Primer walking
প্রাইমার ওয়াকিং হল একটি কৌশল যা একটি জিনকে (যেমন, রোগ জিন) তার পরিচিত নিকটতম চিহ্নিতকারী (যেমন, পরিচিত জিন) থেকে ক্লোন করতে ব্যবহৃত হয়। ফলস্বরূপ, এটি উদ্ভিদ, ছত্রাক এবং স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মধ্যে ছোটখাটো পরিবর্তন সহ ক্লোনিং এবং সিকোয়েন্সিং প্রচেষ্টায় নিযুক্ত করা হয়। এই কৌশলটি, যা "নির্দেশিত সিকোয়েন্সিং" নামেও পরিচিত, রেফারেন্স সিকোয়েন্সের (সিকোয়েন্স কনফার্মেশন সার্ভিস) উপর ভিত্তি করে একটি পরিচিত প্লাজমিড বা পিসিআর পণ্যের রেফারেন্স সিকোয়েন্স নিশ্চিত করতে বা ওভারল্যাপিং বিভাগগুলির (সিকোয়েন্স ডিসকভারি সার্ভিস) সিকোয়েন্সের জন্য প্রাইমার ডিজাইন করে একটি পূর্ণ প্লাজমিড বা পিসিআর পণ্যের অজানা সিকোয়েন্স আবিষ্কার করতে স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং প্রতিক্রিয়াগুলির একটি সিরিজ নিয়োগ করে। প্রাইমার ওয়াকিংঃ একটি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি প্রাইমার ওয়াকিং হল 1.3-7.0 কেবি পরিসীমা পর্যন্ত ডিএনএর সিকোয়েন্স নির্ধারণ করার একটি পদ্ধতি যেখানে ক্রোমোজোম ওয়াকিং জিনের ইতিমধ্যে পরিচিত সিকোয়েন্সের ক্লোন তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়। চেইন টার্মিনেশন পদ্ধতি ব্যবহার করে খুব দীর্ঘ টুকরোগুলি একক ক্রমে পড়া যায় না। এই পদ্ধতিটি দীর্ঘ ক্রমকে পরপর কয়েকটি ছোট ক্রমে ভাগ করে কাজ করে। আগ্রহের ডিএনএ হতে পারে একটি প্লাজমিড সন্নিবেশ, একটি পিসিআর পণ্য বা একটি জিনোম সিকোয়েন্স করার সময় একটি ফাঁক প্রতিনিধিত্বকারী একটি খণ্ড। "প্রাইমার ওয়াকিং" শব্দটি ব্যবহার করা হয় যেখানে মূল লক্ষ্য হল জিনোম সিকোয়েন্স করা। "ক্রোমোজোম ওয়াকিং" শব্দটি ব্যবহার করা হয় যখন ক্রমটি জানা যায় কিন্তু কোনও জিনের ক্লোন থাকে না। উদাহরণস্বরূপ, একটি রোগের জিন একটি নির্দিষ্ট চিহ্নিতকারী যেমন একটি আর. এফ. এল. পি-র কাছাকাছি অবস্থিত হতে পারে। ক্রোমোজোম হাঁটা একটি কৌশল যা পরিচিত নিকটতম চিহ্নিতকারী (যেমন, পরিচিত জিন) থেকে একটি জিন (যেমন, রোগ জিন) ক্লোন করতে ব্যবহৃত হয় এবং তাই উদ্ভিদ, ছত্রাক এবং প্রাণীদের ক্লোনিং এবং সিকোয়েন্সিং প্রকল্পে মাঝারি পরিবর্তনে ব্যবহৃত হয়। অন্যভাবে বলতে গেলে, এটি ম্যাপ করার জন্য জিনের কাছাকাছি বিদ্যমান একটি নির্দিষ্ট ক্রম খুঁজে বের করতে, পৃথক করতে এবং ক্লোন করতে ব্যবহৃত হয়। বড় টুকরোগুলির গ্রন্থাগার, প্রধানত ব্যাকটেরিয়ার কৃত্রিম ক্রোমোজোম গ্রন্থাগার, বেশিরভাগ জিনোমিক প্রকল্পে ব্যবহৃত হয়। কাঙ্ক্ষিত উপনিবেশ সনাক্ত করতে এবং একটি নির্দিষ্ট ক্লোন নির্বাচন করতে গ্রন্থাগারটি প্রথমে একটি কাঙ্ক্ষিত প্রোব দিয়ে পরীক্ষা করা হয়। স্ক্রিনিংয়ের পরে, ক্লোনটি প্রোবের সাথে ওভারল্যাপ করা হয় এবং ওভারল্যাপিং টুকরোগুলি ম্যাপ করা হয়। এই টুকরোগুলি তখন অন্যান্য ক্লোনগুলি সনাক্ত করার জন্য একটি নতুন অনুসন্ধান (ক্লোনগুলির 3′ বা 5′ প্রান্ত থেকে প্রাপ্ত ছোট ডিএনএ টুকরোগুলি) হিসাবে ব্যবহৃত হয়। একটি লাইব্রেরিতে প্রায় 96টি ক্লোন থাকে এবং প্রতিটি ক্লোনে আলাদা আলাদা সন্নিবেশ থাকে। প্রোব ওয়ান λ1 এবং λ2 চিহ্নিত করে কারণ এটি তাদের ওভারল্যাপ করে। λ2 ক্লোন থেকে উদ্ভূত প্রোব টু λ3 ইত্যাদি সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়। ক্লোনগুলির অভিমুখীকরণ ক্লোনগুলির সীমাবদ্ধতা ম্যাপিং দ্বারা নির্ধারিত হয়। এইভাবে, একটি জিনের আশেপাশে উপস্থিত নতুন ক্রোমোজোম অঞ্চলগুলি সনাক্ত করা যেতে পারে। ক্রোমোজোম হাঁটা সময়সাপেক্ষ, এবং ক্রোমোজোম অবতরণ জিন সনাক্তকরণের জন্য পছন্দের পদ্ধতি। এই পদ্ধতিতে একটি চিহ্নিতকারী আবিষ্কারের প্রয়োজন হয় যা মিউট্যান্ট লোকাসের সাথে দৃঢ়ভাবে সম্পর্কিত। টুকরোটি প্রথমে এমনভাবে সাজানো হয় যেন এটি একটি ছোট টুকরো। সর্বজনীন প্রাইমার বা বিশেষভাবে পরিকল্পিত ব্যবহার করে প্রতিটি প্রান্ত থেকে ক্রমবিন্যাস করা হয়। এটি প্রথম 1000 বা তার বেশি ভিত্তি চিহ্নিত করা উচিত। আগ্রহের অঞ্চলটিকে সম্পূর্ণরূপে সিকোয়েন্স করার জন্য, নতুন প্রাইমারগুলির নকশা এবং সংশ্লেষণ (পরিচিত সিকোয়েন্সের চূড়ান্ত 20 টি বেসের পরিপূরক) সংলগ্ন সিকোয়েন্স তথ্য পাওয়ার জন্য প্রয়োজনীয়। প্রাইমার ওয়াকিং বনাম শটগান সিকোয়েন্সিং প্রাইমার ওয়াকিং নির্দেশিত সিকোয়েন্সিংয়ের একটি উদাহরণ কারণ প্রাইমারটি একটি নির্দিষ্ট দিকে সিকোয়েন্সিংকে গাইড করার জন্য ডিএনএর একটি পরিচিত অঞ্চল থেকে ডিজাইন করা হয়েছে। নির্দেশিত সিকোয়েন্সিংয়ের বিপরীতে, ডি. এন. এ-র শটগান সিকোয়েন্সিং আরও দ্রুত সিকোয়েন্সিং কৌশল। জিনোম সিকোয়েন্সিংয়ের "পুরনো সময়" থেকে একটি কৌশল রয়েছে। সিকোয়েন্সিংয়ের অন্তর্নিহিত পদ্ধতি হল স্যাঙ্গার চেইন টার্মিনেশন পদ্ধতি যা 100 থেকে 1000 বেসপেয়ারের মধ্যে পড়তে পারে (ব্যবহৃত যন্ত্রের উপর নির্ভর করে)। এর অর্থ হল আপনাকে দীর্ঘ ডিএনএ অণুগুলি ভেঙে ক্লোন করতে হবে এবং পরবর্তীকালে সেগুলির ক্রম নির্ধারণ করতে হবে। দুটি পদ্ধতি সম্ভব। প্রথমটিকে ক্রোমোজোম (বা প্রাইমার) হাঁটা বলা হয় এবং প্রথম টুকরোটি সিকোয়েন্সিং দিয়ে শুরু হয়। ক্রমের পরবর্তী (সংলগ্ন) অংশটি তারপর একটি প্রাইমার ব্যবহার করে ক্রমবদ্ধ করা হয় যা প্রথম ক্রমের শেষের পরিপূরক ইত্যাদি। এই কৌশলটির জন্য খুব বেশি সমাবেশের প্রয়োজন হয় না, তবে আপনার প্রচুর প্রাইমার প্রয়োজন এবং এটি তুলনামূলকভাবে ধীর। এই সমস্যা কাটিয়ে ওঠার জন্য শটগান সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি তৈরি করা হয়েছিল। এখানে ডি. এন. এ বিভিন্ন অংশে বিভক্ত করা হয় (সবগুলি একই জায়গায় ভাঙা হয় না), ক্লোন করা হয় এবং ক্লোনিংয়ের জন্য ব্যবহৃত ভেক্টরের জন্য নির্দিষ্ট প্রাইমার দিয়ে সিকোয়েন্স করা হয়। এটি ওভারল্যাপিং সিকোয়েন্সের দিকে পরিচালিত করে যা পরে কম্পিউটারে একটি ক্রমে একত্রিত করতে হয়। এই পদ্ধতিটি সিকোয়েন্সিংয়ের সমান্তরালকরণের অনুমতি দেয় (আপনি একই সময়ে প্রচুর সিকোয়েন্সিং প্রতিক্রিয়া প্রস্তুত করতে পারেন এবং সেগুলি চালাতে পারেন) যা প্রক্রিয়াটিকে আরও দ্রুত করে তোলে এবং সিকোয়েন্স নির্দিষ্ট প্রাইমারের প্রয়োজনীয়তাও এড়ায়। চ্যালেঞ্জটি হল তাদের ক্রমে ক্রমগুলি সংগঠিত করা, কারণ এখানে ওভারল্যাপগুলি ততটা স্পষ্ট নয়। এই সমস্যা সমাধানের জন্য, প্রথমে একটি খসড়া তৈরি করা হয় এবং তারপর প্রাইমার ওয়াকিংয়ের মতো অন্যান্য কৌশল ব্যবহার করে সমালোচনামূলক অঞ্চলগুলিকে ক্রমবদ্ধ করা হয়। প্রক্রিয়া সামগ্রিক প্রক্রিয়াটি নিম্নরূপঃ একটি প্রাইমার যা ডি. এন. এ-র শুরুর সাথে অনুক্রমের মিল রাখে তা প্রাইমার দিয়ে শুরু করে অজানা ক্রমের সংলগ্ন একটি ছোট ডি. এন. এ স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষ করতে ব্যবহৃত হয় (পি. সি. আর দেখুন)। নতুন ছোট ডিএনএ স্ট্র্যান্ডটি চেইন টার্মিনেশন পদ্ধতি ব্যবহার করে সিকোয়েন্স করা হয়। সিকোয়েন্সড স্ট্র্যান্ডের শেষটি দীর্ঘ ডিএনএ সিকোয়েন্সের পরবর্তী অংশের জন্য প্রাইমার হিসাবে ব্যবহৃত হয়, তাই শব্দটি "ওয়াকিং"। পদ্ধতিটি পুরো ক্রোমোজোমের ক্রমবিন্যাস করতে ব্যবহার করা যেতে পারে (তাই "ক্রোমোজোম ওয়াকিং")। প্রাইমার ওয়াকিং শটগান সিকোয়েন্সিংয়ের বিকাশের ভিত্তি ছিল, যা বিশেষভাবে নির্বাচিতগুলির পরিবর্তে এলোমেলো প্রাইমার ব্যবহার করে। আরও দেখুন ক্রোমোজোম জাম্পিং ক্রোমোজোম ল্যান্ডিং শটগান সিকোয়েন্সিং-একটি বিকল্প পদ্ধতি, যা ধারাবাহিকভাবে সাব-স্ট্র্যান্ডের পরিবর্তে এলোমেলোভাবে ব্যবহার করে। তথ্যসূত্র ডি. এন. এ আণবিক জীববিজ্ঞান