Interference reflection microscopy
ઇન્ટરફરેન્સ રિફ્લેક્શન માઇક્રોસ્કોપી (IRM), જેને સંદર્ભના આધારે રિફ્લેક્શન ઇન્ટરફરેન્સ કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી (RICM) અથવા રિફ્લેક્શન કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી (RCM) પણ કહેવાય છે, તે એક ઓપ્ટિકલ માઇક્રોસ્કોપી તકનીક છે જે કાચની સપાટી પર ઑબ્જેક્ટની છબી બનાવવા માટે દખલ અસરોનો લાભ લે છે. સંકેતની તીવ્રતા એ કાચની સપાટી પર પદાર્થની નિકટતાનું માપ છે. આ તકનીકનો ઉપયોગ ટી. આઈ. આર. એફ. માઇક્રોસ્કોપીની જેમ (ફ્લોરોસન્ટ) લેબલનો ઉપયોગ કર્યા વિના કોષ પટલ પરની ઘટનાઓનો અભ્યાસ કરવા માટે થઈ શકે છે. ઇતિહાસ અને નામ 1964માં, એડમ એસ. જી. કર્ટિસે ઇન્ટરફરેન્સ રિફ્લેક્શન માઇક્રોસ્કોપી (આઈ. આર. એમ.) શબ્દની રચના કરી હતી, જેનો ઉપયોગ કોષ જીવવિજ્ઞાનના ક્ષેત્રમાં ગર્ભસ્થ ચિક હાર્ટ ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સનો અભ્યાસ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. તેમણે સંલગ્નતા સ્થળો અને ફાઇબ્રોબ્લાસ્ટ્સના અંતરને જોવા માટે આઈ. આર. એમ. નો ઉપયોગ કર્યો હતો, અને નોંધ્યું હતું કે કાચ સાથેનો સંપર્ક મોટે ભાગે કોષ પરિઘ અને સ્યુડોપોડિયા સુધી મર્યાદિત હતો. 1975માં, જોહાન સેબેસ્ટિયન પ્લોમે આઈ. આર. એમ. (પુસ્તકના પ્રકરણમાં પ્રકાશિત) માં સુધારો રજૂ કર્યો, જેને તેમણે રિફ્લેક્શન કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી (આર. સી. એમ.) નામ આપ્યું. ઓપ્ટિકલ સિસ્ટમમાં છૂટાછવાયા પ્રકાશને વધુ ઘટાડવા માટે કહેવાતા એન્ટી-ફ્લેક્સ ઉદ્દેશ્ય અને ક્રોસ પોલરાઇઝરનો ઉપયોગ કરવાનો સુધારો છે. આજે, આ યોજનાને મુખ્યત્વે રિફ્લેક્શન ઇન્ટરફરેન્સ કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી (આરઆઇસીએમ) તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, જેનું નામ બેરિટેર-હાન અને કોનરેડ બેક દ્વારા 1979માં રજૂ કરવામાં આવ્યું હતું. જો કે, IRM શબ્દ કેટલીકવાર RICM સુયોજનનું વર્ણન કરવા માટે હોય છે. આ તકનીકનું વર્ણન કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા નામોની વિવિધતાએ થોડી મૂંઝવણ પેદા કરી છે, અને 1985 ની શરૂઆતમાં વર્સ્યુરેન દ્વારા તેની ચર્ચા કરવામાં આવી હતી. બેરેઇટર-હેન અને કોનરેડ બેકએ આ તકનીકને ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી સાથે સહસંબંધિત કરી હતી, જે દર્શાવે છે કે વિવિધ સસ્તન કોષ રેખાઓ ચોક્કસ કેન્દ્રીય સંલગ્નતા સ્થળોમાં કાચના સબસ્ટ્રેટને વળગી રહે છે. સિદ્ધાંત જોડાયેલ કોષની છબી બનાવવા માટે, ચોક્કસ તરંગલંબાઇનો પ્રકાશ ધ્રુવીકરણમાંથી પસાર થાય છે. આ રેખીય ધ્રુવીકૃત પ્રકાશ ઉદ્દેશ્ય તરફ બીમ સ્પ્લિટર દ્વારા પ્રતિબિંબિત થાય છે, જે પ્રકાશને નમૂના પર કેન્દ્રિત કરે છે. કાચની સપાટી અમુક અંશે પ્રતિબિંબીત હોય છે અને ધ્રુવીકૃત પ્રકાશને પ્રતિબિંબિત કરશે. કાચ દ્વારા પ્રતિબિંબિત ન થતો પ્રકાશ કોષમાં પ્રવેશ કરશે અને કોષ પટલ દ્વારા પ્રતિબિંબિત થશે. ત્રણ પરિસ્થિતિઓ આવી શકે છે. પ્રથમ, જ્યારે પટલ કાચની નજીક હોય, ત્યારે કાચમાંથી પ્રતિબિંબિત પ્રકાશને તરંગલંબાઇના અડધા ભાગમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવે છે, જેથી પટલમાંથી પ્રતિબિંબિત પ્રકાશ કાચના તબક્કાઓમાંથી પ્રતિબિંબિત પ્રકાશની તુલનામાં ફેઝ શિફ્ટ ધરાવે છે અને તેથી એકબીજાને રદ કરે છે (દખલગીરી). આ દખલગીરી અંતિમ છબીમાં ઘેરા રંગના પિક્સેલમાં પરિણમે છે (આકૃતિમાં ડાબો કેસ). બીજું, જ્યારે પટલ કાચ સાથે જોડાયેલ ન હોય, ત્યારે પટલમાંથી પ્રતિબિંબ કાચના પ્રતિબિંબિત પ્રકાશની તુલનામાં નાના તબક્કાની પાળી ધરાવે છે, અને તેથી તેઓ એકબીજાને રદ કરશે નહીં, પરિણામે છબીમાં તેજસ્વી પિક્સેલ (આકૃતિમાં યોગ્ય કેસ). ત્રીજું, જ્યારે કોઈ નમૂનો ન હોય, ત્યારે કાચમાંથી માત્ર પ્રતિબિંબિત પ્રકાશ શોધાય છે અને અંતિમ છબીમાં તેજસ્વી પિક્સેલ્સ તરીકે દેખાશે. પ્રતિબિંબિત પ્રકાશ બીમ સ્પ્લિટર પર પાછો જશે અને બીજા ધ્રુવીકરણમાંથી પસાર થશે, જે અંતિમ ચિત્ર બનાવવા માટે ડિટેક્ટર (સામાન્ય રીતે સીસીડી કેમેરા) સુધી પહોંચતા પહેલા વેરવિખેર પ્રકાશને દૂર કરે છે. ધ્રુવીકરણ કરનારાઓ છૂટાછવાયા પ્રકાશને ઘટાડીને કાર્યક્ષમતામાં વધારો કરી શકે છે; જો કે સંવેદનશીલ ડિજિટલ કેમેરા સાથેના આધુનિક સેટઅપમાં, તેમની જરૂર નથી. સિદ્ધાંત પ્રતિબિંબ રીફ્રેક્શન ઇન્ડેક્સમાં ફેરફારને કારણે થાય છે, તેથી દરેક સીમા પર પ્રકાશનો એક ભાગ પ્રતિબિંબિત થશે. પ્રતિબિંબની માત્રા પ્રતિબિંબન ગુણાંક દ્વારા આપવામાં આવે છે, જે નીચેના નિયમ અનુસાર છેઃ પ્રતિબિંબન એ પ્રતિબિંબિત પ્રકાશની તીવ્રતા () અને આવનારી પ્રકાશની તીવ્રતા () નો ગુણોત્તર છેઃ કાચ (1.50-1.54, સૂચિ જુઓ), પાણી (1.31, સૂચિ જુઓ), કોષ પટલ (1.48) અને સાયટોસોલ (1.35) માટે લાક્ષણિક રીફ્રેક્ટિવ સૂચકાંકોનો ઉપયોગ કરીને, દરેક ઇન્ટરફેસ દ્વારા પ્રતિબિંબિત થતા પ્રકાશના અપૂર્ણાંકની ગણતરી કરી શકાય છે. જેમ જેમ રીફ્રેક્ટિવ સૂચકાંકો વચ્ચેનો તફાવત વધે છે તેમ તેમ પ્રતિબિંબની માત્રામાં વધારો થાય છે, પરિણામે કાચની સપાટી અને સંવર્ધન માધ્યમ (લગભગ પાણીની બરાબરઃ 1.31-1.33) વચ્ચેના આંતરપૃષ્ઠમાંથી મોટું પ્રતિબિંબ પડે છે. આનો અર્થ એ છે કે કોષ વિના છબી તેજસ્વી હશે, જ્યારે કોષ જોડાયેલ હોય, ત્યારે મધ્યમ અને પટલ વચ્ચેનો તફાવત મોટા પ્રતિબિંબનનું કારણ બને છે જે તબક્કામાં સહેજ બદલાઈ જાય છે, જેના કારણે કાચ દ્વારા પ્રતિબિંબિત પ્રકાશમાં દખલ થાય છે. કારણ કે મધ્યમ-પટલ ઇન્ટરફેસમાંથી પ્રતિબિંબિત પ્રકાશનું કંપનવિસ્તાર સ્કેટરિંગને કારણે ઘટે છે, જોડાયેલ વિસ્તાર ઘાટા દેખાશે પરંતુ સંપૂર્ણપણે કાળો નહીં. કારણ કે નમૂના પર કેન્દ્રિત પ્રકાશનો શંકુ ઘટના પ્રકાશના વિવિધ ખૂણાઓને જન્મ આપે છે, ત્યાં હસ્તક્ષેપ પેટર્નની વ્યાપક શ્રેણી છે. જ્યારે પેટર્ન 1 કરતા ઓછી તરંગલંબાઇ (શૂન્ય-ક્રમની ફ્રિન્જ) દ્વારા અલગ પડે છે, ત્યારે પેટર્ન ભેગા થાય છે, પરિણામે તીવ્રતામાં વધારો થાય છે. આ 1 કરતા વધારે આંકડાકીય છિદ્રવાળા ઉદ્દેશ્યનો ઉપયોગ કરીને મેળવી શકાય છે. જરૂરિયાતો આઈ. આર. એમ. નો ઉપયોગ કરીને કોષોની છબી બનાવવા માટે, માઇક્રોસ્કોપને ઓછામાં ઓછા નીચેના તત્વોની જરૂર પડે છેઃ 1) પ્રકાશ સ્રોત, જેમ કે હેલોજન લેમ્પ, 2) ઓપ્ટિકલ ફિલ્ટર (જે તરંગલંબાઇની નાની શ્રેણીને પાર કરે છે), અને 3) બીમ સ્પ્લિટર (જે 50 ટકા પ્રતિબિંબિત કરે છે અને પસંદ કરેલી તરંગલંબાઇના 50 ટકા પ્રસારિત કરે છે). પ્રકાશ સ્રોતે ઉચ્ચ તીવ્રતાના પ્રકાશનું ઉત્પાદન કરવાની જરૂર છે, કારણ કે બીમ સ્પ્લિટર અને નમૂના દ્વારા જ ઘણો પ્રકાશ ખોવાઈ જશે. વિવિધ તરંગલંબાઇ વિવિધ આઈ. આર. એમ. છબીઓમાં પરિણમે છે; બેરેઇટર-હાન અને તેમના સાથીઓએ દર્શાવ્યું હતું કે તેમના પી. ટી. કે. 2 કોષો માટે, 546 એન. એમ. ની તરંગલંબાઇ ધરાવતો પ્રકાશ 436 એન. એમ. ની તરંગલંબાઇ ધરાવતા વાદળી પ્રકાશ કરતાં વધુ સારી વિપરીતતામાં પરિણમે છે. આઈ. આર. એમ. ના મૂળભૂત સિદ્ધાંતમાં ઘણા સુધારા કરવામાં આવ્યા છે, જેમાંથી મોટાભાગના છબી રચનાની કાર્યક્ષમતા અને ઉપજમાં વધારો કરે છે. બીમ સ્પ્લિટર અને નમૂના વચ્ચે પોલરાઇઝર્સ અને ક્વાર્ટર વેવ પ્લેટ મૂકીને, રેખીય ધ્રુવીકૃત પ્રકાશને ગોળાકાર ધ્રુવીકૃત પ્રકાશમાં રૂપાંતરિત કરી શકાય છે અને પછી તેને રેખીય ધ્રુવીકૃત પ્રકાશમાં રૂપાંતરિત કરી શકાય છે, જે સિસ્ટમની કાર્યક્ષમતામાં વધારો કરે છે. ગોળાકાર ધ્રુવીકરણ લેખ આ પ્રક્રિયાની વિગતવાર ચર્ચા કરે છે. વધુમાં, બીજા પોલરાઇઝરનો સમાવેશ કરીને, જે પ્રથમ પોલરાઇઝરની સરખામણીમાં 90° ફેરવાય છે, છૂટાછવાયા પ્રકાશને ડિટેક્ટર સુધી પહોંચતા અટકાવી શકાય છે, જેનાથી સિગ્નલ અને ઘોંઘાટનો ગુણોત્તર વધે છે (વર્સ્યુરેનની આકૃતિ 2 જુઓ). જૈવિક ઉપયોગો જૈવિક નમૂનાઓનો અભ્યાસ કરવા માટે IRM નો ઉપયોગ કરવાની ઘણી રીતો છે. કોષ સંલગ્નતા અને કોષ સ્થળાંતર પર કેન્દ્રિત તકનીકના ઉપયોગોના પ્રારંભિક ઉદાહરણો. વેસિકલ ફ્યુઝન તાજેતરમાં, આ તકનીકનો ઉપયોગ ક્રોમાફિન કોષોમાં એક્સોસાયટોસિસનો અભ્યાસ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો છે. જ્યારે ડી. આઈ. સી. નો ઉપયોગ કરીને છબી બનાવવામાં આવે છે, ત્યારે ક્રોમાફિન કોષો નાના પ્રોટ્રુઝન સાથે ગોળાકાર કોષો તરીકે દેખાય છે. જ્યારે એક જ કોષને આઈ. આર. એમ. નો ઉપયોગ કરીને ચિત્રિત કરવામાં આવે છે, ત્યારે કાચ પરના કોષના પદચિહ્નને સ્પષ્ટ રીતે નાના પ્રોટ્રુઝન સાથે શ્યામ વિસ્તાર તરીકે જોઈ શકાય છે. જ્યારે ફોલ્લાઓ પટલ સાથે ભળી જાય છે, ત્યારે તેઓ શ્યામ પદચિહ્ન (જમણી પેનલમાં ટોચની કોષમાં તેજસ્વી ફોલ્લીઓ) ની અંદર નાના પ્રકાશ વર્તુળો તરીકે દેખાય છે. આઈ. આર. એમ. નો ઉપયોગ કરીને ક્રોમાફિન કોષોમાં વેસિકલ ફ્યુઝનનું ઉદાહરણ ફિલ્મ 1 માં દર્શાવવામાં આવ્યું છે. 60 એમ. એમ. પોટેશિયમ સાથે ઉત્તેજના પર, ગાઢ કોર ગ્રાન્યુલ્સના એક્સોસાયટોસિસના પરિણામે ક્રોમાફિન કોષના શ્યામ પદચિહ્નની અંદર બહુવિધ તેજસ્વી ફોલ્લીઓ દેખાવા લાગે છે. કારણ કે આઈ. આર. એમ. ને ફ્લોરોસન્ટ લેબલની જરૂર નથી, તેને અન્ય ઇમેજિંગ તકનીકો સાથે જોડી શકાય છે, જેમ કે એપિફ્લોરેસેન્સ અને ટી. આઈ. આર. એફ. માઇક્રોસ્કોપી સાથે પ્રોટીન ડાયનેમિક્સનો અભ્યાસ કરવા માટે વેસિકલ એક્સોસાયટોસિસ અને એન્ડોસાયટોસિસ સાથે. ફ્લોરોસન્ટ લેબલના અભાવનો બીજો ફાયદો ફોટોટોક્સિસિટીમાં ઘટાડો છે. સંદર્ભો વધુ વાંચન સોફ્ટ મેટર અને સેલ એડહેઝનમાં ક્વોન્ટિટેટિવ રિફ્લેક્શન ઇન્ટરફરેન્સ કોન્ટ્રાસ્ટ માઇક્રોસ્કોપી (આર. આઈ. સી. એમ.), લોરેન્ટ લિમોઝિન અને ખેયા સેનગુપ્તા, કેમફિઝચેમ 2009,10,2752-2768. બાહ્ય કડીઓ આઈઆરએમ પર આલ્બર્ટ આઈન્સ્ટાઈન કોલેજ ઓફ મેડિસિન નિકોન માઇક્રોસ્કોપીયુ ઓપ્ટિકલ માઇક્રોસ્કોપી તકનીકો પર રિફ્લેક્ટેડ કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપી વિડિયો ક્લિપ્સ ધરાવતા લેખો