતિઓ વચ્ચે સંરક્ષિત આર. એન. એ.-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ શોધી શકે છે. આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. મોટા બિન-કોડિંગ આર. એન. એ. અથવા તો વાયરલ આર. એન. એ. માં કાર્યાત્મક રીતે નિર્ણાયક તત્વોની લાક્ષણિકતાઓને સરળ બનાવવા માટે પણ સક્ષમ છે. મર્યાદાઓ એકલ તકનીક તરીકે, આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. નો ઉપયોગ પ્રોટીન-આર. એન. એ. બંધનકર્તા પદ્ધતિઓ અથવા પ્રોટીન ઓળખ નક્કી કરવા માટે કરી શકાતો નથી. આવું કરવા માટે, આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. નો ઉપયોગ સી. એલ. આઈ. પી. અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી જેવી અન્ય તકનીકો સાથે કરવો આવશ્યક છે. આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. ને વિશ્લેષણ માટે અત્યંત ઉચ્ચ વાંચન-ઊંડાણની જરૂર છે. આરએનપી-એમએપી સાઇટ્સને ઓળખવા માટે, 1000x સિક્વન્સિંગ કવરેજ જરૂરી છે, જ્યારે આરએનપી-એમએપી સહસંબંધ સાઇટ્સને 10,000x સિક્વન્સિંગ કવરેજની જરૂર છે. દૂરના (> 500 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ) આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. સ્થળો વચ્ચે આર. એન. પી.-એમ. એ. પી. સહસંબંધોને દર્શાવવાની ક્ષમતા પર ગંભીર મર્યાદાઓ છે. આ એમ. એ. પી. રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રક્રિયા (500-600 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ) અને સિક્વન્સિંગ ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ ક્લસ્ટરિંગ (<1,000 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ) ની મર્યાદાઓને કારણે છે. સંદર્ભો આનુવંશિક તકનીકો આરએનએ