Hot start PCR
હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. એ પરંપરાગત પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (પી. સી. આર.) નું સુધારેલું સ્વરૂપ છે જે ઓરડાના (અથવા ઠંડા) તાપમાને બિન-વિશિષ્ટ ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશનને કારણે અનિચ્છનીય ઉત્પાદનો અને પ્રાઇમર ડાયમરની હાજરીને ઘટાડે છે. વધુ ઉપજ હાંસલ કરવા માટે પી. સી. આર. પ્રક્રિયામાં ઘણી વિવિધતાઓ અને ફેરફારો વિકસાવવામાં આવ્યા છે; હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. તેમાંથી એક છે. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. પરંપરાગત પી. સી. આર. જેવા જ સિદ્ધાંતોને અનુસરે છે-જેમાં તે સિંગલ સ્ટ્રેન્ડેડ ટેમ્પલેટમાંથી ડી. એન. એ. નું સંશ્લેષણ કરવા માટે ડી. એન. એ. પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે. જો કે, તે વધારાની ગરમી અને અલગ કરવાની પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરે છે, જેમ કે ઉત્પાદનની ઉપજ વધારવા તેમજ ઉચ્ચ વિશિષ્ટતા અને સંવેદનશીલતા પ્રદાન કરવા માટે તાક પોલિમરેઝના બંધનને નિષ્ક્રિય અથવા અટકાવવું અને તાક પોલિમરેઝના મોડા ઉમેરા. બિન-વિશિષ્ટ બંધન અને પ્રાઇમિંગ અથવા પ્રાઇમર ડાયમરની રચના વિકૃતીકરણ પછી પ્રતિક્રિયા મિશ્રણને પૂર્ણ કરીને ઘટાડવામાં આવે છે. ઊંચા તાપમાને પ્રતિક્રિયા મિશ્રણને પૂર્ણ કરવાની કેટલીક રીતોમાં એવા ફેરફારોનો સમાવેશ થાય છે જે નીચા તાપમાને ડીએનએ પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિને અવરોધે છે, સંશોધિત ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ (ડીએનટીપી) નો ઉપયોગ અને વિકૃતીકરણ પછી આવશ્યક રીએજન્ટ્સમાંથી એકનો ભૌતિક ઉમેરો. આ વધારાની પદ્ધતિઓ દ્વારા, હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. બિન-વિશિષ્ટ વિસ્તરણની માત્રાને ઘટાડવામાં સક્ષમ છે જે કુદરતી રીતે નીચા તાપમાન દરમિયાન થાય છે-જે પરંપરાગત પી. સી. આર. માટે એક સમસ્યા છે. આ ફેરફારો એ સુનિશ્ચિત કરવા માટે એકંદરે કામ કરે છે કે દ્રાવણમાં ચોક્કસ ઉત્સેચકો નિષ્ક્રિય રહેશે અથવા શ્રેષ્ઠ એનિલિંગ તાપમાન સુધી પહોંચે ત્યાં સુધી અવરોધિત થાય છે. બિન-વિશિષ્ટ પી. સી. આર. ઉત્પાદનોની રચનાને અટકાવવી, ખાસ કરીને પ્રારંભિક ચક્રમાં, પી. સી. આર. દ્વારા વિસ્તરણની સંવેદનશીલતામાં નોંધપાત્ર વધારો થાય છે. પી. સી. આર. અથવા આર. ટી.-પી. સી. આર. ના નિદાનાત્મક ઉપયોગોમાં આ અત્યંત મહત્વનું છે. બેકગ્રાઉન્ડ પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન (પી. સી. આર.) એ મોલેક્યુલર બાયોલોજી તકનીક છે જેનો ઉપયોગ ચોક્કસ ડીએનએ સેગમેન્ટ્સને તીવ્રતાના વિવિધ ક્રમ દ્વારા વધારવા માટે થાય છે. ડીએનએના ચોક્કસ વિભાગોને ત્રણ પ્રક્રિયાઓ પર વિસ્તૃત કરવામાં આવે છે, ડીનેચ્યુરેશન, એનીલિંગ અને એક્સ્ટેંશન-જ્યાં ડીએનએ સ્ટ્રેન્ડ્સને ઓરડાના તાપમાનથી મહત્તમ તાપમાન સુધી વધારીને અલગ કરવામાં આવે છે તે પહેલાં પ્રાઈમર્સ બાંધે છે અને પોલિમરેઝ ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને ટેમ્પલેટ સ્ટ્રાન્ડ સાથે સંરેખિત કરે છે. તે ડીએનએ પોલિમરેઝનો ઉપયોગ કરે છે, જે નીચા તાપમાને સહેજ સક્રિય હોય છે. પરંપરાગત પી. સી. આર. માં, પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ ઓરડાના તાપમાને પૂર્ણ થાય છે, અને ડી. એન. એ. પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિને કારણે, પ્રાઈમર્સ પ્રાઇમર ડાયમર્સ અથવા એનિયલ ટુ ડી. એન. એ. બિન-વિશિષ્ટ રીતે બનાવી શકે છે. પી. સી. આર. પ્રક્રિયા દરમિયાન, ડીએનએ પોલિમરેઝ ડીએનએના કોઈપણ ટુકડાને બાઉન્ડ પ્રાઈમર્સ સાથે વિસ્તૃત કરશે, લક્ષ્ય ઉત્પાદનો પેદા કરશે પણ બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનો પણ પેદા કરશે જે ઉપજ ઘટાડે છે. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. માં, કેટલાક રીએજન્ટ્સને ત્યાં સુધી અલગ રાખવામાં આવે છે જ્યાં સુધી મિશ્રણને ચોક્કસ એનિલિંગ તાપમાન પર ગરમ કરવામાં ન આવે. આ એનીલિંગનો સમય ઘટાડે છે, જે બદલામાં બિન-વિશિષ્ટ ડીએનએ વિસ્તરણની સંભાવના અને વિકૃતિકરણ પહેલાં બિન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર બંધનનો પ્રભાવ ઘટાડે છે. પરંપરાગત પી. સી. આર. માં, ઓપ્ટિમલ એનિલિંગ તાપમાન (50-65 °C) થી નીચેનું નીચું તાપમાન બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશન જેવા લક્ષ્ય ફેરફારોમાં પરિણમે છે જ્યાં પ્રાઈમર્સ બિન-વિશિષ્ટ રીતે ન્યુક્લિક એસિડ સાથે જોડાય છે. આ બિન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમર સંકુલ, જે મિશ્રણમાં વધુ પ્રમાણમાં હોય છે, તે પ્રાઇમર ડાયમર અને મિસ-પ્રાઇમિંગ જેવા પેટા-ઉત્પાદનોના સંશ્લેષણ પાછળનું કારણ છે. મિસ-પ્રાઇમિંગ એમ્પ્લીફિકેશન માટે લક્ષ્ય સિક્વન્સ સાથે સક્રિય રીતે સ્પર્ધા કરીને પી. સી. આર. એમ્પ્લીફિકેશનની કાર્યક્ષમતાને મોટા પ્રમાણમાં અવરોધે છે અને ઘટાડે છે. તેવી જ રીતે, પ્રાઇમર ડાયમર્સ કોમ્પ્લેક્સ બનાવે છે જે મેળવેલા કોપી નંબર એમ્પ્લીફિકેશનની માત્રામાં ઘટાડો કરે છે. આને હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. નો અમલ કરીને નિયંત્રિત કરી શકાય છે જે શ્રેષ્ઠ તાપમાન ન મળે ત્યાં સુધી પ્રાઇમર એક્સ્ટેંશનને અવરોધિત કરવાની મંજૂરી આપે છે. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. માં, મહત્વપૂર્ણ રીએજન્ટ્સ (જેમ કે ડી. એન. એ. પોલિમરેઝ અને મેગ્નેશિયમ કોફેક્ટર્સ) ને પી. સી. આર. મિશ્રણમાં પ્રતિક્રિયા કરતા અટકાવવામાં આવે છે જ્યાં સુધી શ્રેષ્ઠ તાપમાન ભૌતિક વિભાજન અથવા રાસાયણિક ફેરફારો દ્વારા મળતું નથી. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. ત્યારે પણ થઈ શકે છે જ્યારે ટાક પોલિમરેઝને અવરોધિત/નિષ્ક્રિય કરવામાં આવે છે અથવા તેના ઉમેરાને શ્રેષ્ઠ એનિલિંગ તાપમાન સુધી વિલંબિત કરવામાં આવે છે, ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ ફેરફારો દ્વારા અથવા કેજિંગ અને ગૌણ માળખામાં હેરફેર દ્વારા પ્રાઇમરમાં ફેરફાર કરીને. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. એ ઘણીવાર એવા સંજોગોમાં પરંપરાગત પી. સી. આર. ના વિરોધમાં વધુ સારો અભિગમ છે જ્યાં પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં ડી. એન. એ. ની ઓછી સાંદ્રતા હોય, ડી. એન. એ. નમૂનો અત્યંત જટિલ હોય, અથવા જો પી. સી. આર. માં ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રાઇમરની ઘણી જોડી હોય. પદ્ધતિઓ હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. એ એક એવી પદ્ધતિ છે જે ઉપજના નુકસાનને ઘટાડવા માટે બિન-વિશિષ્ટ બંધનને રોકવા માટે નીચા તાપમાને ડી. એન. એ. પોલિમરેઝના વિસ્તરણને અટકાવે છે. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. પી. સી. આર. ના ગરમ કરવાના પગલાં સુધી મર્યાદિત રીએજન્ટ્સ દ્વારા બિન-વિશિષ્ટ બંધનની માત્રાને ઘટાડે છે-પ્રતિક્રિયામાં તાક ડીએનએ પોલિમરેઝને મર્યાદિત કરીને પ્રતિક્રિયાને વહેલી મર્યાદિત કરે છે. બિન-વિશિષ્ટ બંધન ઘણીવાર પ્રાઇમર ડાયમર્સ અને ખોટા-પ્રાથમિક/ખોટા પ્રાથમિક લક્ષ્યો તરફ દોરી જાય છે. આને સુધારેલી પદ્ધતિઓ દ્વારા સુધારી શકાય છે જેમ કેઃ ટીક ડીએનએ પોલિમરેઝ એન્ઝાઇમ સાથે જોડાયેલા એન્ટિબોડીઝ/ટીક ડીએનએ પોલિમરેઝ એન્ટિબોડીઝ સાથે સંકળાયેલ ટીક ડીએનએ પોલિમરેઝનું નિષ્ક્રિયકરણ/અવરોધઃ એન્ઝાઇમ સાથે જોડાયેલા એન્ટિબોડીઝ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝને નિષ્ક્રિય કરે છે. એન્ટિબોડીઝ પોલિમરેઝ સાથે જોડાય છે અને જોડાય છે, જે નીચા તાપમાને થઈ શકે તેવા પ્રારંભિક ડીએનએ એમ્પ્લીફિકેશનને અટકાવે છે. એકવાર શ્રેષ્ઠ એનિલિંગ તાપમાન પૂર્ણ થઈ જાય પછી, એન્ટિબોડીઝ અધોગતિ પામવાનું અને અલગ થવાનું શરૂ કરશે, પ્રતિક્રિયામાં ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝને મુક્ત કરશે અને એમ્પ્લીફિકેશન પ્રક્રિયા શરૂ કરવાની મંજૂરી આપશે. પ્લેટિનમ તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ અને એક્યુસ્ટાર્ટ તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ (બંને અનુક્રમે લાઇફ ટેક્નોલોજીસ અને ક્વાંટા બાયોસાયન્સિસ ખાતે અયુબ રાશ્ચિયન દ્વારા વિકસાવવામાં આવ્યા છે) વ્યાપારી રીતે ઉપલબ્ધ એન્ટિબોડી આધારિત હોટ સ્ટાર્ટ તાક ડીએનએ પોલિમરેઝના ઉદાહરણો છે. આ તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ માટે વિશિષ્ટ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝના મિશ્રણ સાથે પૂર્વ-જટિલ છે. મીણના મણકાઃ તાપમાન આધારિત મીણના મણકા દ્વારા તાક ડીએનએ પોલિમરેઝ અને બાકીના પી. સી. આર. ઘટકો વચ્ચે ભૌતિક અવરોધ બનાવવામાં આવે છે. એકવાર તાપમાન 70 ડિગ્રી સેલ્સિયસથી વધી જાય પછી, પ્રથમ ચક્રમાં વિકૃતીકરણના પગલા દરમિયાન, મીણનો મણકો પીગળી જાય છે, જેનાથી ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ અવરોધમાંથી છટકી જાય છે અને પ્રતિક્રિયામાં મુક્ત થાય છે-વિસ્તરણ પ્રક્રિયા શરૂ થાય છે. મીણનું સ્તર પછી પ્રવર્ધન તબક્કા દરમિયાન પ્રતિક્રિયા મિશ્રણની ટોચ પર જાય છે અને પછીથી વરાળ અવરોધ તરીકે કાર્ય કરે છે. અત્યંત ચોક્કસ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સઃ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ એ ન્યુક્લિક એસિડના ટૂંકા પોલિમર છે જે સરળતાથી જોડાય છે. અત્યંત ચોક્કસ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ, જેમ કે એપ્ટેમર્સ, નીચા તાપમાને ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ સાથે જોડાય છે, જે તેને મિશ્રણમાં નિષ્ક્રિય બનાવે છે. માત્ર ઊંચા તાપમાને જ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ તાકથી અલગ થશે જે તેને પ્રતિક્રિયા આપવા દેશે. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. માટે આ સૌથી અસરકારક પદ્ધતિઓ છે, એન્ઝાઇમ સાથે જોડાયેલા એન્ટિબોડીઝ અને ખાસ કરીને અત્યંત ચોક્કસ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ પદ્ધતિઓ પ્રક્રિયાઓ દરમિયાન સૌથી વધુ અનુકૂળ હોય છે જેને ટૂંકા નિષ્ક્રિયતા સમયની જરૂર હોય છે. જો કે, અન્ય પદ્ધતિઓ અમલમાં મૂકવા માટે જાણીતી છે જેમ કેઃ ટાક ડીએનએ પોલિમરેઝ પ્રીહિટિંગનો મોડો ઉમેરોઃ પી. સી. આર. મશીનને અગાઉથી ગરમ કરવામાં આવે છે જ્યારે ઘટકો બરફ પર મિશ્રિત થાય છે અને પછી એકવાર તે મહત્તમ તાપમાન સુધી પહોંચે તે પછી તરત જ પી. સી. આર. મશીનમાં મૂકવામાં આવે છે. આ જરૂરી વોર્મ-અપ પ્રક્રિયાને દૂર કરશે, પ્રાઇમરની બિન-વિશિષ્ટ એનિલિંગને ઘટાડશે અને ખાતરી કરશે કે મિશ્રણમાં કોઈપણ મિસ પેઅર્ડ પ્રાઇમર અલગ કરવામાં આવે છે. ફ્રીઝિંગઃ ફ્રીઝિંગ મીણના મણકાની જેમ ભૌતિક અલગતાના એક સ્વરૂપ તરીકે કામ કરે છે. પ્રાઈમર્સ, ટેમ્પલેટ સ્ટ્રાન્ડ, પાણી અને ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ (ડીએનટીપી) ધરાવતું પ્રતિક્રિયા મિશ્રણ ટાક પોલિમરેઝ પહેલાં સ્થિર થાય છે અને બાકીના પીસીઆર ઘટકો સ્થિર મિશ્રણની ટોચ પર ઉમેરવામાં આવે છે. આ બિન-વિશિષ્ટ બંધનને રોકવા માટે કાર્ય કરે છે. પછીથી તાક ઉમેરવુંઃ પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં પી. સી. આર. ના ઘટકો તાક ઉમેર્યા વિના તૈયાર અને ગરમ કરવામાં આવે છે. શ્રેષ્ઠ તાપમાન સુધી પહોંચ્યા પછી જ તાકને પછીથી મિશ્રણમાં દાખલ કરવામાં આવે છે. જો કે, આ પદ્ધતિ ઓછામાં ઓછી વિશ્વસનીય છે અને ઘટકોના દૂષણ તરફ દોરી શકે છે. બીજી પદ્ધતિ ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ મધ્યસ્થી હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. દ્વારા છે જે રક્ષણાત્મક જૂથ દ્વારા ન્યુક્લિયોટાઇડ પાયામાં ફેરફાર કરે છે. ડીઓક્સીરીબોન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ (ડી. એન. ટી. પી.) ફેરફારો હોટ સ્ટાર્ટ ડી. એન. ટી. પી. ને 3 પ્રાઇમ ટર્મિનસ પર ઉષ્મા સંવેદનશીલ રક્ષણ જૂથનો સમાવેશ કરવા માટે રાસાયણિક રીતે સુધારી શકાય છે. આ ફેરફાર ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને ઉત્તમ તાપમાન સુધી પહોંચ્યા પછી ટેમ્પ્લેટ સ્ટ્રાન્ડ સાથે જોડાવા માટે ટાક પોલિમરેઝ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા અટકાવશે, તેથી ગરમી સક્રિયકરણ પગલા દરમિયાન રક્ષણાત્મક જૂથને દૂર કરવામાં આવશે. હોટ સ્ટાર્ટ ડી. એન. ટી. પી., ડી. એ., ડી. ટી., ડી. સી. અને ડી. જી. કુદરતી ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને બદલે છે. તમામ ચાર સુધારેલા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરવામાં આવે છે, જો કે, અગાઉના સંશોધનો દર્શાવે છે કે એક અથવા બે કુદરતી ન્યુક્લિયોટાઇડ્સને સુધારેલા ડી. એન. ટી. પી. સાથે બદલીને બિન-વિશિષ્ટ વિસ્તરણ થતું નથી તેની ખાતરી કરવા માટે પૂરતું હશે. ન્યુક્લિક એસિડનો બીજો રાસાયણિક ફેરફાર હીટ-રિવર્સિબલ કોવેલન્ટ મોડિફિકેશન દ્વારા થાય છે, જે પ્રાઈમર્સના રસના નમૂનામાં સંકરણને અવરોધે છે. ગ્વાનોસિન એમિનો જૂથ ડી. જી. બનાવવા માટે ગ્લાયોક્સલ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે. સુધારેલ પ્રાથમિક માળખુંઃ અમુક ગૌણ માળખું પ્રાથમિક માળખાના કાર્યોમાં અવરોધ ઊભો કરી શકે છે. ઉદાહરણ તરીકે, હેરપિન માળખા સાથે ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ પ્રાઇમર તરીકે અસરકારક રીતે કાર્ય કરી શકતા નથી. જો કે, પ્રતિક્રિયાના મિશ્રણને એનીલિંગ તાપમાનમાં ગરમ કર્યા પછી પ્રાઇમર એક રચના પરિવર્તનમાંથી પસાર થશે જે પ્રાઇમરને તેના બદલે રેખીય માળખું રચવા દેશે, જે પ્રાઇમરને લક્ષ્ય વિભાગ સાથે જોડવા અને પી. સી. આર. શરૂ કરવા માટે સક્ષમ બનાવે છે. વાસ્તવમાં, 'ડબલ-બબલ' પ્રાઇમર તરીકે ઓળખાતા હેરપિન પ્રાઇમરમાં વધુ સ્થિર રૂપરેખાંકન છે, જે હેડ ટુ ટેલ હોમોડિમર રૂપરેખાંકન બનાવે છે જેનો ઉપયોગ રિવર્સ-ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને હોટ-સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. બંને માટે થઈ શકે છે. ફોટોકેમિકલી દૂર કરી શકાય તેવા પાંજરાઓઃ એક કેજિંગ જૂથ કે જે એક રક્ષણાત્મક જૂથ છે જે ફોટોકેમિકલી દૂર કરી શકાય તેવું છે, જેમ કે કેજ્ડ થાઇમિડીન ફોસ્ફોરામિડાઇટ્સ, ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ પ્રાઇમરમાં સામેલ કરવામાં આવે છે. આ યુવી ઇરેડિયેશન (365 એનએમ) ના ઉપયોગ દ્વારા પ્રાઇમરના કાર્યને સક્રિય અને નિષ્ક્રિય કરવાની મંજૂરી આપે છે. તેથી, એનીલિંગ તાપમાન સુધી પહોંચ્યા પછી પ્રાઈમર્સને સક્રિય કરી શકાય છે. પી. સી. આર. માં મેગ્નેશિયમ મેગ્નેશિયમનો નિયંત્રિત ઉમેરો જરૂરી છે અને તે સહ-પરિબળ તરીકે કામ કરે છે કારણ કે ટાક પોલિમરેઝ મેગ્નેશિયમ આધારિત છે. પ્રમાણભૂત બફર રીએજન્ટ્સમાં મેગ્નેશિયમ અને ફોસ્ફેટની સાંદ્રતામાં વધારો કરવાથી મેગ્નેશિયમ અવક્ષેપ પેદા થાય છે, જે પ્રતિક્રિયા માટે ગરમ શરૂઆત પૂરી પાડે છે કારણ કે થર્મલ સાઇકલિંગ તબક્કા દરમિયાન ડીએનએ પોલિમરેઝ માટે કોઈ મેગ્નેશિયમ નથી. થર્મલ સાઇકલિંગ દરમિયાન, મેગ્નેશિયમ ફરીથી દ્રાવણમાં ઓગળી જશે અને પોલિમરેઝ માટે તેને સામાન્ય રીતે કાર્ય કરવાની મંજૂરી આપવા માટે ઉપલબ્ધ થશે. ફાયદા હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. ફાયદાકારક છે કારણ કે તેને ઓછા સંચાલનની જરૂર પડે છે અને દૂષિત થવાનું જોખમ ઘટાડે છે. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. ક્યાં તો રાસાયણિક રીતે સંશોધિત અથવા એન્ટિબોડી આધારિત હોઈ શકે છે જે પ્રક્રિયાને વિવિધ લાભો પૂરા પાડે છે. રાસાયણિક રીતે સુધારેલ હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. માં, પ્રક્રિયા ઓરડાના તાપમાને લઈ શકાય છે અને પી. સી. આર. પ્રક્રિયા શરૂ થાય તે પહેલાં પ્રાઇમરને એકબીજા સાથે જોડાતા અટકાવીને તેમજ બિન-વિશિષ્ટ પ્રાઇમિંગને મર્યાદિત કરીને પ્રાઇમર-ડાયમરની રચનામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કરે છે. તેવી જ રીતે, હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. ટેમ્પ્લેટ સિક્વન્સમાં પ્રાઈમર્સના બંધનને અટકાવે છે જેમાં ઓછી સમરૂપતા હોય છે જે ખોટી પ્રાઇમિંગ તરફ દોરી જાય છે. તે કડક પરિસ્થિતિઓને કારણે વિશિષ્ટતા અને સંવેદનશીલતામાં પણ સુધારો કરી શકે છે, તેમજ લક્ષિત ટુકડાના ઉત્પાદનની ઉપજમાં વધારો કરી શકે છે. એન્ટિબોડી આધારિત હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. માં, સાયકલિંગ પ્રક્રિયા દરમિયાન પ્રારંભિક વિકૃતીકરણના પગલા પછી પોલિમરેઝ સક્રિય થાય છે, તેથી જરૂરી સમય ઘટે છે. આ પણ ઉચ્ચ વિશિષ્ટતા તરફ દોરી જાય છે. મર્યાદાઓ તેના ફાયદાઓની સાથે, હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. ની પણ મર્યાદાઓ હોય છે જેને પદ્ધતિનો અમલ કરતા પહેલા ધ્યાનમાં લેવી આવશ્યક છે. હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. ને પરંપરાગત પી. સી. આર. ના વિરોધમાં લાંબા સમય સુધી ગરમી ઉમેરવાની જરૂર પડે છે, તેથી, નમૂના ડીએનએને નુકસાન થવાની સંભાવના વધુ હોય છે. ગરમીના વધેલા સમયનો અર્થ એ પણ છે કે પ્રક્રિયા વન ટ્યુબ, સિંગલ બફર રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન-પીસીઆર પદ્ધતિ જેવી ચોક્કસ પ્રક્રિયાઓ માટે સુસંગત નથી, જેમાં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પગલામાંથી પસાર થવા માટે નીચા તાપમાનની જરૂર પડે છે. રાસાયણિક રીતે સંશોધિત હોટ સ્ટાર્ટ પી. સી. આર. માં, પોલિમરેઝને સક્રિય કરવા માટે જરૂરી પુનઃસક્રિયતા સમયમાં નોંધપાત્ર વધારાને કારણે અને બીજું જો લક્ષ્ય ડીએનએ નમૂનાની લંબાઈ ખૂબ લાંબી હોય તો ડીએનએની એમ્પ્લીફિકેશન પ્રક્રિયાને નકારાત્મક અસર થઈ શકે છે. એન્ટિબોડી આધારિત પ્રક્રિયાઓમાં, દરેક એન્ઝાઇમને અલગ એન્ટિબોડીની જરૂર પડે છે અને તેથી પ્રક્રિયા કરવા માટેનો ખર્ચ વધારે હોય છે. એવા પુરાવા પણ છે કે ઘણા વ્યાપારી હોટ સ્ટાર્ટ ઉત્સેચકો ખરેખર વિકૃતિકરણ પહેલાં અમુક સ્તરની પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે, અને થોડા સપ્લાયર્સ આ શેષ પ્રવૃત્તિ માટે પરીક્ષણ વિશે કોઈ માહિતી પ્રદાન કરે છે. આનો અર્થ એ છે કે હોટ સ્ટાર્ટ ઉત્સેચકોને આભારી ફાયદાઓ કદાચ સાકાર ન થઈ શકે, અથવા શ્રેષ્ઠ રીતે બેચ અથવા ઉત્પાદક વચ્ચે બદલાશે. સંદર્ભો પોલિમરેઝ સાંકળ પ્રતિક્રિયા