Optical mapping
ઓપ્ટિકલ મેપિંગ એ "ઓપ્ટિકલ મેપ્સ" તરીકે ઓળખાતા ડીએનએના એક, રંગીન અણુઓમાંથી ક્રમબદ્ધ, જીનોમ-વાઇડ, ઉચ્ચ-રીઝોલ્યુશન પ્રતિબંધ નકશા બનાવવાની તકનીક છે. જીવતંત્રના અજ્ઞાત ડીએનએ સાથે પ્રતિબંધ એન્ઝાઇમ સાઇટ્સના સ્થાનનું મેપિંગ કરીને, પરિણામી ડીએનએ ટુકડાઓનું સ્પેક્ટ્રમ સામૂહિક રીતે તે ક્રમ માટે એક અનન્ય "ફિંગરપ્રિન્ટ" અથવા "બારકોડ" તરીકે કામ કરે છે. મૂળરૂપે 1990 ના દાયકામાં ડૉ. ડેવિડ સી. શ્વાર્ટઝ અને એનવાયયુ ખાતેની તેમની પ્રયોગશાળા દ્વારા વિકસાવવામાં આવી હતી, ત્યારથી આ પદ્ધતિ માઇક્રોબાયલ અને યુકેરીયોટિક જીનોમ બંને માટે ઘણા મોટા પાયે સિક્વન્સિંગ પ્રોજેક્ટ્સની એસેમ્બલી પ્રક્રિયાનો અભિન્ન ભાગ છે. પછીની તકનીકો ઓપ્ટિકલ મેપિંગ્સ બનાવવા માટે ડીએનએ ગલન, ડીએનએ સ્પર્ધાત્મક બંધન અથવા એન્ઝાઇમેટિક લેબલિંગનો ઉપયોગ કરે છે. ટેક્નોલોજી આધુનિક ઓપ્ટિકલ મેપિંગ પ્લેટફોર્મ નીચે મુજબ કામ કરે છેઃ જીનોમિક ડીએનએ લાઇસ્ડ કોષોમાંથી મેળવવામાં આવે છે, અને ઓપ્ટિકલ મેપિંગ માટે મોટા જીનોમિક અણુઓની "લાઇબ્રેરી" ઉત્પન્ન કરવા માટે અવ્યવસ્થિત રીતે કાપવામાં આવે છે. ડીએનએનો એક અણુ ખેંચાય છે (અથવા લંબાય છે) અને ચાર્જ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને કારણે ફ્લોરોસન્ટ માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ સ્લાઇડ પર રાખવામાં આવે છે. ડીએનએ પરમાણુ વધારાના પ્રતિબંધ ઉત્સેચકો દ્વારા પચાવવામાં આવે છે, જે ચોક્કસ પાચન સ્થળો પર વિભાજીત થાય છે. પરિણામી પરમાણુ ટુકડાઓ સપાટી સાથે જોડાયેલા રહે છે. ક્લેવેજ સાઇટ્સ પરનો ટુકડો અંત પાછો ખેંચાય છે (રેખીય ડીએનએની સ્થિતિસ્થાપકતાને કારણે), જે માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ ઓળખી શકાય તેવા અંતરાયોને છોડી દે છે. ઇન્ટરકલેટિંગ ડાય સાથે રંગીન ડીએનએ ટુકડાઓ ફ્લોરોસન્સ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા જોવામાં આવે છે અને સંકલિત ફ્લોરોસન્સની તીવ્રતાને માપવા દ્વારા માપવામાં આવે છે. આ એક અણુનો ઓપ્ટિકલ નકશો બનાવે છે. સર્વસંમતિ, જીનોમિક ઓપ્ટિકલ નકશો બનાવવા માટે વ્યક્તિગત ઓપ્ટિકલ નકશાને જોડવામાં આવે છે. ઓપ્ટિકલ મેપિંગ પ્લેટફોર્મનો ઇતિહાસ પ્રારંભિક સિસ્ટમ ડીએનએ પરમાણુઓ કવર સ્લિપ અને માઇક્રોસ્કોપ સ્લાઇડ વચ્ચે વિકસિત પીગળેલા એગરોઝ પર નિશ્ચિત કરવામાં આવ્યા હતા. રિસ્ટ્રિક્શન એન્ઝાઇમને ડીએનએ પ્લેસમેન્ટ પહેલાં પીગળેલા એગરોઝ સાથે પૂર્વ-મિશ્રિત કરવામાં આવ્યું હતું અને મેગ્નેશિયમના ઉમેરાથી ક્લેવેજ શરૂ થયું હતું. ચાર્જ કરેલી સપાટીઓનો ઉપયોગ કરીને જેલ મેટ્રિક્સમાં સ્થિર રહેવાને બદલે, ડીએનએ પરમાણુઓને હકારાત્મક રીતે ચાર્જ કરેલી સપાટી પર ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા રાખવામાં આવ્યા હતા. રિઝોલ્યુશનમાં એવો સુધારો થયો કે ટુકડાઓ ~ 30 કે. બી. થી 800 બી. પી. જેટલા નાના થઈ શકે. ઓટોમેટેડ સિસ્ટમ આમાં સમાંતર એન્ઝાઇમેટિક પ્રક્રિયા માટે સ્લાઇડ પર બહુવિધ એક અણુઓ (જેમ કે માઇક્રોએરે) શોધવા માટે સ્વચાલિત સ્પોટિંગ સિસ્ટમનો વિકાસ અને એકીકરણ, છબી સંપાદન માટે સ્વચાલિત ફ્લોરોસન્સ માઇક્રોસ્કોપી, છબીઓને નિયંત્રિત કરવા માટે છબી સરઘસ દ્રષ્ટિ, ઓપ્ટિકલ નકશા નિર્માણ માટે અલ્ગોરિધમ્સ, મોટી માત્રામાં ડેટાની પ્રક્રિયા માટે ક્લસ્ટર કમ્પ્યુટિંગ માઇક્રોફ્લુઇડિક્સનો ઉપયોગ કરીને ઉચ્ચ-થ્રુપુટ સિસ્ટમ એક અણુ સાથે જોવા મળતા માઇક્રોએરે મોટા જીનોમિક ડીએનએ અણુઓ માટે સારી રીતે કામ કરતા નથી, સમાંતર માઇક્રોચેનલ્સની શ્રેણી ધરાવતી સોફ્ટ લિથોગ્રાફીનો ઉપયોગ કરીને માઇક્રોફ્લુઇડિક ઉપકરણો વિકસાવવામાં આવ્યા હતા. નેનોકોડિંગ ટેકનોલોજીનો ઉપયોગ કરીને આગામી પેઢીની પ્રણાલી ઓપ્ટિકલ મેપિંગમાં સુધારો, જેને "નેનોકોડિંગ" કહેવાય છે, તેમાં નેનોકોન્ફિનેમેન્ટ્સમાં વિસ્તરેલા ડીએનએ અણુઓને ફસાવવાની ક્ષમતા છે. સરખામણીઓ અન્ય મેપિંગ તકનીકો પરંપરાગત મેપિંગ તકનીકો પર OM નો ફાયદો એ છે કે તે DNA ટુકડાના ક્રમને જાળવી રાખે છે, જ્યારે પ્રતિબંધ મેપિંગનો ઉપયોગ કરીને ક્રમને ફરીથી બનાવવાની જરૂર છે. વધુમાં, નકશા સીધા જ જીનોમિક ડીએનએ અણુઓમાંથી બનાવવામાં આવે છે, તેથી ક્લોનિંગ અથવા પી. સી. આર. કલાકૃતિઓ ટાળવામાં આવે છે. જો કે, દરેક OM પ્રક્રિયા હજુ પણ ખોટી હકારાત્મક અને નકારાત્મક સાઇટ્સથી પ્રભાવિત થાય છે કારણ કે દરેક અણુમાં તમામ પ્રતિબંધ સાઇટ્સ વિભાજીત થતી નથી અને કેટલીક સાઇટ્સ ખોટી રીતે કાપવામાં આવી શકે છે. વ્યવહારમાં, એક જ જીનોમિક પ્રદેશના અણુઓમાંથી બહુવિધ ઓપ્ટિકલ નકશા બનાવવામાં આવે છે, અને શ્રેષ્ઠ સર્વસંમતિ નકશો નક્કી કરવા માટે એક અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. જીનોમ વિશ્લેષણની અન્ય પદ્ધતિઓ જીનોમ વચ્ચે મોટા પાયે જીનોમિક વિવિધતાઓ (જેમ કે ઇન્ડેલ્સ, ડુપ્લિકેશન, ઇન્વર્ઝન, ટ્રાન્સલોકેશન) ને ઓળખવા માટે વિવિધ અભિગમો છે. પદ્ધતિઓની અન્ય શ્રેણીઓમાં માઇક્રોએરે, પલ્સડ-ફિલ્ડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસિસ, સાયટોજેનેટિક્સ અને પેયર્ડ-એન્ડ ટેગનો ઉપયોગ કરવાનો સમાવેશ થાય છે. ઉપયોગો શરૂઆતમાં, ઓપ્ટિકલ મેપિંગ સિસ્ટમનો ઉપયોગ બેક્ટેરિયા, પરોપજીવીઓ અને ફૂગના સંપૂર્ણ-જીનોમ પ્રતિબંધ નકશા બનાવવા માટે કરવામાં આવ્યો છે. તેનો ઉપયોગ બેક્ટેરિયલ જીનોમ્સને સ્કેફોલ્ડ અને માન્ય કરવા માટે પણ કરવામાં આવે છે. એસેમ્બલી માટે સ્કેફોલ્ડ્સ તરીકે સેવા આપવા માટે, એસેમ્બલ સિક્વન્સ કોન્ટિગ્સને જાણીતા સિક્વન્સ ડેટાનો ઉપયોગ કરીને સિલિકોમાં પ્રતિબંધ સાઇટ્સ માટે સ્કેન કરી શકાય છે અને તેમને એસેમ્બલ જીનોમિક ઓપ્ટિકલ નકશા સાથે સંરેખિત કરી શકાય છે. વાણિજ્યિક કંપની, ઓપજેને માઇક્રોબાયલ જીનોમ માટે ઓપ્ટિકલ મેપિંગ પ્રદાન કર્યું છે. મોટા યુકેરીયોટિક જીનોમ માટે, માત્ર ડેવિડ સી. શ્વાર્ટઝ લેબ (હવે મેડિસન-વિસ્કોન્સિન ખાતે) એ માઉસ, માનવ, ચોખા અને મકાઈ માટે ઓપ્ટિકલ નકશા તૈયાર કર્યા છે. ઓપ્ટિકલ સિક્વન્સિંગ એ સિંગલ મોલેક્યુલ ડીએનએ સિક્વન્સિંગ તકનીક છે જે સિક્વન્સ-બાય-સિન્થેસિસને અનુસરે છે અને ઓપ્ટિકલ મેપિંગ તકનીકનો ઉપયોગ કરે છે. એસ. એમ. આર. ટી. સિક્વન્સિંગ જેવા અન્ય સિંગલ મોલેક્યુલર સિક્વન્સિંગ અભિગમોની જેમ, આ તકનીક પ્રારંભિક નમૂનાને વિસ્તૃત કરવાને બદલે એક જ ડીએનએ અણુનું વિશ્લેષણ કરે છે અને ડીએનએની બહુવિધ નકલોને અનુક્રમિત કરે છે. સંશ્લેષણ દરમિયાન, ફ્લોરોક્રોમ-લેબલવાળા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને ડીએનએ પોલિમરેઝના ઉપયોગ દ્વારા સમાવિષ્ટ કરવામાં આવે છે અને ફ્લોરોસન્સ માઇક્રોસ્કોપી દ્વારા ટ્રેક કરવામાં આવે છે. આ તકનીકની શરૂઆત 2003માં ડેવિડ સી. શ્વાર્ટઝ અને અરવિંદ રામનાથન દ્વારા કરવામાં આવી હતી. ઓપ્ટિકલ સિક્વન્સિંગ ચક્ર ઓપ્ટિકલ સિક્વન્સિંગ પ્રક્રિયામાં દરેક ચક્રની ઝાંખી નીચે મુજબ છે. પગલું 1: ડીએનએ બારકોડિંગ કોષોને જીનોમિક ડીએનએ મુક્ત કરવા માટે બંધ કરવામાં આવે છે. આ ડીએનએ પરમાણુઓ ગૂંચવાયેલા નથી, માઇક્રોફ્લુઇડિક ચેનલો ધરાવતી ઓપ્ટિકલ મેપિંગ સપાટી પર મૂકવામાં આવે છે અને ડીએનએને ચેનલોમાંથી વહેવા દેવામાં આવે છે. આ અણુઓને પછી ઓપ્ટિકલ મેપિંગની તકનીક દ્વારા જીનોમિક સ્થાનિકીકરણ માટે પરવાનગી આપવા માટે પ્રતિબંધ ઉત્સેચકો દ્વારા બારકોડ કરવામાં આવે છે. તે પગલાંઓ માટે "ટેકનોલોજી" પરનો ઉપરોક્ત વિભાગ જુઓ. પગલું 2: માઉન્ટ થયેલ ડીએનએ પરમાણુઓને અવ્યવસ્થિત રીતે નિક કરવા માટે ટેમ્પલેટ નિકિંગ ડીએનએઝ I ઉમેરવામાં આવે છે. પછી DNase I ને દૂર કરવા માટે ધોવા કરવામાં આવે છે. નમૂના દીઠ નિકની સરેરાશ સંખ્યા DNase I ની સાંદ્રતા તેમજ સેવનના સમય પર આધારિત છે. પગલું 3: ગેપ રચના T7 એક્સોન્યુક્લીઝ ઉમેરવામાં આવે છે જે 5 '-3' દિશામાં અંતરાયોને વિસ્તૃત કરવા માટે DNA અણુઓમાં નિકનો ઉપયોગ કરે છે. ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ વિરામના વધુ પડતા સ્તરને ટાળવા માટે T7 એક્સોન્યુક્લીઝની માત્રાને કાળજીપૂર્વક નિયંત્રિત કરવી આવશ્યક છે. પગલું 4: ફ્લોરોક્રોમ સમાવેશ ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ દરેક ડીએનએ પરમાણુ સાથે બહુવિધ ગેપ્ડ સાઇટ્સમાં ફ્લોરોક્રોમ-લેબલ્ડ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (એફ. ડી. એન. ટી. પી.) નો સમાવેશ કરવા માટે થાય છે. દરેક ચક્ર દરમિયાન, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં એક જ પ્રકારનું એફ. ડી. એન. ટી. પી. હોય છે અને તે ન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રકારનાં બહુવિધ ઉમેરાઓ માટે પરવાનગી આપે છે. પછી ઇમેજિંગ અને એફ. ડી. એન. ટી. પી. ઉમેરણના આગામી ચક્રની તૈયારીમાં બિનસંગઠિત એફ. ડી. એન. ટી. પી. ને દૂર કરવા માટે વિવિધ ધોવા કરવામાં આવે છે. પગલું 5: ઇમેજિંગ આ પગલું ફ્લોરોસન્સ માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને અંતર પ્રદેશોમાં સમાવિષ્ટ ફ્લોરોક્રોમ-લેબલવાળા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સની સંખ્યાની ગણતરી કરે છે. પગલું 6: ફોટોબ્લીચિંગ ફ્લોરોક્રોમને ઉત્તેજિત કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા લેસર ઇલ્યુમિનેશનનો ઉપયોગ અહીં ફ્લોરોક્રોમ સિગ્નલને નષ્ટ કરવા માટે પણ થાય છે. આ અનિવાર્યપણે ફ્લોરોક્રોમ કાઉન્ટરને રીસેટ કરે છે, અને આગામી ચક્ર માટે કાઉન્ટર તૈયાર કરે છે. આ પગલું ઓપ્ટિકલ સિક્વન્સિંગનું એક અનોખું પાસું છે કારણ કે તે વાસ્તવમાં ન્યુક્લિયોટાઇડના ફ્લોરોક્રોમ લેબલને તેના સમાવેશ પછી દૂર કરતું નથી. ફ્લોરોક્રોમ લેબલને દૂર ન કરવાથી અનુક્રમણિકા વધુ આર્થિક બને છે, પરંતુ તે ફ્લોરોક્રોમ લેબલને સતત સામેલ કરવાની જરૂરિયાતમાં પરિણમે છે જે લેબલના જથ્થાને કારણે સમસ્યાઓમાં પરિણમી શકે છે. પગલું 7: પગલાંઓનું પુનરાવર્તન કરો 4-6 પગલાંઓનું પુનરાવર્તન પગલું 4 સાથે પ્રતિક્રિયા મિશ્રણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવે છે જેમાં દરેક વખતે અલગ ફ્લોરોક્રોમ-લેબલવાળા ન્યુક્લિયોટાઇડ (એફ. ડી. એન. ટી. પી.) હોય છે. જ્યાં સુધી ઇચ્છિત વિસ્તાર અનુક્રમિત ન થાય ત્યાં સુધી આનું પુનરાવર્તન કરવામાં આવે છે. ઓપ્ટિમાઇઝેશન વ્યૂહરચનાઓ આધાર ઉમેરા પગલાની કાર્યક્ષમતા માટે યોગ્ય ડીએનએ પોલિમરેઝની પસંદગી મહત્વપૂર્ણ છે અને તે કેટલાંક માપદંડોને પૂર્ણ કરતી હોવી જોઈએઃ સતત સ્થાનો પર એફ. ડી. એન. ટી. પી. નો અસરકારક રીતે સમાવેશ કરવાની ક્ષમતા 3 '-5' એક્સોન્યુક્લીઝનો અભાવ અને નવા સમાવિષ્ટ એફ. ડી. એન. ટી. પી. ને દૂર કરવાથી રોકવા માટે પ્રૂફરીડિંગ પ્રવૃત્તિ ખોટી રચનાઓને ઘટાડવા માટે ઉચ્ચ વફાદારી સપાટીઓ પર માઉન્ટ થયેલ નમૂનાઓ પર સારી પ્રવૃત્તિ (દા. ત. ઓપ્ટિકલ મેપિંગ સરફેસ) વધુમાં, વિવિધ ફ્લોરોક્રોમ માટે વિવિધ પોલિમરેઝ પસંદગી, ફ્લોરોક્રોમ-ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ પર લિંકરની લંબાઈ અને બફર કમ્પોઝિશન પણ બેઝ એડિશન પ્રક્રિયાને શ્રેષ્ઠ બનાવવા અને સતત એફ. ડી. એન. ટી. પી. સંયોજનોની સંખ્યાને મહત્તમ કરવા માટે ધ્યાનમાં લેવાના મહત્વપૂર્ણ પરિબળો છે. ફાયદા એક અણુનું વિશ્લેષણ ન્યૂનતમ ડીએનએ નમૂનાની જરૂર હોવાથી, નમૂના તૈયાર કરવાની પ્રક્રિયાને સુવ્યવસ્થિત કરવા માટે સમય માંગી લે તેવું અને ખર્ચાળ વિસ્તરણ પગલું ટાળવામાં આવે છે. મોટા ડી. એન. એ. પરમાણુ નમૂનાઓ (~ 500 કે. બી.) વિરુદ્ધ ટૂંકા ડી. એન. એ. અણુ નમૂનાઓ (<1કે. બી.) જ્યારે મોટાભાગની આગામી પેઢીની અનુક્રમણિકા તકનીકો મોટા પ્રમાણમાં નાના અનુક્રમ વાંચનનું લક્ષ્ય રાખે છે, ત્યારે આ નાના અનુક્રમ વાંચન ડી નોવો અનુક્રમણિકા પ્રયત્નો અને જીનોમ પુનરાવર્તિત પ્રદેશોને સમજવા માટે મુશ્કેલ બનાવે છે. ઓપ્ટિકલ સિક્વન્સિંગ સિક્વન્સિંગ માટે મોટા ડીએનએ પરમાણુ નમૂનાઓ (~ 500 કે. બી.) નો ઉપયોગ કરે છે અને આ નાના નમૂનાઓ કરતાં ઘણા ફાયદા પ્રદાન કરે છેઃ આ મોટા ડીએનએ નમૂનાઓ આત્મવિશ્વાસ સાથે તેમના જીનોમિક સ્થાનિકીકરણને નિર્ધારિત કરવા માટે "ડીએનએ બારકોડેડ" હોઈ શકે છે. તેથી, મોટા નમૂનામાંથી લેવામાં આવેલા કોઈપણ ક્રમને ઉચ્ચ સ્તરના આત્મવિશ્વાસ સાથે જીનોમ પર મેપ કરી શકાય છે. વધુ મહત્ત્વની વાત એ છે કે, ઉચ્ચ પુનરાવર્તિત પ્રદેશોમાંથી અનુક્રમ વાંચન વધુ આત્મવિશ્વાસ સાથે મૂકી શકાય છે જ્યારે ટૂંકા વાંચન ઉચ્ચ પુનરાવર્તિત પ્રદેશોમાં મેપિંગ અનિશ્ચિતતાથી પીડાય છે. સંદર્ભ જીનોમ સાથે સિંગલ-મોલેક્યુલ બારકોડ્સને સંરેખિત કરવા માટે ઓપ્ટિકલ મેપિંગ અને નેનોકોડિંગ જેવા વિશેષ અલ્ગોરિધમ્સ અને સોફ્ટવેર વિકસાવવામાં આવ્યા છે. બહુવિધ ક્રમ સમાન મોટા નમૂના પરમાણુમાંથી વાંચે છે. આ બહુવિધ ક્રમ વાંચન ડી નોવો એસેમ્બલીની જટિલતાને ઘટાડે છે, જીનોમિક પુનઃગોઠવણી પ્રદેશોને અસ્પષ્ટ કરે છે, અને "કોઈપણ એસેમ્બલી ભૂલોથી આંતરિક રીતે મુક્ત" છે. અનુક્રમ સંપાદન સાથે મોટા ડીએનએ મોલેક્યુલર ટેમ્પ્લેટ્સનું મોલેક્યુલર બારકોડિંગ વ્યાપક અને ચોક્કસ જીનોમિક વિશ્લેષણ પ્રદાન કરે છે ગેરફાયદા સિંગલ મોલેક્યુલ ડીએનએ સિક્વન્સિંગને વર્તમાન આગામી પેઢીની સિક્વન્સિંગ તકનીકો દ્વારા પ્રદાન કરવામાં આવેલા બિનજરૂરી રીડ કવરેજમાંથી આત્મવિશ્વાસને મેચ કરવા માટે ઉચ્ચ સ્તરની ચોકસાઇની જરૂર છે. અનુક્રમ-દર-સંશ્લેષણ દરમિયાન નીચા નમૂનામાં પરિણમે છે તે સમાન સ્થિતિ પર બંને સેર પર નીકળે છે. ફ્લોરોક્રોમ-લેબલવાળા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને સમાવેશ કર્યા પછી દૂર કરવામાં આવતા નથી અને આ વિશાળ લેબલોને કારણે, બહુવિધ સમાવેશ મુશ્કેલ હોઈ શકે છે. સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ ઓપજેન ઓપ્ટિકલ મેપિંગ સોલ્યુશન્સ ડૉ. ડેવિડ સી. શ્વાર્ટઝ લેબ બાયોફિઝિક્સ જીનોમિક્સ તકનીકો માઇક્રોસ્કોપી મોલેક્યુલર બાયોલોજી