Massive parallel sequencing
ব্যাপক সমান্তরাল সিকোয়েন্সিং বা ব্যাপক সমান্তরাল সিকোয়েন্সিং হল ব্যাপক সমান্তরাল প্রক্রিয়াকরণের ধারণা ব্যবহার করে ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের বেশ কয়েকটি উচ্চ-থ্রুপুট পদ্ধতির যে কোনও একটি; এটিকে পরবর্তী প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং (এনজিএস) বা দ্বিতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিংও বলা হয়। এর মধ্যে কয়েকটি প্রযুক্তি 1993 থেকে 1998 সালের মধ্যে আবির্ভূত হয়েছিল এবং 2005 সাল থেকে বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ। এই প্রযুক্তিগুলি প্রতি যন্ত্র চালানোর জন্য 1 মিলিয়ন থেকে 43 বিলিয়ন শর্ট রিড (প্রতিটি 50 থেকে 400 বেস) সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য ক্ষুদ্রতর এবং সমান্তরাল প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করে। অনেক এনজিএস প্ল্যাটফর্ম ইঞ্জিনিয়ারিং কনফিগারেশন এবং সিকোয়েন্সিং রসায়নে ভিন্ন। তারা একটি প্রবাহ কোষে স্থানিকভাবে পৃথক, ক্লোনালি পরিবর্ধিত ডিএনএ টেমপ্লেট বা একক ডিএনএ অণুর মাধ্যমে বিশাল সমান্তরাল অনুক্রমের প্রযুক্তিগত দৃষ্টান্ত ভাগ করে নেয়। এই নকশাটি স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিংয়ের থেকে খুব আলাদা-যা ক্যাপিলারি সিকোয়েন্সিং বা প্রথম প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং নামেও পরিচিত-যা পৃথক সিকোয়েন্সিং প্রতিক্রিয়ায় উত্পাদিত চেইন-টার্মিনেশন পণ্যগুলির ইলেক্ট্রোফোরেটিক পৃথকীকরণের উপর ভিত্তি করে। এই পদ্ধতিটি ক্রমবিন্যাসকে বৃহত্তর মাত্রায় সম্পন্ন করার অনুমতি দেয়। বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ এন. জি. এস প্ল্যাটফর্মের সাথে এন. জি. এস প্ল্যাটফর্মের ডি. এন. এ সিকোয়েন্সিং সাধারণত নিম্নলিখিত ধাপগুলির সাথে পরিচালিত হয়। প্রথমত, ডিএনএ সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরিগুলি পিসিআর ইন ভিট্রো দ্বারা ক্লোনাল পরিবর্ধন দ্বারা তৈরি করা হয়। দ্বিতীয়ত, ডি. এন. এ সংশ্লেষণ দ্বারা ক্রমবদ্ধ করা হয়, যাতে ডি. এন. এ ক্রম শৃঙ্খল-সমাপ্তি রসায়নের পরিবর্তে পরিপূরক স্ট্র্যান্ডে নিউক্লিওটাইড যোগ করে নির্ধারিত হয়। তৃতীয়ত, স্থানগতভাবে বিচ্ছিন্ন, পরিবর্ধিত ডিএনএ টেমপ্লেটগুলি শারীরিক পৃথকীকরণের পদক্ষেপের প্রয়োজন ছাড়াই ব্যাপকভাবে সমান্তরাল পদ্ধতিতে একযোগে ক্রমবদ্ধ করা হয়। বেশিরভাগ এন. জি. এস প্ল্যাটফর্মে এই পদক্ষেপগুলি অনুসরণ করা হয়, তবে প্রতিটি একটি ভিন্ন কৌশল ব্যবহার করে। সিকোয়েন্সিং প্রতিক্রিয়াগুলির এন. জি. এস সমান্তরালকরণ একক যন্ত্র চালনায় নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্স রিডের গিগাবেসে শত শত মেগাবেস তৈরি করে। এর ফলে বায়োমেডিকাল সায়েন্সে উপলব্ধ সিকোয়েন্স ডেটা ব্যাপকভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে এবং জিনোম সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির মৌলিক পরিবর্তন ঘটেছে। নতুন উদীয়মান এন. জি. এস প্রযুক্তি এবং যন্ত্রগুলি জিনোম সিকোয়েন্সিং প্রতি 1000 মার্কিন ডলারের কাছাকাছি সিকোয়েন্সিং-এর খরচ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করতে অবদান রেখেছে। 2014 সালের হিসাবে, ব্যাপকভাবে সমান্তরাল সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্মগুলি বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ এবং তাদের বৈশিষ্ট্যগুলি টেবিলে সংক্ষিপ্ত করা হয়েছে। এন. জি. এস প্রযুক্তির গতি যত দ্রুত বাড়ছে, প্রযুক্তিগত বৈশিষ্ট্য এবং মূল্য পরিবর্তন হচ্ছে। একক-প্রান্ত সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য প্রতি রান-এ রান টাইম এবং গিগাবেজ (জিবি) আউটপুট উল্লেখ করা হয়েছে। পেয়ার-এন্ড সিকোয়েন্সিং করার সময় রান টাইম এবং আউটপুট প্রায় দ্বিগুণ হয়। ‡ রোচ 454 এবং হেলিকোস বায়োসাইন্সেস প্ল্যাটফর্মের গড় পঠন দৈর্ঘ্য। এন. জি. এস-এর জন্য টেমপ্লেট প্রস্তুতির পদ্ধতি এন. জি. এস প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য টেমপ্লেট প্রস্তুত করতে দুটি পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়ঃ একক ডি. এন. এ অণু থেকে উদ্ভূত পরিবর্ধিত টেমপ্লেট এবং একক ডি. এন. এ অণু টেমপ্লেট। যে ইমেজিং সিস্টেমগুলি একক ফ্লুরোসেন্স ঘটনাগুলি সনাক্ত করতে পারে না, তাদের জন্য ডিএনএ টেমপ্লেটগুলির পরিবর্ধন প্রয়োজন। তিনটি সর্বাধিক প্রচলিত পরিবর্ধন পদ্ধতি হল ইমালশন পিসিআর (ই. এম. পি. সি. আর), ঘূর্ণায়মান বৃত্ত এবং কঠিন-পর্যায় পরিবর্ধন। টেমপ্লেটগুলির চূড়ান্ত বিতরণ স্থানগতভাবে এলোমেলো বা একটি গ্রিডে হতে পারে। ইমালসন পিসিআর ইমালসন পিসিআর পদ্ধতিতে, একটি ডিএনএ লাইব্রেরি প্রথমে জিনোমিক ডিএনএর এলোমেলো খণ্ডের মাধ্যমে তৈরি করা হয়। একক-আটকে থাকা ডিএনএ টুকরোগুলি (টেমপ্লেট) অ্যাডাপ্টার বা লিঙ্কার সহ পুঁতির পৃষ্ঠের সাথে সংযুক্ত থাকে এবং একটি পুঁতি ডিএনএ লাইব্রেরি থেকে একক ডিএনএ খণ্ডের সাথে সংযুক্ত থাকে। পুঁতির পৃষ্ঠে অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রোব রয়েছে যার ক্রমগুলি ডিএনএ টুকরোগুলিকে আবদ্ধকারী অ্যাডাপ্টারের পরিপূরক। এরপর পুঁতিগুলিকে জল-তেলের ইমালসনের ফোঁটায় বিভক্ত করা হয়। জলীয় জল-তেল ইমালশনে, একটি পুঁতি ধারণকারী প্রতিটি ফোঁটাকে একটি পিসিআর মাইক্রোরিয়েক্টর বলা হয় যা একক ডিএনএ টেমপ্লেটের পরিবর্ধিত অনুলিপি তৈরি করে। গ্রিডযুক্ত ঘূর্ণায়মান বৃত্ত ন্যানোবল দ্রবণে ঘূর্ণায়মান বৃত্ত পরিবর্ধন দ্বারা একক ডিএনএ অণুর জনসংখ্যার সম্প্রসারণের পরে ডিএনএগুলির চেয়ে ছোট আকারের দাগগুলির গ্রিডে স্থির হওয়ার জন্য ধরা হয়। ডিএনএ কলোনি জেনারেশন (ব্রিজ এম্প্লিফিকেশন) ফরওয়ার্ড এবং রিভার্স প্রাইমারগুলি একটি ফ্লো সেলের স্লাইডে উচ্চ ঘনত্বে সমযোজীভাবে সংযুক্ত থাকে। সাপোর্টে থাকা টেমপ্লেটের সাথে প্রাইমারের অনুপাত পরিবর্ধিত গুচ্ছগুলির পৃষ্ঠের ঘনত্বকে সংজ্ঞায়িত করে। প্রবাহ কোষটি পলিমারেজ-ভিত্তিক সম্প্রসারণের জন্য বিকারকগুলির সংস্পর্শে আসে এবং পৃষ্ঠের একটি পরিপূরক অলিগোর সাথে একটি লিগযুক্ত খণ্ড "ব্রিজ"-এর মুক্ত/দূরবর্তী প্রান্ত হিসাবে প্রাইমিং ঘটে। পুনরাবৃত্ত বিকৃতি এবং সম্প্রসারণের ফলে প্রবাহ কোষের পৃষ্ঠ জুড়ে লক্ষ লক্ষ পৃথক স্থানে ডিএনএ টুকরোগুলির স্থানীয় পরিবর্ধন ঘটে। সলিড-ফেজ পরিবর্ধন 100-200 মিলিয়ন স্থানিকভাবে পৃথক টেমপ্লেট ক্লাস্টার তৈরি করে, যা মুক্ত প্রান্ত সরবরাহ করে যাতে একটি সর্বজনীন সিকোয়েন্সিং প্রাইমার তারপর সিকোয়েন্সিং প্রতিক্রিয়া শুরু করার জন্য সংকরিত হয়। এই প্রযুক্তিটি 1997 সালে গ্লাক্সো-ওয়েলকামের জেনেভা বায়োমেডিকাল রিসার্চ ইনস্টিটিউট (জিবিআরআই) থেকে পেটেন্টের জন্য পাস্কাল মায়ার, এরিক কাওয়াশিমা এবং লরেন্ট ফারিনেল্লি দ্বারা দায়ের করা হয়েছিল এবং 1998 সালে প্রথমবারের মতো প্রকাশ্যে উপস্থাপন করা হয়েছিল। 1994 সালে ক্রিস অ্যাডামস এবং স্টিভ ক্রন চার্চ এবং মিত্র দ্বারা 1997 সালে ক্লোনাল পরিবর্ধন জন্য অভিযোজিত "ব্রিজ পরিবর্ধন" নামে একটি অনুরূপ, কিন্তু অ-ক্লোনাল, পৃষ্ঠ পরিবর্ধন পদ্ধতির উপর একটি পেটেন্ট দায়ের করেন। ডিএনএ পরিবর্ধন প্রয়োজন এমন একক-অণু টেমপ্লেট প্রোটোকলগুলি প্রয়োগ করা প্রায়শই জটিল এবং সিকোয়েন্সিং ত্রুটিগুলি প্রবর্তন করতে পারে। একক-অণু টেমপ্লেট প্রস্তুত করা আরও সহজ এবং এর জন্য পিসিআর প্রয়োজন হয় না, যা পরিবর্ধিত টেমপ্লেটগুলিতে ত্রুটি প্রবর্তন করতে পারে। এটি-সমৃদ্ধ এবং জিসি-সমৃদ্ধ লক্ষ্য ক্রমগুলি প্রায়শই পরিবর্ধন পক্ষপাত দেখায়, যার ফলে জিনোম সারিবদ্ধকরণ এবং সমাবেশে তাদের কম প্রতিনিধিত্ব হয়। একক অণু টেমপ্লেটগুলি সাধারণত কমপক্ষে তিনটি ভিন্ন পদ্ধতির মধ্যে একটি ব্যবহার করে কঠিন সাপোর্টে স্থির করা হয়। প্রথম পদ্ধতিতে, স্থানিকভাবে বিতরণ করা পৃথক প্রাইমার অণুগুলি কঠিন সমর্থনের সাথে সমযোজীভাবে সংযুক্ত থাকে। টেমপ্লেট, যা এলোমেলোভাবে প্রারম্ভিক উপাদানটিকে ছোট আকারে বিভক্ত করে প্রস্তুত করা হয় (উদাহরণস্বরূপ, ~ 200-250 bp) এবং খণ্ডের প্রান্তে সাধারণ অ্যাডাপ্টার যুক্ত করে, তারপর স্থির প্রাইমারের সাথে সংকরিত করা হয়। দ্বিতীয় পদ্ধতিতে, স্থলীয়ভাবে বিতরণ করা একক-অণু টেমপ্লেটগুলি স্থির প্রাইমার থেকে একক-স্ট্র্যান্ডেড, একক-অণু টেমপ্লেটগুলিকে প্রাইমিং এবং প্রসারিত করে কঠিন সমর্থনের সাথে সমযোজীভাবে সংযুক্ত করা হয়। একটি সাধারণ প্রাইমার তারপর টেমপ্লেটে সংকরিত হয়। উভয় ক্ষেত্রেই, ডি. এন. এ পলিমারেজ এন. জি. এস প্রতিক্রিয়া শুরু করার জন্য স্থির প্রাইমড টেমপ্লেট কনফিগারেশনের সাথে আবদ্ধ হতে পারে। উপরের দুটি পদ্ধতিই হেলিকোস বায়োসাইন্সেস দ্বারা ব্যবহৃত হয়। তৃতীয় পদ্ধতিতে, স্থানিকভাবে বিতরণ করা একক পলিমারেজ অণুগুলি কঠিন সমর্থনের সাথে সংযুক্ত থাকে, যার সাথে একটি প্রাথমিক টেমপ্লেট অণু আবদ্ধ থাকে। এই পদ্ধতিটি প্যাসিফিক বায়োসাইন্সেস দ্বারা ব্যবহৃত হয়। বড় ডিএনএ অণুগুলি (হাজার হাজার বেস জোড়া পর্যন্ত) এই কৌশলটির সাথে ব্যবহার করা যেতে পারে এবং প্রথম দুটি পদ্ধতির বিপরীতে, তৃতীয় পদ্ধতিটি রিয়েল-টাইম পদ্ধতির সাথে ব্যবহার করা যেতে পারে, যার ফলে সম্ভাব্য দীর্ঘ পঠন দৈর্ঘ্য হয়। সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি সংশ্লেষণ দ্বারা সিকোয়েন্সিং সংশ্লেষণ (এসবিএস) দ্বারা সিকোয়েন্সিয়াল সিকোয়েন্সিংয়ের উদ্দেশ্য হল ডিএনএ পলিমারেজ দ্বারা একটি নিউক্লিওটাইডের অন্তর্ভুক্তি সনাক্ত করে ডিএনএ নমুনার সিকোয়েন্সিং নির্ধারণ করা। একটি ইঞ্জিনিয়ারড পলিমারেজ ডিএনএর একক স্ট্র্যান্ডের একটি অনুলিপি সংশ্লেষ করতে ব্যবহৃত হয় এবং প্রতিটি নিউক্লিওটাইডের অন্তর্ভুক্তি পর্যবেক্ষণ করা হয়। সংশ্লেষণ দ্বারা ক্রমবিন্যাসের নীতিটি 1993 সালে প্রথম বর্ণনা করা হয়েছিল এবং কিছু বছর পরে উন্নতি প্রকাশিত হয়েছিল। মূল অংশগুলি এস. বি. এস-এর সমস্ত রূপের জন্য অত্যন্ত অনুরূপ এবং এর মধ্যে রয়েছে (1) পরবর্তী সংকেত বাড়ানোর জন্য ডি. এন. এ-র পরিবর্ধন এবং একটি কঠিন সমর্থনের সাথে ক্রমবদ্ধ করার জন্য ডি. এন. এ সংযুক্ত করা, (2) কঠিন সমর্থনের উপর একক আটকে থাকা ডি. এন. এ প্রজন্ম, (3) একটি ইঞ্জিনিয়ারড পলিমারেজ ব্যবহার করে নিউক্লিওটাইডের অন্তর্ভুক্তি এবং (4) নিউক্লিওটাইডের সংযোজন সনাক্তকরণ। তারপর 3-4 ধাপ পুনরাবৃত্তি করা হয় এবং 4র্থ ধাপে প্রাপ্ত সংকেত থেকে ক্রমটি একত্রিত করা হয়। সিকোয়েন্সিং-বাই-সিন্থেসিসের এই নীতিটি 454, প্যাকবিও, আয়নটরেন্ট, ইলুমিনা এবং এমজিআই সহ প্রায় সমস্ত বিশাল সমান্তরাল সিকোয়েন্সিং যন্ত্রের জন্য ব্যবহৃত হয়েছে। পাইরোসেকুয়েন্সিং পাইরোসেকুয়েন্সিংয়ের নীতিটি প্রথম 1993 সালে বর্ণনা করা হয়েছিল একটি ইঞ্জিনিয়ারড ডিএনএ পলিমারেজের সাথে 3 'থেকে 5' এক্সোন্যুক্লিয়াস ক্রিয়াকলাপ (প্রুফ-রিডিং) এবং ফায়ারফ্লাই লুসিফেরেজ ব্যবহার করে লুমিনেসেন্স রিয়েল-টাইম সনাক্তকরণের অভাবের সাথে একটি কঠিন সমর্থনকে একত্রিত করে। সংশ্লেষণের মাধ্যমে সিকোয়েন্সিং-এর সমস্ত মূল ধারণাগুলি চালু করা হয়েছিল, যার মধ্যে রয়েছে (1) পরবর্তী সংকেত বাড়ানোর জন্য ডি. এন. এ-র পরিবর্ধন এবং একটি কঠিন সাপোর্টে সিকোয়েন্স (টেমপ্লেট) করার জন্য ডি. এন. এ সংযুক্ত করা, (2) কঠিন সাপোর্টে একক আটকে থাকা ডি. এন. এ তৈরি করা, (3) একটি ইঞ্জিনিয়ারড পলিমারেজ ব্যবহার করে নিউক্লিওটাইডগুলি অন্তর্ভুক্ত করা এবং (4) বাস্তব সময়ে আলো সনাক্তকরণের মাধ্যমে অন্তর্ভুক্ত নিউক্লিওটাইড সনাক্তকরণ। একটি ফলো-আপ নিবন্ধে, ধারণাটি আরও উন্নত করা হয়েছিল এবং 1998 সালে, একটি নিবন্ধ প্রকাশিত হয়েছিল যেখানে লেখকরা দেখিয়েছিলেন যে নন-ইনকর্পোরেটেড নিউক্লিওটাইডগুলি চতুর্থ এনজাইম (এপিরেজ) দিয়ে অপসারণ করা যেতে পারে যা সংশ্লেষণের মাধ্যমে সিকোয়েন্সিং করার অনুমতি দেয় অ-অন্তর্ভুক্ত নিউক্লিওটাইডগুলি ধুয়ে ফেলার প্রয়োজন ছাড়াই। বিপরীতমুখী টার্মিনেটর রসায়ন দ্বারা ক্রমবিন্যাস এই পদ্ধতিটি একটি চক্রাকার পদ্ধতিতে বিপরীতমুখী টার্মিনেটর-আবদ্ধ ডিএনটিপি ব্যবহার করে যা নিউক্লিওটাইড সংযোজন, ফ্লুরোসেন্স ইমেজিং এবং ক্লিভেজ নিয়ে গঠিত। প্রতিটি ডিএনটিপি যোগ করার সাথে সাথে একটি ফ্লুরোসেন্টলি-লেবেলযুক্ত টার্মিনেটর চিত্রায়িত করা হয় এবং তারপরে পরবর্তী বেসকে অন্তর্ভুক্ত করার অনুমতি দেওয়ার জন্য বিভক্ত করা হয়। এই নিউক্লিওটাইডগুলি রাসায়নিকভাবে এমনভাবে অবরুদ্ধ থাকে যে প্রতিটি সংযোজন একটি অনন্য ঘটনা। একটি ইমেজিং ধাপ প্রতিটি বেস অন্তর্ভুক্তি ধাপ অনুসরণ করে, তারপর ডিএনএ পলিমারেজ দ্বারা পরবর্তী সংযোজনের জন্য প্রতিটি স্ট্র্যান্ড প্রস্তুত করতে অবরুদ্ধ গ্রুপটি রাসায়নিকভাবে অপসারণ করা হয়। ব্যবহারকারী-সংজ্ঞায়িত যন্ত্রের সেটিংস দ্বারা নির্ধারিত নির্দিষ্ট সংখ্যক চক্রের জন্য এই ধাপের সিরিজটি অব্যাহত থাকে। 3 'ব্লকিং গ্রুপগুলি মূলত এনজাইম্যাটিক বা রাসায়নিক বিপরীত হিসাবে বিবেচিত হয়েছিল রাসায়নিক পদ্ধতিটি সোলেক্সা এবং ইলুমিনা মেশিনের ভিত্তি হয়ে দাঁড়িয়েছে। বিপরীতমুখী টার্মিনেটর রসায়ন দ্বারা ক্রমবিন্যাস একটি চার রঙের চক্র হতে পারে যেমন ইলুমিনা/সোলেক্সা দ্বারা ব্যবহৃত হয়, অথবা একটি এক রঙের চক্র যেমন হেলিকোস বায়োসাইন্সেস দ্বারা ব্যবহৃত হয়। হেলিকোস বায়োসায়েন্সেস "ভার্চ্যুয়াল টার্মিনেটর" ব্যবহার করেছে, যা একটি দ্বিতীয় নিউক্লিওসাইড অ্যানালগ সহ অবরুদ্ধ টার্মিনেটর যা একটি প্রতিরোধক হিসাবে কাজ করে। এই টার্মিনেটরগুলিতে গোষ্ঠীগুলিকে সমাপ্ত বা বাধা দেওয়ার জন্য উপযুক্ত পরিবর্তন রয়েছে যাতে একক বেস সংযোজনের পরে ডিএনএ সংশ্লেষণ বন্ধ করা হয়। লিগাজ এনজাইম দ্বারা মধ্যস্থতা করা সিকোয়েন্সিং-বাই-লাইগেশন এই পদ্ধতিতে, সিকোয়েন্স এক্সটেনশন প্রতিক্রিয়া পলিমারেজ দ্বারা পরিচালিত হয় না বরং ডিএনএ লিগাজ এবং এক-বেস-এনকোডেড প্রোব বা দুই-বেস-এনকোডেড প্রোব দ্বারা পরিচালিত হয়। তার সহজতম আকারে, একটি ফ্লুরোসেন্ট লেবেলযুক্ত প্রোব প্রাথমিক টেমপ্লেটের সংলগ্ন তার পরিপূরক ক্রমে সংকরিত হয়। তারপর ডি. এন. এ লিগাজ যোগ করা হয় প্রাইমারে ডাই-লেবেলযুক্ত প্রোবে যোগ দেওয়ার জন্য। নন-লিগটেড প্রোবগুলি ধুয়ে ফেলা হয়, তারপরে লিগটেড প্রোবের পরিচয় নির্ধারণের জন্য ফ্লুরোসেন্স ইমেজিং করা হয়। ফ্লোরসেন্ট ডাই অপসারণের জন্য ক্লিভেবল প্রোব ব্যবহার করে চক্রটি পুনরাবৃত্তি করা যেতে পারে এবং পরবর্তী লাইগেশন চক্রের জন্য একটি 5′-পিও4 গ্রুপ পুনরুজ্জীবিত করা যেতে পারে (চেইনড লাইগেশন) অথবা টেমপ্লেটে একটি নতুন প্রাইমার অপসারণ এবং সংকরকরণ করে (আনচেইনড লাইগেশন)। ফসফোলিঙ্কড ফ্লুরোসেন্ট নিউক্লিওটাইড বা রিয়েল-টাইম সিকোয়েন্সিং প্যাসিফিক বায়োসাইন্সেস বর্তমানে এই পদ্ধতির নেতৃত্ব দিচ্ছে। রিয়েল-টাইম সিকোয়েন্সিং পদ্ধতিতে ডিএনএ সংশ্লেষণের সময় ডাই-লেবেলযুক্ত নিউক্লিওটাইডগুলির অবিচ্ছিন্ন অন্তর্ভুক্তি ইমেজিং জড়িত থাকেঃ একক ডিএনএ পলিমারেজ অণুগুলি পৃথক শূন্য-মোড ওয়েভগাইড ডিটেক্টরের (জেডএমডাব্লু ডিটেক্টর) নীচের পৃষ্ঠের সাথে সংযুক্ত থাকে যা ক্রমের তথ্য পেতে পারে যখন ফসফোলিংকযুক্ত নিউক্লিওটাইডগুলি ক্রমবর্ধমান প্রাইমার স্ট্র্যান্ডে অন্তর্ভুক্ত করা হচ্ছে। প্যাসিফিক বায়োসাইন্সেস একটি অনন্য ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে যা ফসফোলিঙ্কযুক্ত নিউক্লিওটাইডগুলিকে আরও ভালভাবে অন্তর্ভুক্ত করে এবং বদ্ধ বৃত্তাকার টেমপ্লেটগুলির সিকোয়েন্সিং সক্ষম করে। একক-পঠন নির্ভুলতা 87 শতাংশ হলেও, বহু-কিলোবেস পঠন দৈর্ঘ্যের সাথে সর্বসম্মত নির্ভুলতা 99.999 শতাংশে প্রদর্শিত হয়েছে। 2015 সালে, প্যাসিফিক বায়োসাইন্সেস সিক্যুয়েল সিস্টেম নামে একটি নতুন সিকোয়েন্সিং যন্ত্র প্রকাশ করেছে, যা প্রায় 6.5-fold ক্ষমতা বৃদ্ধি করে। আরও দেখুন ক্লিনিকাল মেটাজেনমিক সিকোয়েন্সিং প্রথম প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং তৃতীয় প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং আরএনএ ভেলোসিটি রেফারেন্স ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি