Paired-end tag
પેઅર્ડ-એન્ડ ટેગ્સ (પીઇટી) (કેટલીકવાર "પેઅર્ડ-એન્ડ ડીટેગ્સ" અથવા ફક્ત "ડીટેગ્સ") એ ડીએનએ ટુકડાના 5 'અને 3' છેડા પરના ટૂંકા ક્રમ છે જે એટલા અનન્ય છે કે તેઓ (સૈદ્ધાંતિક રીતે) જીનોમમાં માત્ર એક જ વાર એક સાથે અસ્તિત્વ ધરાવે છે, તેથી તેમની વચ્ચેના ડીએનએનો ક્રમ શોધ પર (જો પૂર્ણ-જીનોમ અનુક્રમ ડેટા ઉપલબ્ધ હોય તો) અથવા વધુ અનુક્રમણિકા પર ઉપલબ્ધ થાય છે (કારણ કે ટેગ સાઇટ્સ પ્રાઇમર એનિલિંગ સાઇટ્સ તરીકે સેવા આપવા માટે પૂરતી અનન્ય છે). પેઅર્ડ-એન્ડ ટેગ્સ (PET) PET લાઈબ્રેરીઓમાં અસ્તિત્વ ધરાવે છે, જેમાં મધ્યવર્તી DNA ગેરહાજર હોય છે, એટલે કે, PET ટૂંકા 5 'લિંકર સિક્વન્સ, ટૂંકા 5' સિક્વન્સ ટેગ, ટૂંકા 3 'સિક્વન્સ ટેગ અને ટૂંકા 3' લિંકર સિક્વન્સનો સમાવેશ કરીને જીનોમિક અથવા cDNAના મોટા ટુકડાને "રજૂ કરે છે". તે કલ્પનાત્મક રીતે દર્શાવવામાં આવ્યું હતું કે 13 આધાર જોડીઓ વિશિષ્ટ રીતે ટૅગ્સનો નકશો બનાવવા માટે પૂરતી છે. જો કે, મેપિંગ રીડ્સ માટે લાંબી સિક્વન્સ વધુ વ્યવહારુ છે. પીઇટીના ઉત્પાદન માટે ઉપયોગમાં લેવાતા એન્ડોન્યુક્લીઝ (નીચે ચર્ચા કરેલ) લાંબા ટેગ (18/20 બેઝ જોડી અને 25/27 બેઝ જોડી) આપે છે પરંતુ 50-100 બેઝ જોડીનો ક્રમ મેપિંગ અને ખર્ચ કાર્યક્ષમતા બંને માટે શ્રેષ્ઠ રહેશે. ઘણા ડીએનએ ટુકડાઓમાંથી પી. ઈ. ટી. કાઢ્યા પછી, કાર્યક્ષમ અનુક્રમણિકા માટે તેમને એક સાથે જોડવામાં આવે છે. સરેરાશ, 20-30 ટૅગ્સને સેંગર પદ્ધતિ સાથે અનુક્રમિત કરી શકાય છે, જે વાંચવાની લાંબી લંબાઈ ધરાવે છે. ટેગ સિક્વન્સ ટૂંકા હોવાથી, વ્યક્તિગત પી. ઈ. ટી. આગામી પેઢીના સિક્વન્સિંગ માટે સારી રીતે અનુકૂળ છે જે ટૂંકા વાંચન લંબાઈ અને ઉચ્ચ થ્રુપુટ ધરાવે છે. પી. ઈ. ટી. સિક્વન્સિંગના મુખ્ય ફાયદાઓ એ છે કે માત્ર ટૂંકા ટુકડાઓને અનુક્રમિત કરીને તેની ઓછી કિંમત, જિનોમમાં માળખાકીય સ્વરૂપોની શોધ, અને સિંગલ ટેગની તુલનામાં જિનોમ સાથે સંરેખિત કરતી વખતે વિશિષ્ટતામાં વધારો, જેમાં ડીએનએ ટુકડાનો માત્ર એક જ છેડો સામેલ હોય છે. પીઇટી લાઈબ્રેરીનું નિર્માણ પીઇટી લાઈબ્રેરીઓ સામાન્ય રીતે બે સામાન્ય પદ્ધતિઓમાં તૈયાર કરવામાં આવે છેઃ ક્લોનિંગ આધારિત અને ક્લોનિંગ-મુક્ત આધારિત. ક્લોનિંગ આધારિત ફ્રેગમેન્ટેડ જીનોમિક ડીએનએ અથવા રસના પૂરક ડીએનએ (સી. ડી. એન. એ.) ને પ્લાઝમિડ વેક્ટરમાં ક્લોન કરવામાં આવે છે. ક્લોનિંગ સાઇટ્સ એડેપ્ટર સિક્વન્સ સાથે ફરતી હોય છે જેમાં એન્ડોન્યુક્લીઝ માટે પ્રતિબંધ સાઇટ્સ હોય છે (નીચે ચર્ચા). દાખલને પ્લાઝમિડ વેક્ટર સાથે જોડવામાં આવે છે અને વ્યક્તિગત વેક્ટર પછી ઇ. કોલીમાં રૂપાંતરિત થાય છે જે પીઇટી લાઇબ્રેરી બનાવે છે. પીઇટી સિક્વન્સ પ્લાઝમિડને શુદ્ધ કરીને અને વેક્ટરના છેડા પર બે ટૂંકા સિક્વન્સ છોડીને ચોક્કસ એન્ડોન્યુક્લીઝ સાથે પાચન કરીને મેળવવામાં આવે છે. ઇન્ટ્રામોલેક્યુલર (પાતળા) પરિસ્થિતિઓ હેઠળ, વેક્ટરને ફરીથી ગોળાકાર કરવામાં આવે છે અને જોડવામાં આવે છે, જે વેક્ટરમાં માત્ર ડિટેગ્સ છોડી દે છે. ક્લોન માટે અનન્ય સિક્વન્સ હવે એક સાથે જોડવામાં આવે છે. આગામી પેઢીની સિક્વન્સિંગ તકનીકના આધારે, PET સિક્વન્સને એકવચન, ડાયમેરાઇઝ્ડ અથવા લાંબી સાંકળોમાં જોડી શકાય છે. ક્લોનિંગને બદલે, એન્ડોન્યુક્લીઝ સિક્વન્સ ધરાવતા એડેપ્ટરને ફ્રેગમેન્ટેડ જીનોમિક ડીએનએ અથવા સી. ડી. એન. એ. ના છેડા સાથે જોડવામાં આવે છે. પછી અણુઓને સ્વ-ગોળાકાર કરવામાં આવે છે અને એન્ડોન્યુક્લીઝ સાથે પચાવવામાં આવે છે, જે પીઇટીને મુક્ત કરે છે. અનુક્રમણિકા પહેલાં, આ પી. ઈ. ટી. ને એડેપ્ટરો સાથે જોડવામાં આવે છે, જેમાં પી. સી. આર. પ્રાઈમર્સ એમ્પ્લીફિકેશન માટે એનેલ કરે છે. પુસ્તકાલયની ક્લોનિંગ આધારિત રચનાનો ફાયદો એ છે કે તે ભવિષ્યના ઉપયોગ માટે ટુકડાઓ અથવા સી. ડી. એન. એ. ને અકબંધ રાખે છે. જો કે, બાંધકામ પ્રક્રિયા ક્લોનિંગ-મુક્ત પદ્ધતિ કરતાં ઘણી લાંબી છે. આગામી પેઢીની અનુક્રમણિકા કંપનીઓ દ્વારા તેમની સંબંધિત તકનીકોને અનુરૂપ પુસ્તકાલય નિર્માણ પર ભિન્નતાઓ તૈયાર કરવામાં આવી છે. એન્ડોન્યુક્લીઝ અન્ય એન્ડોન્યુક્લીઝથી વિપરીત, MmeI (પ્રકાર IIS) અને EcoP15I (પ્રકાર III) પ્રતિબંધ એન્ડોન્યુક્લીઝ તેમના લક્ષ્ય બંધનકર્તા સ્થળોની નીચે તરફ કાપી નાખે છે. એમ. એમ. ઈ. આઈ. 18/20 આધાર જોડીને ડાઉનસ્ટ્રીમમાં અને EcoP15I 25/27 આધાર જોડીને ડાઉનસ્ટ્રીમમાં કાપે છે. જેમ જેમ આ પ્રતિબંધ ઉત્સેચકો એડેપ્ટરમાં સ્થિત તેમના લક્ષ્ય ક્રમમાં જોડાય છે, તેમ તેમ તેઓ વેક્ટરને કાપીને મુક્ત કરે છે જેમાં તેમની સાથે જોડાયેલા ટુકડા અથવા સી. ડી. એન. એ. ના ટૂંકા ક્રમ હોય છે, જે પી. ઈ. ટી. નું ઉત્પાદન કરે છે. પી. ઈ. ટી. કાર્યક્રમો ડી. એન. એ.-પી. ઈ. ટી.: કારણ કે પી. ઈ. ટી. ટૅગ્સ વચ્ચે જોડાણનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, જીનોમ રી-સિક્વન્સિંગમાં પી. ઈ. ટી. નો ઉપયોગ સિંગલ રીડ્સના ઉપયોગ કરતાં વધુ ફાયદાકારક છે. આ એપ્લિકેશનને જોડી મુજબ અંત અનુક્રમણિકા કહેવામાં આવે છે, જે બોલચાલની ભાષામાં ડબલ-બેરલ શોટગન અનુક્રમણિકા તરીકે ઓળખાય છે. જોડીના અડધા ભાગને જિનોમમાં એક જ સ્થાન પર અનન્ય રીતે લંગર કરવાથી બીજા અડધા ભાગનું મેપિંગ શક્ય બને છે જે અસ્પષ્ટ છે. અસ્પષ્ટ વાંચન એ છે કે જે એકથી વધુ સ્થાનનો નકશો બનાવે છે. આ વધેલી કાર્યક્ષમતા અનુક્રમણિકાના ખર્ચને ઘટાડે છે કારણ કે આ અસ્પષ્ટ સિક્વન્સ અથવા રીડ્સ સામાન્ય રીતે કાઢી નાખવામાં આવે છે. પીઇટી સિક્વન્સની કનેક્ટિવિટી માળખાકીય વિવિધતાઓને શોધવાની પણ મંજૂરી આપે છેઃ નિવેશ, કાઢી નાખવા, ડુપ્લિકેશન, વ્યુત્ક્રમ, ટ્રાન્સલોકેશન. પી. ઈ. ટી. પુસ્તકાલયના નિર્માણ દરમિયાન, ટુકડાઓ ચોક્કસ કદના હોઈ શકે છે. મેપિંગ પછી, PET સિક્વન્સ એકબીજાથી સતત ચોક્કસ અંતર દૂર રહેવાની અપેક્ષા રાખવામાં આવે છે. આ અંતરની વિસંગતતા PET સિક્વન્સ વચ્ચે માળખાકીય તફાવત સૂચવે છે. ઉદાહરણ તરીકે (જમણી બાજુની આકૃતિ): અનુક્રમિત જિનોમમાંથી કાઢી નાંખવાથી તે નકશો સંદર્ભ જિનોમમાં અપેક્ષા કરતા વધુ દૂર વાંચે છે કારણ કે સંદર્ભ જિનોમમાં ડીએનએનો એક ભાગ હશે જે અનુક્રમિત જિનોમમાં હાજર નથી. ચીપ-પીઈટીઃ ક્રોમેટિન ઇમ્યુનોપ્રેસિપિટેશન (ચીપ) અને પીઈટીનો સંયુક્ત ઉપયોગ રસના પ્રોટીન દ્વારા બંધાયેલા ડીએનએના પ્રદેશોને શોધવા માટે થાય છે. ચીપ-પી. ઈ. ટી. નો સિંગલ રીડ સિક્વન્સિંગ પર ફાયદો છે, જે પેદા થયેલ રીડ્સની અસ્પષ્ટતા ઘટાડે છે. ચિપ સંકરણ (ચીપ-ચિપ) પરનો ફાયદો એ છે કે સંકરણ ટાઇલિંગ એરેમાં આંકડાકીય સંવેદનશીલતા હોતી નથી જે અનુક્રમમાં હોય છે. જોકે, ચિપ-પીઈટી, ચિપ-સેક અને ચિપ-ચિપ બધા ખૂબ જ સફળ રહ્યા છે. ચિયા-પીઈટીઃ ક્રોમેટિન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા વિશ્લેષણ પર પીઈટી અનુક્રમણિકાનો ઉપયોગ. તે પ્રોટીન પરિબળો દ્વારા બંધાયેલા ડીએનએ ઘટકો વચ્ચે નવી લાંબા અંતરની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ શોધવા માટેની જીનોમ-વ્યાપી વ્યૂહરચના છે. પ્રથમ ચીઆ-પીઈટી ફુલવુડ એટ અલ. (2009) દ્વારા એસ્ટ્રોજન-સારવાર કરાયેલ માનવ સ્તન એડેનોકાર્સિનોમા કોષોમાં એસ્ટ્રોજન રીસેપ્ટર α (ER-α) દ્વારા બંધાયેલ ક્રોમેટિન વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનો નકશો બનાવવા માટે વિકસાવવામાં આવ્યો હતો. ચિયા-પીઈટી એ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને ઉચ્ચ ક્રમના ક્રોમેટિન માળખાઓનું વિશ્લેષણ કરવાની એક નિષ્પક્ષ રીત છે કારણ કે તે અજ્ઞાત ડીએનએ તત્વો વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ શોધી શકે છે. તેનાથી વિપરીત, 3C અને 4C પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ જિનોમમાં ચોક્કસ લક્ષ્ય વિસ્તાર સાથે સંકળાયેલી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ શોધવા માટે થાય છે. ચિયા-પીઈટી એ આરએનએ-પીઈટી દ્વારા ફ્યુઝન જનીનો શોધવા જેવું જ છે જેમાં જોડીદાર ટૅગ્સ જીનોમના વિવિધ પ્રદેશોમાં નકશો બનાવે છે. જો કે, ચિઆ-પીઈટીમાં આરએનએ-પીઈટીની જેમ બે જીનોમિક પ્રદેશો વચ્ચે કુદરતી રીતે થતા મિશ્રણને બદલે, વિવિધ જીનોમિક પ્રદેશોમાં સ્થિત વિવિધ ડીએનએ ટુકડાઓ વચ્ચે કૃત્રિમ જોડાણનો સમાવેશ થાય છે. આર. એન. એ.-પી. ઈ. ટી.: આ એપ્લિકેશનનો ઉપયોગ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમના અભ્યાસ માટે થાય છેઃ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ, જનીન માળખાં અને જનીન અભિવ્યક્તિઓ. પી. ઈ. ટી. લાઈબ્રેરી સંપૂર્ણ લંબાઈના સી. ડી. એન. એ. નો ઉપયોગ કરીને બનાવવામાં આવે છે, તેથી ડીટેગ્સ વ્યક્તિગત લખાણોના 5 'કેપ્ડ અને 3' પોલીએ પૂંછડીના હસ્તાક્ષરનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. તેથી, આર. એન. એ.-પી. ઈ. ટી. ખાસ કરીને અનુલેખન એકમોની સીમાઓનું સીમાંકન કરવા માટે ઉપયોગી છે. આ જનીનોના વૈકલ્પિક ટ્રાન્સક્રિપ્શન સ્ટાર્ટ સાઇટ્સ અને પોલીએડીનાઈલેશન સાઇટ્સને ઓળખવામાં મદદ કરશે. આર. એન. એ.-પી. ઈ. ટી. નો ઉપયોગ ફ્યુઝન જનીનો અને ટ્રાન્સ-સ્પ્લિસિંગને શોધવા માટે પણ થઈ શકે છે, પરંતુ તેમની વચ્ચે તફાવત કરવા માટે વધુ પ્રયોગની જરૂર છે. ટ્રાન્સક્રિપ્ટની સીમાઓ શોધવાની અન્ય પદ્ધતિઓમાં સિંગલ-ટેગ વ્યૂહરચનાઓ CAGE, SAGE અને સૌથી તાજેતરની સુપરસેજનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં CAGE અને 5 'SAGE ટ્રાન્સક્રિપ્શન સ્ટાર્ટ સાઇટ્સને વ્યાખ્યાયિત કરે છે અને 3' SAGE પોલીએડેનાઈલેશન સાઇટ્સને વ્યાખ્યાયિત કરે છે. આ પદ્ધતિઓ પર PET અનુક્રમણિકાના ફાયદા એ છે કે PET લખાણના બંને છેડાઓને ઓળખે છે અને તે જ સમયે, જીનોમ પર પાછા મેપિંગ કરતી વખતે વધુ વિશિષ્ટતા પ્રદાન કરે છે. સી. ડી. એન. એ. નો ક્રમ મહાન વિગતોમાં લખાણની રચનાઓ જાહેર કરી શકે છે, પરંતુ આ અભિગમ આર. એન. એ.-પી. ઈ. ટી. ક્રમ કરતાં વધુ ખર્ચાળ છે, ખાસ કરીને સમગ્ર લખાણની લાક્ષણિકતા માટે. આર. એન. એ.-પી. ઈ. ટી. ની મુખ્ય મર્યાદા ટ્રાન્સક્રિપ્ટના આંતરિક એક્સોનની સંસ્થા સંબંધિત માહિતીનો અભાવ છે. તેથી, વૈકલ્પિક સ્પ્લિસિંગ શોધવા માટે આર. એન. એ.-પી. ઈ. ટી. યોગ્ય નથી. વધુમાં, જો ક્લોનિંગ પ્રક્રિયાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે તો પી. ઈ. ટી. બનાવતા પહેલા સી. ડી. એન. એ. લાઈબ્રેરીનું નિર્માણ કરો, જે સી. ડી. એન. એ. નું ક્લોન કરવું મુશ્કેલ છે (લાંબા લખાણોના પરિણામે) તેમાં ઓછું કવરેજ હશે. તેવી જ રીતે, નીચા અભિવ્યક્તિ સ્તરવાળા લખાણ (અથવા લખાણના આઇસોફોર્મ્સ) નું પણ પ્રતિનિધિત્વ ઓછું થવાની શક્યતા છે. સંદર્ભો મોલેક્યુલર બાયોલોજી લેબોરેટરી તકનીકો મોલેક્યુલર બાયોલોજી તકનીકો ડીએનએ સિક્વન્સિંગ