Transmission electron microscopy DNA sequencing
ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং একটি একক-অণু সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি যা ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি কৌশল ব্যবহার করে। পদ্ধতিটি 1960 এবং 70-এর দশকে কল্পনা করা হয়েছিল এবং বিকশিত হয়েছিল, কিন্তু নমুনার ক্ষতির পরিমাণ সনাক্ত করা হলে এটি জনপ্রিয়তা হারায়। একটি ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপের অধীনে ডিএনএ স্পষ্টভাবে দৃশ্যমান হওয়ার জন্য, এটি ভারী পরমাণু দিয়ে লেবেল করা আবশ্যক। উপরন্তু, বিশেষায়িত ইমেজিং কৌশল এবং বিচ্যুতি সংশোধন অপটিক্স লেবেলযুক্ত ডিএনএ অণুর চিত্রের জন্য প্রয়োজনীয় রেজোলিউশন পাওয়ার জন্য উপকারী। তত্ত্বগতভাবে, ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং অত্যন্ত দীর্ঘ পঠন দৈর্ঘ্য সরবরাহ করতে পারে, তবে ইলেক্ট্রন বিমের ক্ষতির সমস্যা এখনও রয়ে যেতে পারে এবং প্রযুক্তিটি এখনও বাণিজ্যিকভাবে বিকশিত হয়নি। ইতিহাস জেমস ওয়াটসন এবং ফ্রান্সিস ক্রিক ডিএনএর কাঠামো অনুমান করার মাত্র কয়েক বছর পরে এবং ফ্রেডরিক স্যাঙ্গার দ্রুত ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য প্রথম পদ্ধতি প্রকাশ করার প্রায় দুই দশক আগে, মার্কিন পদার্থবিজ্ঞানী রিচার্ড ফাইনম্যান ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপকে এমন একটি সরঞ্জাম হিসাবে কল্পনা করেছিলেন যা একদিন জীববিজ্ঞানীদের "ডিএনএ শৃঙ্খলে ঘাঁটির ক্রম দেখতে" অনুমতি দেবে। ফাইনম্যান বিশ্বাস করতেন যে ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপকে যদি যথেষ্ট শক্তিশালী করা যায়, তবে ডিএনএ সহ যে কোনও এবং সমস্ত রাসায়নিক যৌগের পারমাণবিক কাঠামো কল্পনা করা সম্ভব হবে। 1970 সালে, অ্যালবার্ট ক্রিউ একটি স্ক্যানিং ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপে হাই-অ্যাঙ্গেল অ্যানুলার ডার্ক-ফিল্ড ইমেজিং (এইচ. এ. এ. ডি. এফ) ইমেজিং কৌশল তৈরি করেন। এই কৌশলটি ব্যবহার করে, তিনি পাতলা নিরাকার কার্বন ফিল্মের উপর পৃথক ভারী পরমাণু কল্পনা করেছিলেন। 2010 সালে ক্রিভানেক এবং সহকর্মীরা এইচ. এ. এ. ডি. এফ পদ্ধতিতে বেশ কয়েকটি প্রযুক্তিগত উন্নতির কথা জানিয়েছেন, যার মধ্যে রয়েছে বিচ্যুতি সংশোধন করা ইলেক্ট্রন অপটিক্স এবং কম ত্বরান্বিত ভোল্টেজের সংমিশ্রণ। পরেরটি জৈবিক বস্তুর ইমেজিংয়ের জন্য গুরুত্বপূর্ণ, কারণ এটি মরীচি দ্বারা ক্ষতি হ্রাস করতে এবং হালকা পরমাণুর জন্য চিত্রের বৈসাদৃশ্য বাড়ানোর অনুমতি দেয়। ফলস্বরূপ, একটি বোরন নাইট্রাইড মনোলেয়ারে একক পরমাণু প্রতিস্থাপনের চিত্র তোলা যেতে পারে। প্রচুর রাসায়নিক এবং ফ্লুরোসেন্ট সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি উদ্ভাবন করা সত্ত্বেও, একক-অণু ডিএনএ সিকোয়েন্সিং সম্পাদনের উপায় হিসাবে ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি এখনও অন্বেষণ করা হচ্ছে। উদাহরণস্বরূপ, 2012 সালে হার্ভার্ড বিশ্ববিদ্যালয়, নিউ হ্যাম্পশায়ার বিশ্ববিদ্যালয় এবং জেডএস জেনেটিক্সের বিজ্ঞানীদের মধ্যে একটি সহযোগিতা কৌশলটি ব্যবহার করে ডিএনএর দীর্ঘ ক্রম পড়ার ক্ষমতা প্রদর্শন করেছিল, তবে ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি এখনও বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ হওয়া থেকে অনেক দূরে। নীতি ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপের 100 পিএম পর্যন্ত রেজোলিউশন পাওয়ার ক্ষমতা রয়েছে, যার মাধ্যমে মাইক্রোস্কোপিক জৈব অণু এবং কাঠামো যেমন ভাইরাস, রাইবোজোম, প্রোটিন, লিপিড, ছোট অণু এবং এমনকি একক পরমাণু পর্যবেক্ষণ করা যেতে পারে। যদিও ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপ দিয়ে পর্যবেক্ষণ করা হলে ডিএনএ দৃশ্যমান হয়, তবে প্রাপ্ত চিত্রের রেজোলিউশন পৃথক ঘাঁটির ক্রম, অর্থাৎ ডিএনএ সিকোয়েন্সিং বোঝার জন্য যথেষ্ট নয়। যাইহোক, ভারী পরমাণু বা ধাতু দিয়ে ডিএনএ ঘাঁটির ডিফারেনশিয়াল লেবেলিংয়ের উপর, পৃথক ঘাঁটির মধ্যে কল্পনা এবং পার্থক্য করা উভয়ই সম্ভব। অতএব, ডি. এন. এ-র ক্রম নির্ধারণের জন্য ডিফারেনশিয়াল ভারী পরমাণু ডি. এন. এ লেবেলিংয়ের সাথে ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করা যেতে পারে। কর্মপ্রবাহ ধাপ 1-ডি. এন. এ বিকৃতি একটি স্ট্যান্ডার্ড পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (পি. সি. আর) হিসাবে, দ্বিতীয় স্ট্র্যান্ডটি লেবেলযুক্ত নিউক্লিওটাইডগুলির সাথে সংশ্লেষিত হওয়ার আগে ডাবল স্ট্র্যান্ডেড ডি. এন. এ অণুগুলিকে ক্রমবদ্ধ করতে হবে। ধাপ 2-ভারী পরমাণু লেবেলিং জৈবিক অণু (সি, এইচ, এন, ও, পি, এস) তৈরি করে এমন উপাদানগুলি খুব হালকা (কম পারমাণবিক সংখ্যা, জেড) যা ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পৃথক পরমাণু হিসাবে স্পষ্টভাবে দৃশ্যমান করা যায় না। এই সমস্যাটি এড়াতে, ডিএনএ ঘাঁটিগুলিকে ভারী পরমাণু (উচ্চতর জেড) দিয়ে চিহ্নিত করা যেতে পারে। প্রতিটি নিউক্লিওটাইডকে একটি চরিত্রগত ভারী লেবেল দিয়ে চিহ্নিত করা হয়, যাতে সেগুলিকে ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোগ্রাফে আলাদা করা যায়। জেডএস জেনেটিক্স তিনটি ভারী লেবেল ব্যবহার করার প্রস্তাব দেয়ঃ ব্রোমিন (জেড = 35), আয়োডিন (জেড = 53), এবং ট্রাইক্লোরোমিথেন (মোট জেড = 63)। এগুলি মাইক্রোগ্রাফে ডিফারেনশিয়াল অন্ধকার এবং হালকা দাগ হিসাবে প্রদর্শিত হবে এবং চতুর্থ ডিএনএ বেসটি লেবেলবিহীন থাকবে। টস্ট গ্রুপের সহযোগিতায় হ্যালসিয়ন মলিকিউলার প্রস্তাব করে যে পিউরিন এবং পাইরিমিডিন ক্ষারগুলি যথাক্রমে প্ল্যাটিনাম ডায়ামিন বা ওসিয়াম টেট্রাঅক্সাইড বাইপাইরিডিনের সাথে কার্যকরী করা যেতে পারে। ভারী ধাতব পরমাণু যেমন ওসিয়াম (জেড = 76), ইরিডিয়াম (জেড = 77), সোনা (জেড = 79), বা ইউরেনিয়াম (জেড = 92) তারপর পৃথক ঘাঁটি লেবেল করার জন্য এই কার্যকরী গোষ্ঠীর সাথে ধাতু-ধাতব বন্ধন তৈরি করতে পারে। ধাপ 3-সাবস্ট্রেটে ডি. এন. এ সারিবদ্ধকরণ ডি. এন. এ অণুগুলিকে অবশ্যই একটি পাতলা, কঠিন সাবস্ট্রেটে প্রসারিত করতে হবে যাতে লেবেলযুক্ত ঘাঁটির ক্রম ইলেক্ট্রন মাইক্রোগ্রাফে স্পষ্টভাবে দৃশ্যমান হয়। আণবিক কম্বিং এমন একটি কৌশল যা ডিএনএ অণু প্রসারিত করার জন্য একটি হ্রাসমান বায়ু-জলের ইন্টারফেসের শক্তি ব্যবহার করে, শুকিয়ে গেলে সেগুলিকে অপরিবর্তনীয়ভাবে একটি সাইলেন স্তরের সাথে আবদ্ধ করে রাখে। এটি এমন একটি উপায় যার মাধ্যমে একটি কঠিন স্তরের উপর ডি. এন. এ-র সারিবদ্ধকরণ অর্জন করা যেতে পারে। ধাপ 4-টিইএম ইমেজিং ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (টিইএম) খুব পাতলা নমুনার মধ্য দিয়ে ইলেকট্রনের একটি মরীচি পাস করে উচ্চ বিবর্ধন, উচ্চ রেজোলিউশনের চিত্র তৈরি করে। যেখানে পারমাণবিক রেজোলিউশন প্রচলিত টিইএম দিয়ে প্রদর্শিত হয়েছে, সেখানে স্থানিক রেজোলিউশনে আরও উন্নতির জন্য মাইক্রোস্কোপ লেন্সের গোলাকার এবং বর্ণগত বিচ্যুতি সংশোধন করা প্রয়োজন। এটি শুধুমাত্র স্ক্যানিং ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি-তে সম্ভব হয়েছে যেখানে ক্যাথোড রশ্মি নলের মতো সূক্ষ্মভাবে কেন্দ্রীভূত ইলেক্ট্রন রশ্মি দিয়ে বস্তুটিকে স্ক্যান করে চিত্রটি পাওয়া যায়। যাইহোক, রেজোলিউশনে অর্জিত উন্নতি অনেক বেশি মরীচি তীব্রতা, সহগামী নমুনা ক্ষতি এবং সম্পর্কিত ইমেজিং নিদর্শন দ্বারা অধ্যয়ন করা বস্তুর বিকিরণের সাথে একত্রিত হয়। নমুনায় ভারী বা হালকা পরমাণু রয়েছে কিনা তার উপর নির্ভর করে বিভিন্ন ইমেজিং কৌশল প্রয়োগ করা হয়ঃ অ্যানুলার ডার্ক-ফিল্ড ইমেজিং ইলেকট্রনগুলির বিচ্ছুরণ পরিমাপ করে যখন তারা ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি নমুনায় পরমাণুর নিউক্লিয়াসকে বিপথগামী করে। এটি ভারী পরমাণুযুক্ত নমুনার জন্য সবচেয়ে উপযুক্ত, কারণ এগুলি ইলেকট্রনের আরও বিচ্ছুরণ ঘটায়। বোরন, নাইট্রোজেন এবং কার্বনের মতো হালকা হিসাবে পরমাণুগুলিকে চিত্রিত করার জন্য কৌশলটি ব্যবহার করা হয়েছে; তবে, এই ধরনের হালকা পরমাণুর জন্য সংকেতটি খুব দুর্বল। যদি অ্যানুলার ডার্ক-ফিল্ড মাইক্রোস্কোপি ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য ব্যবহার করা হয়, তবে অবশ্যই ডিএনএ ঘাঁটিগুলিকে ভারী পরমাণু দিয়ে লেবেল করা প্রয়োজন হবে যাতে একটি শক্তিশালী সংকেত সনাক্ত করা যায়। অ্যানুলার ব্রাইট-ফিল্ড ইমেজিং নমুনার মাধ্যমে সরাসরি প্রেরিত ইলেকট্রনগুলি সনাক্ত করে এবং পারমাণবিক নিউক্লিয়াসের সাথে তাদের মিথস্ক্রিয়া দ্বারা উত্পাদিত তরঙ্গ হস্তক্ষেপ পরিমাপ করে। এই কৌশলটি অ্যানুলার ডার্ক-ফিল্ড ইমেজিং পদ্ধতির চেয়ে বেশি সংবেদনশীল হালকা পরমাণু সনাক্ত করতে পারে। প্রকৃতপক্ষে, স্ফটিকাকার কঠিন পদার্থে অক্সিজেন, নাইট্রোজেন, লিথিয়াম এবং হাইড্রোজেনকে অ্যানুলার ব্রাইট-ফিল্ড ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে চিত্রায়িত করা হয়েছে। সুতরাং, তাত্ত্বিকভাবে ডি. এন. এ শৃঙ্খলে পরমাণুর সরাসরি চিত্র পাওয়া সম্ভব; তবে, ডি. এন. এ-র কাঠামো স্ফটিকাকার কঠিন পদার্থের তুলনায় অনেক কম জ্যামিতিক, তাই পূর্বের লেবেল ছাড়া সরাসরি ইমেজিং অর্জনযোগ্য নাও হতে পারে। ধাপ 5-তথ্য বিশ্লেষণ ইলেক্ট্রন মাইক্রোগ্রাফের কালো এবং উজ্জ্বল দাগ, ভিন্নভাবে লেবেলযুক্ত ডিএনএ ঘাঁটির সাথে সম্পর্কিত, কম্পিউটার সফ্টওয়্যার দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়। অ্যাপ্লিকেশন ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং এখনও বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ নয়, তবে এই প্রযুক্তি একদিন যে দীর্ঘ পঠন দৈর্ঘ্য সরবরাহ করতে পারে তা এটিকে বিভিন্ন প্রসঙ্গে কার্যকর করে তুলবে। ডি নোভো জিনোম অ্যাসেম্বলি যখন কোনও জিনোমের সিকোয়েন্সিং করা হয়, তখন এটিকে এমন টুকরো টুকরো করতে হবে যা একক রিডে সিকোয়েন্স করার জন্য যথেষ্ট ছোট। এই রিডগুলি অবশ্যই রিডগুলির মধ্যে ওভারল্যাপ হওয়া অঞ্চলগুলিকে সারিবদ্ধ করে জিগস ধাঁধার মতো একত্রিত করতে হবে; এই প্রক্রিয়াটিকে ডি নোভো জিনোম সমাবেশ বলা হয়। একটি সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্ম যত দীর্ঘ দৈর্ঘ্য প্রদান করে, ওভারল্যাপিং অঞ্চলগুলি তত দীর্ঘ হয় এবং জিনোম একত্রিত করা তত সহজ হয়। গণনামূলক দৃষ্টিকোণ থেকে, মাইক্রোফ্লুইডিক স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং এখনও জিনোমগুলি সিকোয়েন্স এবং একত্রিত করার সবচেয়ে কার্যকর উপায় যার জন্য কোনও রেফারেন্স জিনোম সিকোয়েন্স বিদ্যমান নেই। তুলনামূলকভাবে দীর্ঘ পঠন দৈর্ঘ্য পৃথক সিকোয়েন্সিং রিডের মধ্যে যথেষ্ট ওভারল্যাপ প্রদান করে, যা সমাবেশে বৃহত্তর পরিসংখ্যানগত আত্মবিশ্বাসের অনুমতি দেয়। উপরন্তু, দীর্ঘ স্যাঙ্গার রিডগুলি পুনরাবৃত্তিমূলক ডিএনএ সিকোয়েন্সের বেশিরভাগ অঞ্চল প্রসারিত করতে সক্ষম যা অন্যথায় ভুল সারিবদ্ধকরণ ঘটিয়ে সিকোয়েন্স সমাবেশকে বিভ্রান্ত করে। যাইহোক, স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং দ্বারা ডি নোভো জিনোম সমাবেশ অত্যন্ত ব্যয়বহুল এবং সময়সাপেক্ষ। দ্বিতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তিগুলি, কম ব্যয়বহুল হলেও, সংক্ষিপ্ত পঠন দৈর্ঘ্যের কারণে সাধারণত ডি নোভো জিনোম সমাবেশের জন্য অনুপযুক্ত। সাধারণভাবে, ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং সহ তৃতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির লক্ষ্য হল কম সিকোয়েন্সিং খরচ বজায় রেখে পাঠের দৈর্ঘ্য উন্নত করা। এইভাবে, তৃতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির উন্নতির সাথে সাথে দ্রুত এবং সস্তা ডি নোভো জিনোম সমাবেশ বাস্তবে পরিণত হবে। সম্পূর্ণ হ্যাপ্লোটাইপ হ 'ল সংযুক্ত অ্যালিলগুলির একটি সিরিজ যা একক ক্রোমোসোমে একসাথে উত্তরাধিকারসূত্রে পাওয়া যায়। ডিএনএ সিকোয়েন্সিং একটি হ্যাপ্লোটাইপ গঠনকারী সমস্ত একক নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজম (এসএনপি)-এর জিনোটাইপে ব্যবহার করা যেতে পারে। যাইহোক, সংক্ষিপ্ত ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রায়শই পর্যায়ক্রমে পড়া যায় না; অর্থাৎ, হেটেরোজাইগাস রূপগুলি আত্মবিশ্বাসের সাথে সঠিক হ্যাপ্লোটাইপে বরাদ্দ করা যায় না। প্রকৃতপক্ষে, সংক্ষিপ্ত পঠিত ডিএনএ সিকোয়েন্সিং ডেটা সহ হ্যাপ্লোটাইপিংয়ের জন্য এসএনপিগুলি সঠিকভাবে সনাক্ত করার জন্য খুব উচ্চ কভারেজ (প্রতিটি ডিএনএ বেসের গড়> 50x কভারেজ) প্রয়োজন, পাশাপাশি পিতামাতার কাছ থেকে অতিরিক্ত সিকোয়েন্স ডেটা যাতে মেন্ডেলিয়ান সংক্রমণ হ্যাপ্লোটাইপগুলি অনুমান করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং সহ দীর্ঘ রিড তৈরি করে এমন সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তিগুলি একক রিডে পুরো হ্যাপ্লোব্লকগুলি ক্যাপচার করতে পারে। অর্থাৎ, হ্যাপ্লোটাইপগুলি একাধিক রিডের মধ্যে বিভক্ত হয় না এবং জিনগতভাবে সংযুক্ত অ্যালিলগুলি সিকোয়েন্সিং ডেটাতে একসাথে থাকে। অতএব, লং রিডস হ্যাপ্লোটাইপিংকে সহজ এবং আরও নির্ভুল করে তোলে, যা পপুলেশন জেনেটিক্সের ক্ষেত্রে উপকারী। অনুলিপি সংখ্যার বৈকল্পিক জিনগুলি সাধারণত ডিপ্লয়েড মানব জিনোমে দুটি অনুলিপিতে উপস্থিত থাকে; যে জিনগুলি এই মানক অনুলিপি সংখ্যা থেকে বিচ্যুত হয় সেগুলিকে অনুলিপি সংখ্যার বৈকল্পিক (সিএনভি) হিসাবে উল্লেখ করা হয়। অনুলিপি সংখ্যার তারতম্য সৌম্য হতে পারে (এগুলি সাধারণত সাধারণ রূপ, যাকে অনুলিপি সংখ্যা পলিমরফিজম বলা হয়) বা প্যাথোজেনিক হতে পারে। সিএনভিগুলি ফ্লুরোসেন্স ইন সিটু হাইব্রিডাইজেশন (এফআইএসএইচ) বা তুলনামূলক জিনোমিক হাইব্রিডাইজেশন (সিজিএইচ) দ্বারা সনাক্ত করা হয়। যে নির্দিষ্ট ব্রেকপয়েন্টে একটি মুছে ফেলা হয় তা সনাক্ত করতে, বা একটি অনুলিপি বা পরিবর্ধন ইভেন্ট দ্বারা প্রবর্তিত জিনোমিক ক্ষত সনাক্ত করতে, সিজিএইচ একটি টাইলিং অ্যারে (অ্যারে সিজিএইচ) ব্যবহার করে সঞ্চালিত করা যেতে পারে, অথবা বৈকল্পিক অঞ্চলটি ক্রমবদ্ধ করা যেতে পারে। লং সিকোয়েন্সিং রিডগুলি ডুপ্লিকেশন বা পরিবর্ধন বিশ্লেষণের জন্য বিশেষভাবে কার্যকর, কারণ পরিবর্ধিত অংশগুলির অভিযোজন বিশ্লেষণ করা সম্ভব যদি সেগুলি একক সিকোয়েন্সিং রিডে ধরা পড়ে। ক্যান্সার জিনোমিক্স বা অনকোজেনোমিক্স একটি উদীয়মান ক্ষেত্র যেখানে উচ্চ-থ্রুপুট, দ্বিতীয় প্রজন্মের ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি সম্পূর্ণ ক্যান্সার জিনোম সিকোয়েন্স করার জন্য প্রয়োগ করা হচ্ছে। এই সংক্ষিপ্ত রিড সিকোয়েন্সিং ডেটা বিশ্লেষণ করা সংক্ষিপ্ত রিড ডেটা ব্যবহার করে ডি নোভো জিনোম সমাবেশের সাথে সম্পর্কিত সমস্ত সমস্যাকে অন্তর্ভুক্ত করে। উপরন্তু, ক্যান্সারের জিনোমগুলি প্রায়শই অ্যানিপ্লয়েড হয়। এই বিচ্যুতিগুলি, যা মূলত বড় আকারের অনুলিপি সংখ্যার রূপ, অনুলিপি সংখ্যা অনুমান করার জন্য পঠন ফ্রিকোয়েন্সি ব্যবহার করে দ্বিতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি দ্বারা বিশ্লেষণ করা যেতে পারে। তবে, দীর্ঘ রিডগুলি অনুলিপি সংখ্যা, পরিবর্ধিত অঞ্চলের অভিযোজন এবং ক্যান্সার জিনোমে উপস্থিত এসএনপিগুলির আরও সঠিক চিত্র সরবরাহ করবে। মাইক্রোবায়োম সিকোয়েন্সিং মাইক্রোবায়োম একটি মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট এবং তাদের নিজ নিজ জিনোমে উপস্থিত জীবাণুগুলির মোট সংগ্রহকে বোঝায়। উদাহরণস্বরূপ, আনুমানিক 100 ট্রিলিয়ন মাইক্রোবিয়াল কোষ যে কোনও সময়ে মানবদেহে উপনিবেশ স্থাপন করে। মানুষের মাইক্রোবায়োম বিশেষ আগ্রহের বিষয়, কারণ এই সাধারণ ব্যাকটেরিয়া মানুষের স্বাস্থ্য এবং অনাক্রম্যতার জন্য গুরুত্বপূর্ণ। পৃথিবীর বেশিরভাগ ব্যাকটেরিয়াল জিনোম এখনও সিকোয়েন্স করা হয়নি; একটি মাইক্রোবায়োম সিকোয়েন্সিং প্রকল্প গ্রহণের জন্য বিস্তৃত ডি নোভো জিনোম সমাবেশের প্রয়োজন হবে, একটি সম্ভাবনা যা শর্ট রিড ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির সাথে ভয়ঙ্কর। দীর্ঘ রিডগুলি নতুন মাইক্রোবিয়াল জিনোমের সমাবেশকে ব্যাপকভাবে সহজতর করবে। অন্যান্য দ্বিতীয় এবং তৃতীয় প্রজন্মের ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির তুলনায়, ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের বেশ কয়েকটি সম্ভাব্য মূল শক্তি এবং দুর্বলতা রয়েছে, যা শেষ পর্যন্ত ভবিষ্যতের ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি হিসাবে এর উপযোগিতা এবং বিশিষ্টতা নির্ধারণ করবে। শক্তি দীর্ঘতর পঠন দৈর্ঘ্যঃ জেডএস জেনেটিক্স অনুমান করেছে যে সংক্রমণ ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের সম্ভাব্য পঠন দৈর্ঘ্য 10,000 থেকে 20,000 বেস জোড়া হবে যার হার প্রতিদিন 1.7 বিলিয়ন বেস জোড়া। এই ধরনের দীর্ঘ পঠন দৈর্ঘ্য অন্যান্য প্রয়োগের মধ্যে সহজ ডি নোভো জিনোম সমাবেশ এবং হ্যাপ্লোটাইপগুলির সরাসরি সনাক্তকরণের অনুমতি দেবে। কম খরচঃ ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং-এর জন্য দ্বিতীয় প্রজন্মের ডিএনএ সিকোয়েন্সিং বিকল্পগুলির তুলনায় মানব জিনোম প্রতি মাত্র 5,000-10,000 মার্কিন ডলার খরচ হবে বলে অনুমান করা হয়। কোনও ডিফাসিং নেইঃ সংশ্লেষণের সময় সিনক্রোনিসিটি হ্রাসের কারণে ডিএনএ স্ট্র্যান্ডের ডিপাসিং দ্বিতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির একটি বড় সমস্যা। ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং এবং অন্যান্য বেশ কয়েকটি তৃতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির জন্য, রিডগুলির সিঙ্ক্রোনাইজেশন অপ্রয়োজনীয় কারণ একবারে কেবল একটি অণু পড়া হচ্ছে। সংক্ষিপ্ত টার্নআরন্ড টাইমঃ ডি. এন. এ-র স্থানীয় টুকরোগুলি পড়ার ক্ষমতা জটিল টেমপ্লেট প্রস্তুতিকে পুরো জিনোম সিকোয়েন্সিংয়ের সাধারণ কর্মপ্রবাহের একটি অপ্রয়োজনীয় ধাপে পরিণত করে। ফলস্বরূপ, টার্নআরন্ড সময় কম হতে পারে। দুর্বলতা উচ্চ মূলধন খরচঃ ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য প্রয়োজনীয় পর্যাপ্ত রেজোলিউশন সহ একটি ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপের খরচ প্রায় মার্কিন ডলার 1,000,000, তাই এই পদ্ধতিতে ডিএনএ সিকোয়েন্সিং অনুসরণ করার জন্য যথেষ্ট বিনিয়োগের প্রয়োজন। প্রযুক্তিগতভাবে চ্যালেঞ্জিংঃ সিলেক্টিভ ভারী পরমাণু লেবেলিং এবং লেবেলযুক্ত ডিএনএকে একটি স্তরের সাথে সংযুক্ত করা এবং সোজা করা একটি গুরুতর প্রযুক্তিগত চ্যালেঞ্জ। উপরন্তু, ডি. এন. এ নমুনাটি ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপের উচ্চ ভ্যাকুয়াম এবং উচ্চ-শক্তির ইলেকট্রনগুলির একটি কেন্দ্রীভূত রশ্মি দ্বারা বিকিরণের জন্য স্থিতিশীল হওয়া উচিত। সম্ভাব্য পিসিআর পক্ষপাত এবং শিল্পকর্মঃ যদিও পিসিআর শুধুমাত্র ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং-এ ভারী পরমাণু বা ধাতু দিয়ে ডিএনএ স্ট্র্যান্ডকে লেবেল করার উপায় হিসাবে ব্যবহার করা হচ্ছে, তবে একক পরিবর্ধন চলাকালীন টেমপ্লেট উপস্থাপনা বা ত্রুটিতে পক্ষপাত প্রবর্তনের সম্ভাবনা থাকতে পারে। অন্যান্য সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির সাথে তুলনা অনেক অ-স্যাঞ্জার দ্বিতীয় এবং তৃতীয় প্রজন্মের ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি থ্রুপুট বৃদ্ধি এবং ব্যয় হ্রাস করার সাধারণ লক্ষ্য নিয়ে বর্তমানে তৈরি করা হয়েছে বা করা হচ্ছে যাতে ব্যক্তিগতকৃত জেনেটিক ওষুধ সম্পূর্ণরূপে উপলব্ধি করা যায়। এক্স প্রাইজ ফাউন্ডেশন (সান্তা মনিকা, সিএ, ইউএসএ) দ্বারা সমর্থিত জিনোমিক্সের জন্য 10 মিলিয়ন মার্কিন ডলারের আরকন এক্স পুরস্কার এবং ন্যাশনাল হিউম্যান জিনোম রিসার্চ ইনস্টিটিউট অফ ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ হেলথ (এনআইএইচ-এনএইচজিআরআই) দ্বারা সমর্থিত 70 মিলিয়ন মার্কিন ডলারের অনুদান পুরস্কার উভয়ই নতুন ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির বিকাশে গবেষণা কার্যক্রমের দ্রুত বিস্ফোরণকে উজ্জীবিত করছে। যেহেতু বিভিন্ন পদ্ধতি, কৌশল এবং কৌশলগুলি প্রতিটি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তিকে সংজ্ঞায়িত করে, তাই প্রত্যেকটির নিজস্ব শক্তি এবং দুর্বলতা রয়েছে। বিভিন্ন দ্বিতীয় এবং তৃতীয় প্রজন্মের ডিএনএ সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির মধ্যে গুরুত্বপূর্ণ পরামিতিগুলির তুলনা টেবিল 1-এ উপস্থাপন করা হয়েছে। তথ্যসূত্র ডিএনএ সিকোয়েন্সিং ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ল্যাবরেটরি কৌশল অণুজীববিজ্ঞান কৌশল আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল বৈজ্ঞানিক কৌশল