Polony sequencing
પોલોની સિક્વન્સિંગ એ એક સસ્તી પરંતુ અત્યંત સચોટ મલ્ટિપ્લેક્સ સિક્વન્સિંગ તકનીક છે જેનો ઉપયોગ લાખો સ્થિર ડીએનએ સિક્વન્સને સમાંતર રીતે "વાંચવા" માટે થઈ શકે છે. આ તકનીક સૌપ્રથમ હાર્વર્ડ મેડિકલ સ્કૂલ ખાતે ડૉ. જ્યોર્જ ચર્ચના જૂથ દ્વારા વિકસાવવામાં આવી હતી. અન્ય સિક્વન્સિંગ તકનીકોથી વિપરીત, પોલોની સિક્વન્સિંગ ટેકનોલોજી મુક્તપણે ડાઉનલોડ કરી શકાય તેવું, ઓપન સોર્સ સોફ્ટવેર અને પ્રોટોકોલ સાથેનું એક ખુલ્લું મંચ છે. ઉપરાંત, આ તકનીકના હાર્ડવેરને સામાન્ય રીતે ઉપલબ્ધ એપિફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપી અને કમ્પ્યુટર-નિયંત્રિત ફ્લોસેલ/ફ્લુઇડિક્સ સિસ્ટમ સાથે સરળતાથી સેટ કરી શકાય છે. પોલોની સિક્વન્સિંગ સામાન્ય રીતે જોડીદાર-અંત ટેગ લાઇબ્રેરી પર કરવામાં આવે છે જે ડીએનએ નમૂનાના દરેક પરમાણુની લંબાઈ 135 બી. પી. હોય છે, જેમાં બે 17-18 બી. પી. જોડીદાર જીનોમિક ટેગ અલગ પડે છે અને સામાન્ય સિક્વન્સ દ્વારા ફરતી હોય છે. આ તકનીકની વર્તમાન વાંચન લંબાઈ એમ્પ્લિકન દીઠ 26 બેઝ અને ટેગ દીઠ 13 બેઝ છે, જે દરેક ટેગમાં 4-5 બેઝનું અંતર છોડી દે છે. વર્કફ્લો પોલોની સિક્વન્સિંગના પ્રોટોકોલને ત્રણ મુખ્ય ભાગોમાં વિભાજિત કરી શકાય છે, જે જોડીદાર એન્ડ-ટેગ લાઇબ્રેરી કન્સ્ટ્રક્શન, ટેમ્પ્લેટ એમ્પ્લીફિકેશન અને ડીએનએ સિક્વન્સિંગ છે. જોડીદાર એન્ડ-ટેગ લાઇબ્રેરીનું નિર્માણ આ પ્રોટોકોલ ચકાસાયેલ જીનોમિક ડીએનએને ચુસ્ત કદના વિતરણમાં અવ્યવસ્થિત રીતે કાપવાથી શરૂ થાય છે. કાપેલા ડીએનએ અણુઓને પછી અંતિમ સમારકામ અને એ-પૂંછડી સારવાર માટે આધિન કરવામાં આવે છે. અંતિમ સમારકામની સારવાર ડીએનએના કોઈપણ ક્ષતિગ્રસ્ત અથવા અસંગત બહાર નીકળેલા છેડાઓને 5 '-ફોસ્ફોરિલેટેડ અને બ્લન્ટ-એન્ડેડ ડીએનએમાં રૂપાંતરિત કરે છે, જે તાત્કાલિક બ્લન્ટ-એન્ડ બંધનને સક્ષમ કરે છે, જ્યારે એ-ટેઇલિંગ સારવાર કાતરી ડીએનએના 3' છેડે એ ઉમેરે છે. 1 કે. બી. ની લંબાઈ ધરાવતા ડી. એન. એ. અણુઓને 6 ટકા ટી. બી. ઈ. પેજ જેલ પર ભરીને પસંદ કરવામાં આવે છે. આગળના પગલામાં, ડીએનએ પરમાણુઓને ટી-પૂંછડી 30 બી. પી. લાંબા કૃત્રિમ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (ટી30) સાથે ગોળાકાર કરવામાં આવે છે, જેમાં બે બાહ્ય-મુખવાળા એમ. એમ. ઈ. આઈ. ઓળખ સ્થળો હોય છે, અને પરિણામી ગોળાકાર ડીએનએ ગોળાકાર વર્તુળની પ્રતિકૃતિમાંથી પસાર થાય છે. વિસ્તૃત ગોળાકાર ડીએનએ પરમાણુઓ પછી MmeI (પ્રકાર IIs પ્રતિબંધ એન્ડોન્યુક્લીઝ) સાથે પચાવવામાં આવે છે જે તેની ઓળખ સ્થળથી અંતર કાપીને, 17-18 bp ટેગ (લંબાઈમાં ≈ 70 bp) દ્વારા ફરતી T30 ટુકડાને મુક્ત કરશે. જોડી-ટેગ પરમાણુઓને તેમના બંને છેડા પર ઇ. પી. સી. આર. (ઇમલ્શન પી. સી. આર.) પ્રાઇમર ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (એફ. ડી. વી. 2 અને આર. ડી. વી. 2) ના બંધન પહેલાં અંત-સમારકામ કરવાની જરૂર છે. પરિણામી 135 બી. પી. લાઈબ્રેરી પરમાણુઓ કદ-પસંદ કરેલા અને નિક અનુવાદિત છે. છેલ્લે, લાઈબ્રેરી સામગ્રીની માત્રા વધારવા અને એક જ પગલામાં બાહ્ય બંધન ઉત્પાદનોને દૂર કરવા માટે પી. સી. આર. સાથે 135 બી. પી. જોડીદાર એન્ડ-ટેગ લાઈબ્રેરી પરમાણુઓને વિસ્તૃત કરો. પરિણામી ડીએનએ નમૂનામાં 44 બી. પી. એફ. ડી. વી. ક્રમ, એક <આઇ. ડી. 1> બી. પી. પ્રોક્સિમલ ટેગ, ટી30 ક્રમ, એક <આઇ. ડી. 1> બી. પી. ડિસ્ટલ ટેગ અને 25 બી. પી. આર. ડી. વી. ક્રમ હોય છે. ટેમ્પલેટ એમ્પ્લીફિકેશન ઇમલ્શન પી. સી. આર. મોનો-કદના, પેરામેગ્નેટિક સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-કોટેડ મણકા ડ્યુઅલ બાયોટિન ફોરવર્ડ પ્રાઇમર સાથે પહેલાથી લોડ થયેલ છે. સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન બાયોટિન માટે ખૂબ જ મજબૂત આકર્ષણ ધરાવે છે, આમ આગળનું પ્રાઇમર મણકાની સપાટી પર નિશ્ચિતપણે બંધાઈ જશે. આગળ, પ્રી-લોડેડ મણકા, પી. સી. આર. મિશ્રણ, ફોરવર્ડ અને રિવર્સ પ્રાઈમર્સ અને પેઅર્ડ એન્ડ-ટેગ લાઇબ્રેરી સાથે જલીય તબક્કો તૈયાર કરવામાં આવે છે. આ મિશ્રણ કરવામાં આવે છે અને પ્રવાહી મિશ્રણ બનાવવા માટે તેલના તબક્કા સાથે વમળવામાં આવે છે. આદર્શ રીતે, તેલના પ્રવાહી મિશ્રણમાં પાણીના દરેક ટીપાંમાં એક મણકો અને નમૂના ડીએનએનો એક અણુ હોય છે, જે પી. સી. આર. કરીને મિલિલીટર-સ્કેલ વોલ્યુમની અંદર લાખો બિન-ક્રિયાપ્રતિક્રિયાશીલ વિસ્તરણને મંજૂરી આપે છે. ઇમલ્શન તોડવું એમ્પ્લીફિકેશન પછી, આઇસોપ્રોપેનોલ અને ડિટર્જન્ટ બફર (10 એમ. એમ. ટ્રીસ પી. એચ. 7.5,1 એમ. એમ. ઈડીટીએ પી. એચ. 8.0,100 એમ. એમ. એન. એ. સી. એલ., 1 ટકા (વી/વી) ટ્રાઇટન એક્સ-100,1 ટકા (ડબલ્યુ/વી) એસ. ડી. એસ.) નો ઉપયોગ કરીને અગાઉના તબક્કામાંથી ઇમલ્શનને તોડવામાં આવે છે, જે વમળ, સેન્ટ્રીફ્યુગિંગ અને ચુંબકીય વિભાજનની શ્રેણી સાથે અનુસરે છે. પરિણામી ઉકેલ એ ખાલી, ક્લોનલ અને બિન-ક્લોનલ મણકાનું સસ્પેન્શન છે, જે પ્રવાહી મિશ્રણના ટીપાંમાંથી ઉદ્ભવે છે જે શરૂઆતમાં અનુક્રમે શૂન્ય, એક અથવા બહુવિધ ડીએનએ નમૂના પરમાણુઓ ધરાવે છે. વિસ્તૃત મણકાને આગામી તબક્કામાં સમૃદ્ધ કરી શકાય છે. મણકાનું સંવર્ધન વિસ્તૃત મણકાનું સંવર્ધન મોટી, ઓછી ઘનતા, બિન-ચુંબકીય પોલિસ્ટરીન મણકામાં સંકરણ દ્વારા પ્રાપ્ત થાય છે જે બાયોટિનિલેટેડ કેપ્ચર ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ (ડીએનએ ક્રમ કે જે ઇ. પી. સી. આર. એમ્પ્લિકન ક્રમને પૂરક છે) સાથે પહેલાથી લોડ થાય છે. ત્યારબાદ મિશ્રણને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવે છે જેથી વિસ્તૃત મણકાના સંકુલને બિન-વિસ્તૃત મણકાથી અલગ કરી શકાય અને કેપ્ચર કરી શકાય. વિસ્તૃત, કેપ્ચર મણકાનું સંકુલ ઓછી ઘનતા ધરાવે છે અને આમ સુપરનેટન્ટમાં રહેશે જ્યારે બિન-વિસ્તૃત મણકા ગોળી બનાવે છે. સુપરનેટન્ટને પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં આવે છે અને NaOH સાથે સારવાર કરવામાં આવે છે જે સંકુલને તોડી નાખશે. પેરામેગ્નેટિક વિસ્તૃત મણકાને ચુંબકીય વિભાજન દ્વારા બિન-ચુંબકીય કેપ્ચર મણકાથી અલગ કરવામાં આવે છે. આ સંવર્ધન પ્રોટોકોલ વિસ્તૃત મણકાના પાંચ ગણા સમૃદ્ધ કરવામાં સક્ષમ છે. બીડ કેપિંગ બીડ કેપિંગનો હેતુ અનએક્સટેન્ડેડ ફોરવર્ડ ઇ. પી. સી. આર. પ્રાઈમર્સ અને ટેમ્પલેટ ડી. એન. એ. ના આર. ડી. વી. સેગમેન્ટ બંનેના 3 'છેડે "કેપિંગ" ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડને જોડવાનો છે. જે કેપનો ઉપયોગ કરવામાં આવી રહ્યો છે તે એક એમિનો જૂથ છે જે ફ્લોરોસન્ટ પ્રોબ્સને આ છેડા પર જોડાતા અટકાવે છે અને તે જ સમયે, ટેમ્પલેટ ડીએનએના અનુગામી જોડાણને એમિનોસિલેનેટેડ ફ્લો સેલ કવરસ્લિપમાં મદદ કરે છે. કવરસ્લિપ એરેઇંગ પ્રથમ, કવરસ્લિપ્સ ધોવાઇ જાય છે અને એમિનોસિલેન-સારવાર કરવામાં આવે છે, જે તેના પર નમૂના ડીએનએના અનુગામી સહસંયોજક જોડાણને સક્ષમ કરે છે અને કોઈપણ ફ્લોરોસન્ટ દૂષણને દૂર કરે છે. વિસ્તૃત, સમૃદ્ધ મણકાને એક્રિલામાઇડ સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવે છે અને ટેફ્લોન-માસ્ક માઇક્રોસ્કોપ સ્લાઇડ દ્વારા રચાયેલા છીછરા મોલ્ડમાં રેડવામાં આવે છે. તરત જ, એમિનોસિલેન-ટ્રીટેડ કવરસ્લિપને એક્રિલામાઇડ જેલની ટોચ પર મૂકો અને 45 મિનિટ માટે પોલિમરાઇઝ થવા દો. આગળ, સ્લાઇડ/કવરસ્લિપ સ્ટેકને ઊંધું કરો અને જેલમાંથી માઇક્રોસ્કોપ સ્લાઇડને દૂર કરો. સિલેન-ટ્રીટેડ કવરસ્લિપ્સ જેલ સાથે સહસંયોજક રીતે જોડાઈ જશે જ્યારે માઇક્રોસ્કોપ સ્લાઇડની સપાટી પરનું ટેફ્લોન એક્રિલામાઇડ જેલમાંથી સ્લાઇડને વધુ સારી રીતે દૂર કરવામાં સક્ષમ બનાવશે. કવરસ્લિપ્સ પછી ફ્લો સેલ બોડી સાથે બંધાયેલા હોય છે અને કોઈપણ જોડાયેલા મણકા દૂર કરવામાં આવશે. ડીએનએ સિક્વન્સિંગ પોલોની સિક્વન્સિંગનું બાયોકેમિસ્ટ્રી મુખ્યત્વે લિગેસ અને પોલિમરેઝની ભેદભાવપૂર્ણ ક્ષમતાઓ પર આધાર રાખે છે. પ્રથમ, એન્કર પ્રાઈમરની શ્રેણી કોષોમાંથી વહે છે અને 17-18 bp પ્રોક્સિમલ અથવા ડિસ્ટલ જીનોમિક DNA ટેગના તાત્કાલિક 3 'અથવા 5' છેડે કૃત્રિમ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ અનુક્રમમાં સંકરણ થાય છે. આગળ, ફ્લોરોસન્ટ ડાયઝ સાથે લેબલ થયેલ ડીજનરેટ નોનમર્સની વસ્તી માટે એન્કર પ્રાઇમરની એન્ઝાઇમેટિક બંધન પ્રતિક્રિયા કરવામાં આવે છે. વિભેદક રીતે લેબલ થયેલ નોન-એમેર્સઃ 5 'Cy5-NNNNNNT 5' Cy3-NNNNNNNA 5 'ટેક્સાસરેડ-NNNNNNC 5' 6FAM-NNNNNNG ફ્લોરોફોર-ટેગ કરેલ નોન-એમેર્સ ડીજનરેટ પ્રાઈમર્સ જેવી વ્યૂહરચના અનુસાર ટેગ સિક્વન્સમાં વિભેદક સફળતા સાથે એનેલ કરે છે, પરંતુ પોલિમરેઝને જમા કરવાને બદલે, નોન-એમેર્સને પસંદગીયુક્ત રીતે નજીકના ડીએનએ-એન્કર પ્રાઇમર પર જોડવામાં આવે છે. ફ્લોરોફોર અણુનું સ્થિરીકરણ એક ફ્લોરોસન્ટ સંકેત પ્રદાન કરે છે જે સૂચવે છે કે જીનોમિક ડીએનએ ટેગ પર ક્વેરી પોઝિશન પર એ, સી, જી અથવા ટી છે કે કેમ. ચાર રંગના ઇમેજિંગ પછી, એન્કર પ્રાઇમર/નોનમેર સંકુલને દૂર કરવામાં આવે છે અને એન્કર પ્રાઇમરને બદલીને એક નવું ચક્ર શરૂ કરવામાં આવે છે. ફ્લોરોસન્ટલી ટેગ કરેલા નોન-એમેર્સનું નવું મિશ્રણ રજૂ કરવામાં આવ્યું છે, જેના માટે ક્વેરી પોઝિશનને જીનોમિક ડીએનએ ટેગમાં એક બેઝ આગળ ખસેડવામાં આવે છે. 5 'Cy5-NNNNNTN 5' Cy3-NNNNNNN 5 'ટેક્સાસરેડ-NNNNNNCN 5' 6FAM-NNNNNNGN 5 'થી 3' દિશામાં સાત પાયા અને 3 'છેડેથી છ પાયા આ રીતે પૂછી શકાય છે. અંતિમ પરિણામ એ છે કે દરેક ટેગની મધ્યમાં 4-બેઝથી 5-બેઝ ગેપ સાથે રન દીઠ 26 બેઝ (દરેક જોડીવાળા ટેગમાંથી 13 બેઝ) ની રીડ લંબાઈ છે. વિશ્લેષણ અને સોફ્ટવેર પોલોની સિક્વન્સિંગ પ્રતિ રન લાખો 26 રીડ્સ પેદા કરે છે અને આ માહિતીને સામાન્ય બનાવવાની અને ક્રમમાં રૂપાંતરિત કરવાની જરૂર છે. ચર્ચ લેબ દ્વારા વિકસાવવામાં આવેલા સોફ્ટવેર દ્વારા આ કરી શકાય છે. તમામ સોફ્ટવેર મફત છે અને વેબસાઇટ પરથી ડાઉનલોડ કરી શકાય છે. સાધનો આ તકનીકમાં ઉપયોગમાં લેવાતા અનુક્રમણિકા સાધનને સામાન્ય રીતે ઉપલબ્ધ ફ્લોરોસન્સ માઇક્રોસ્કોપ અને કમ્પ્યુટર નિયંત્રિત ફ્લોસેલ દ્વારા સ્થાપિત કરી શકાય છે. 2005માં જરૂરી સાધનોની કિંમત આશરે યુ. એસ. $130,000 હતી. એક સમર્પિત પોલોની સિક્વન્સિંગ મશીન, પોલોનેટર, 2009માં વિકસાવવામાં આવ્યું હતું અને ડોવર દ્વારા US $170,000માં વેચવામાં આવ્યું હતું. તેમાં ઓપન સોર્સ સોફ્ટવેર, રીએજન્ટ્સ અને પ્રોટોકોલ દર્શાવવામાં આવ્યા હતા અને તેનો હેતુ પર્સનલ જીનોમ પ્રોજેક્ટમાં ઉપયોગ કરવાનો હતો. શક્તિ અને નબળાઈઓ પોલોની સિક્વન્સિંગ સામાન્ય રીતે ઉપલબ્ધ, સસ્તા સાધનના આધારે ડીએનએ સિક્વન્સિંગના ઉચ્ચ થ્રુપુટ અને ઉચ્ચ સર્વસંમતિની ચોકસાઈ માટે પરવાનગી આપે છે. ઉપરાંત, તે એક ખૂબ જ લવચીક તકનીક છે જે BAC (બેક્ટેરિયલ કૃત્રિમ રંગસૂત્ર) અને બેક્ટેરિયલ જીનોમ અનુક્રમણિકા, તેમજ SAGE (જનીન અભિવ્યક્તિનું ક્રમિક વિશ્લેષણ) ટેગ અને બારકોડ અનુક્રમણિકા સહિત ચલ ઉપયોગને સક્ષમ કરે છે. વધુમાં, પોલોની સિક્વન્સિંગ તકનીક પર એક ખુલ્લી પ્રણાલી તરીકે ભાર મૂકવામાં આવે છે જે વિકસાવવામાં આવેલા સોફ્ટવેર, પ્રોટોકોલ અને રીએજન્ટ્સ સહિત બધું વહેંચે છે. જો કે, કાચા ડેટા સંપાદન 786 ગીગાબાઇટ્સ જેટલું ઊંચું પ્રાપ્ત કરી શકાય છે પરંતુ એકત્રિત 10,000 બિટ્સમાંથી માત્ર 1 બીટ માહિતી ઉપયોગી છે. આ તકનીકનો બીજો પડકાર વ્યક્તિગત લક્ષ્યોના સંબંધિત વિસ્તરણની એકરૂપતા છે. બિન-સમાન એમ્પ્લીફિકેશન સિક્વન્સિંગની કાર્યક્ષમતાને ઘટાડી શકે છે અને આ તકનીકમાં સૌથી મોટા અવરોધ તરીકે પોસ્ટ કરી શકે છે. પોલોની સિક્વન્સિંગ એ 1990 અને 2000 ના દાયકાના અંતથી પોલોની તકનીકનો વિકાસ છે. 2003માં સિંગલ-બેઝ એક્સ્ટેંશનનો ઉપયોગ કરીને સિટુ પોલોનીમાં ક્રમબદ્ધ કરવા માટે પદ્ધતિઓ વિકસાવવામાં આવી હતી જે 5-6 બેઝ રીડ્સ પ્રાપ્ત કરી શકે છે. 2005 સુધીમાં, હાલની પોલોની સિક્વન્સિંગ ટેકનોલોજી વિકસાવવા માટે આ પ્રારંભિક પ્રયાસોમાં સુધારો કરવામાં આવ્યો હતો. પોલોની સિક્વન્સિંગની અત્યંત સમાંતર સિક્વન્સિંગ-બાય-લિગેશન વિભાવનાઓએ એબીઆઈ સોલિડ સિક્વન્સિંગ જેવી પછીની સિક્વન્સિંગ તકનીકો માટે આધાર આપ્યો છે. સંદર્ભો બાહ્ય કડીઓ ડીએનએ અનુક્રમણિકા પદ્ધતિઓ આનુવંશિક તકનીકો