Combined bisulfite restriction analysis
কম্বাইন্ড বিসালফাইট রিস্ট্রিক্শন অ্যানালাইসিস (বা কোবরা) হল একটি আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল যা জিনোমিক ডি. এন. এ-র একটি ছোট নমুনায় একটি নির্দিষ্ট জিনোমিক লোকাসে ডি. এন. এ মিথাইলেশন স্তরের সংবেদনশীল পরিমাণ নির্ধারণের অনুমতি দেয়। কৌশলটি হল বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং-এর একটি বৈচিত্র্য, এবং বাইসালফাইট রূপান্তর ভিত্তিক পলিমারেজ চেইন বিক্রিয়াকে সীমাবদ্ধ পরিপাকের সাথে একত্রিত করে। মূলত মাইক্রোডিসেক্টেড প্যারাফিন-এমবেডেড টিস্যু নমুনা থেকে জিনোমিক ডিএনএর ক্ষুদ্র পরিমাণ নির্ভরযোগ্যভাবে পরিচালনা করার জন্য বিকশিত, এই কৌশলটি তখন থেকে ক্যান্সার গবেষণা এবং এপিজেনেটিক্স গবেষণায় ব্যাপক ব্যবহার দেখা গেছে। পদ্ধতি বিসালফাইট চিকিৎসা আগ্রহের জিনোমিক ডিএনএ সোডিয়াম বাইসালফাইট দিয়ে চিকিত্সা করা হয়, যা মিথাইলেশন-নির্ভর ক্রমের পার্থক্য প্রবর্তন করে। সোডিয়াম বাইসালফাইট চিকিত্সার সময়, আনমিথাইলেটেড সাইটোসিনের অবশিষ্টাংশ ইউরাসিলে রূপান্তরিত হয়, যখন মিথাইলেটেড সাইটোসিনের অবশিষ্টাংশগুলি প্রভাবিত হয় না। পিসিআর পরিবর্ধন বিসালফাইট চিকিত্সা করা ডিএনএ তখন পিসিআর পরিবর্ধিত হয়, যার ফলে মূলত মিথাইলেটেড অবস্থানে সাইটোসিনের অবশিষ্টাংশ এবং মূলত অপরিমিত অবস্থানে থাইমিন অবশিষ্টাংশ (যা ইউরাসিলে রূপান্তরিত হয়েছিল) হয়। এই পর্যায়ে ব্যবহৃত প্রাইমারগুলিতে সিপিজি সাইট (সাইটোসিন মিথাইলেশনের সাধারণ লক্ষ্য) থাকে না, তাই পরিবর্ধন প্রক্রিয়াটি মিথাইলেশন অবস্থার উপর ভিত্তি করে টেমপ্লেটগুলির মধ্যে বৈষম্য করে না। পরবর্তী ধাপে সম্পূর্ণ হজম নিশ্চিত করার জন্য পিসিআর পণ্যগুলি শুদ্ধ করা হয়। রেস্ট্রিকশন ডাইজেস্ট উপরের পদক্ষেপগুলি যথাক্রমে সাইটোসিনের অবশিষ্টাংশটি মূলত মিথাইলেটেড ছিল কি না তার উপর নির্ভর করে ট্যাকআই (টিসিজিএ) এবং বিএসটিইউআই (সিজিসিজি)-এর মতো সিপিজি-ধারণকারী রেস্ট্রিকশন এনজাইম সাইটগুলির মিথাইলেশন নির্ভর ধারণ বা ক্ষতির দিকে পরিচালিত করে। উপরের ধাপে মিথাইলেশন-স্বাধীন পরিবর্ধনের কারণে, ফলস্বরূপ পিসিআর পণ্যগুলি এমন টুকরোগুলির একটি মিশ্র জনসংখ্যা হবে যা সিপিজি-ধারণকারী সীমাবদ্ধতা এনজাইম সাইটগুলি হারিয়েছে বা ধরে রেখেছে, যার নিজ নিজ শতাংশ সরাসরি নমুনা ডিএনএতে ডিএনএ মিথাইলেশনের মূল স্তরের সাথে সম্পর্কযুক্ত হবে। পিসিআর পণ্যগুলি তখন একটি সীমাবদ্ধতা এনজাইম দিয়ে চিকিত্সা করা হয় (যেমন। বি. এস. টি. ইউ. আই), যা শুধুমাত্র সেই সাইটগুলিকে বিভক্ত করবে যা মূলত মিথাইলেটেড (সি. জি. সি. জি) ছিল, এবং সেই সাইটগুলিকে ছেড়ে দেবে যা মূলত আনমিথাইলেটেড (টি. জি. টি. জি) ছিল। সমস্ত সিপিজি সাইটগুলি মূলত মিথাইলেটেড হওয়ার কারণে ধরে রাখা হয় এবং অসম্পূর্ণ বাইসালফাইট রূপান্তরের অবশিষ্টাংশ নয় তা নিশ্চিত করার জন্য, এইচএসপি 92আইআই-এর মতো এনজাইমগুলির সাথে একটি নিয়ন্ত্রণ পরিপাক করা হয়, যা সিএটিজি ক্রমকে স্বীকৃতি দেয়, যার কোনওটিই বাইসালফাইট রূপান্তরের পরে অবশিষ্ট থাকা উচিত নয় (নন-সিপিজি মিথাইলেশন ব্যতীত বিরল ব্যতীত) এবং এইভাবে বাইসালফাইট রূপান্তর সম্পূর্ণ হলে কোনও বিভাজন হওয়া উচিত নয়। পরিমাপ তখন পচানো টুকরোগুলি পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা পৃথক করা হয় যার সাথে একটি একক বড় অপচয়ে যাওয়া টুকরোটির সাথে সম্পর্কিত ব্যান্ডগুলির প্রত্যাশিত উপস্থিতি এবং পচানো টুকরোগুলির সাথে সম্পর্কিত একাধিক ছোট ব্যান্ড থাকে। এই ব্যান্ডগুলিতে ডিএনএর পরিমাণগত পরিমাণ একটি ফসফোইমেজারের মতো যন্ত্রের মাধ্যমে নির্ধারণ করা যেতে পারে, যার পরে মূল নমুনার মিথাইলেশন শতাংশ গণনা করা যেতে পারেঃ ব্যবহার এবং প্রয়োগ কোবরা অনেক গবেষণা-ভিত্তিক প্রয়োগগুলিতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে যেমন ক্যান্সার গবেষণায় জিন প্রবর্তকদের ডিএনএ মিথাইলেশন পরিবর্তনের জন্য স্ক্রিনিং, মুদ্রিত জিনে পরিবর্তিত মিথাইলেশন নিদর্শন সনাক্ত করা এবং স্তন্যপায়ী প্রাণীদের বিকাশের সময় জিনোমে মিথাইলেশন নিদর্শনগুলি চিহ্নিত করা। চিকিৎসাবিজ্ঞানে, কোব্রা একটি সরঞ্জাম হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছে যা অস্বাভাবিক ডিএনএ মিথাইলেশন জড়িত মানব রোগ নির্ণয়ে সহায়তা করে। গবেষকরা রসেল-সিলভার সিনড্রোমের জেনেটিক ইমপ্রিন্টিং ডিসঅর্ডার নির্ণয়ে উচ্চ কার্যকারিতা তরল ক্রোমাটোগ্রাফির সাথে কোবরা ব্যবহার করেছিলেন যেখানে 50 শতাংশ পর্যন্ত রোগীর মধ্যে এই ব্যাধিটির জন্য ইম্প্রিন্টেড জিন এইচ 19-এর হাইপোমেথাইলেশন দায়ী। শক্তি সহজ, দ্রুত এবং সস্তাঃ কোব্রাতে, ডিএনএ মিথাইলেশন মাত্রা সহজে এবং দ্রুত পরিমাপ করা হয় শ্রমসাধ্য সাব-ক্লোনিং এবং সিকোয়েন্সিংয়ের প্রয়োজন ছাড়াই, যেমন বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিংয়ের ক্ষেত্রে। পরীক্ষাটি সহজবোধ্য এবং মানক সস্তা আণবিক জীববিজ্ঞান বিকারক দিয়ে করা যেতে পারে। উচ্চ সামঞ্জস্যঃ পিসিআর এবং পরিশোধন পদক্ষেপের কারণে, পদ্ধতিটি কেবল খুব কম পরিমাণে জিনোমিক ডিএনএ দিয়ে কাজ করে না, তবে প্যারাফিনের সাথে চিকিত্সা করা নমুনাগুলির সাথেও কাজ করে, যা উভয়ই অন্যান্য ডিএনএ মিথাইলেশন কোয়ান্টিফিকেশন প্রোটোকলের সমস্যা হতে পারে যেমন সাউদার্ন ব্লটিং এবং মিথাইলেশন-সংবেদনশীল সীমাবদ্ধতা এনজাইম পরিপাকের পরে পিসিআর। পরিমাণগতঃ এটি মিথাইলেশন-নির্দিষ্ট পিসিআর-এর বিপরীতে, যা গুণগত। সি. ও. বি. আর. এ-তে, ডি. এন. এ মিথাইলেশন মাত্রা সরাসরি একটি নির্দিষ্ট স্থানে পরিমাপ করা যেতে পারে, যা প্রতি পরীক্ষায় আরও তথ্য প্রদান করে। উচ্চ-থ্রুপুট নমুনা প্রক্রিয়াকরণের জন্য মাপযোগ্যতাঃ কোব্রার সাথে, আগ্রহের অনেক অঞ্চল একই সীমাবদ্ধতা এনজাইমের সাথে পচানো পৃথক নমুনায় সমান্তরালভাবে প্রক্রিয়া করা যেতে পারে। এটি বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং বিশ্লেষণের বিপরীতে, যেখানে প্রতিটি অঞ্চল প্রতি লোকাসে অনেকগুলি ক্লোন সিকোয়েন্স করে কঠোরভাবে পরীক্ষা করা প্রয়োজন, যার জন্য আরও বেশি সময় ব্যয় হয়। প্রতি সমীক্ষায় একাধিক প্রশ্ন-একটি একক পরিপাক সমীক্ষায় একাধিক সি. পি. জি-যুক্ত সীমাবদ্ধতা স্থানে মিথাইলেশন অবস্থা নিয়ে জিজ্ঞাসাবাদ করা যেতে পারে। দুর্বলতা মূল্যায়ন আগ্রহের অঞ্চলে বিদ্যমান সীমাবদ্ধতা সাইটগুলি ব্যবহারের মধ্যে সীমাবদ্ধ এবং কোনও নির্দিষ্ট সীমাবদ্ধতা সাইটের প্রসঙ্গে ঘটে না এমন মিথাইলেশন পরীক্ষা করা হবে না। পিসিআর-এর পরে সীমাবদ্ধ এনজাইম দ্বারা অসম্পূর্ণ পরিপাক বিশ্লেষণকে বিভ্রান্ত করতে পারেঃ অসম্পূর্ণ পরিপাক ডিএনএ মিথাইলেশনের অভাবের পরামর্শ দেয় (যদি এইচপিএআইআই-এর মতো মিথাইলেশন-সংবেদনশীল এনজাইম দিয়ে কাটা হয়)। এটিও জানা যায় যে বিএসটিইউআই অপরিবর্তিত স্থানগুলিতে কাটছাঁট করতে পারে, যার ফলে মিথাইলেশন স্তরের অতিরিক্ত মূল্যায়ন হয় এবং তাই প্রায়শই এইচপিএআইআই-এর ব্যবহার প্রয়োজন হয়। জটিল নমুনাগুলিতে, কোষ-ধরনের বৈচিত্র্য বিশ্লেষণকে বিভ্রান্ত করতে পারে কারণ ডি. এন. এ সিকোয়েন্স করা হচ্ছে না, নমুনার বিভিন্ন কোষ থেকে সিকোয়েন্সে বৈচিত্র্য (অর্থাৎ। একটি টিউমারের মধ্যে বিভিন্ন কোষের জনসংখ্যা) যা জিজ্ঞাসাবাদ করা অঞ্চলে মিউটেশন অর্জন করেছে, যেমন সিজি ডাইনিউক্লিওটাইডকে সিএ বা সিটিতে পরিবর্তন করার ফলে, পরিপাকের অভাবের কারণে আপাতদৃষ্টিতে মিথাইলেটেড অঞ্চলের জন্ম দেয়। এটি একটি প্রদত্ত নমুনায় ডিএনএ মিথাইলেশন স্তরের পরিমাণ নির্ধারণকে তির্যক করে তুলবে। বিকল্প সাধারণভাবে, কোব্রা প্রায়শই অন্যান্য ডিএনএ মিথাইলেশন বিশ্লেষণের সাথে মিলিত হয় এবং প্রায়শই আগ্রহের লোকির প্রাথমিক স্ক্রিনিংয়ে ব্যবহৃত হয়। যদি কোবরা পরিবর্তিত মিথাইলেশন প্যাটার্নের পরামর্শ দেয়, তবে আরও কঠোর, শ্রম-নিবিড় কৌশল প্রয়োগ করা যেতে পারে, যেমন বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং বা এমইডিআইপি। এছাড়াও ডিএনএ মিথাইলেশন সনাক্ত করতে প্যাকবিও সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করা যেতে পারে। তথ্যসূত্র আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল